Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un Ex-ovo Enfoque electroporación
2 de noviembre de 2015
Cultivos de células de la retina de embriones de pollo constituyen herramientas valiosas para el estudio de la biología de los fotorreceptores. Hemos desarrollado una técnica de transferencia de genes eficiente, basado en ex ovo plásmido electroporación de las retinas antes del cultivo. Esta técnica aumenta considerablemente la eficiencia de transfección a través de protocolos disponibles en la actualidad, lo que hace posible la manipulación genética para este sistema.
El objetivo general de este procedimiento es lograr una transfección de plásmidos de alta eficiencia de las células de la retina para permitir estudios genéticos funcionales en cultivos primarios de retina. Esto se logra recolectando primero embriones de pollo en la etapa 27 del sistema de hamburguesas y Hamilton. La puesta en escena adecuada es fundamental para lograr una eficiencia óptima.
El segundo paso es diseccionar los ojos embrionarios y extirpar el epitelio pigmentado de la retina que expone la retina neural. A continuación, la copa de la retina se coloca en una cámara llena de solución plásmida. A continuación, se somete a electroporación en condiciones optimizadas utilizando electrodos hechos a medida de fácil construcción.
Los pasos finales son extirpar el cuerpo vítreo y el cristalino y disociar la retina neural a células individuales para el cultivo primario de baja densidad. En última instancia, las células transfectadas se pueden visualizar mediante la expresión de genes reporteros o inmunohistoquímica, y la manipulación genética efectiva se puede evaluar mediante la evaluación de la expresión de genes posteriores o cambios celulares fenotípicos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la lipofección o la transfección química, es que aumenta la tasa de transfección de las células de la retina en cinco veces, lo que produce eficiencias del 22 al 25% de la población celular total.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de los fotorreceptores, ya que permite la manipulación de la expresión génica en cultivos primarios de retina a un nivel de eficiencia que puede proporcionar información biológicamente significativa. Las implicaciones de esta técnica van más allá de la investigación básica, ya que pueden adaptarse fácilmente a tecnologías de alto rendimiento para el desarrollo de fármacos. Comience incubando huevos de gallina de cuerno de pata blanca fertilizados a 37,5 grados centígrados y 60% de humedad relativa durante cinco días en una incubadora de huevos.
Antes del experimento, obtenga un filamento de caja que normalmente se usa en micro tirones de pipetas. Usa pinzas para deshacer la caja cuadrada y endereza el filamento en una tira larga. Luego, usando una regla como guía, doble el filamento en forma de U cuadrada, de tres milímetros de largo en la base y dos milímetros de alto en un lado con el otro lado, la longitud restante del filamento use pinzas para sumergir el electrodo en etanol al 96% y flamee brevemente el electrodo para esterilizarlo.
A continuación, conecte un cable eléctrico con una pequeña pinza de cocodrilo al brazo largo del electrodo. A continuación, limpie el electrodo grueso con punta de oro con etanol al 70%. A continuación, prepare la cámara de electroporación cortando la tapa de un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros con unas tijeras esterilizadas y fijándolo con el lado plano hacia abajo a una placa de Petri de 100 milímetros con cinta adhesiva.
A continuación, esterilice las herramientas de microdisección sumergiendo las puntas de los instrumentos en etanol al 96% y flameándolas brevemente. Además, limpie el visor de disección con etanol al 70%. Caliente una botella de solución salina estéril sin calcio y magnesio de Hanks en un baño de agua a 37 grados centígrados.
Una vez caliente, úselo para llenar una placa de Petri estéril de 100 milímetros hasta tres cuartas partes de su capacidad. A continuación, coloque la cámara de electroporación bajo un microscopio de disección limpio. Luego conecte los electrodos al aparato de electroporación, asegurándose de que el electrodo hecho a medida esté conectado al polo negativo y que el electrodo con punta de oro esté conectado al polo positivo de la máquina.
Limpie los huevos limpiando el exterior de las cáscaras con etanol al 70%. Sé precavido y mantén la esterilidad durante el resto del protocolo. Para evitar llevar la contaminación a los cultivos con pinzas Maloney grandes y curvas, abra con cuidado un orificio en la cáscara del huevo golpeando suavemente la punta redondeada de un huevo directamente sobre la cámara de aire.
Saca todas las piezas de la concha con otro par de pinzas. Retire las membranas y recoja el embrión sacándolo con cuidado del óvulo. Coloque el embrión en una placa de Petri con la solución salina Hanks Balance precalentada sin calcio y magnesio.
Cuando se haya recolectado un número adecuado de embriones, asegúrese de que todos estén en la etapa correcta. De acuerdo con el sistema de estadificación de hamburguesas y Hamilton para una eficiencia óptima, los embriones deben estar en la etapa 27. Sacrificar los embriones por decapitación con pinzas de Maloney, y luego usar pinzas Dumont para cuidar y nuclear los ojos.
Transfiera los ojos a una nueva placa de Petri con HBSS libre de calcio y magnesio. Comience en la parte posterior de cada ojo, cerca de la cabeza del nervio óptico, y luego introduzca una punta de cada par de pinzas Dumont entre la retina neural y el epitelio pigmentado de la retina. Trabajando desde la parte posterior del ojo hacia el frente, use las pinzas para diseccionar cuidadosamente el epitelio pigmentado de la retina.
Tener cuidado de no dañar la retina neural. Configure el electro perter para entregar cinco pulsos cuadrados de 15 voltios con una duración de 50 milisegundos y un intervalo de 950 milisegundos. A continuación, llene la cámara de electroporación con 120 microlitros de solución de plásmido a una concentración de 1,5 microgramos por microlitro en PBS.
A continuación, coloque el electrodo negativo en forma de U dentro de la cámara de electroporación de la tapa de la microcentrífuga. Usando un par de pinzas dumont curvas. Transfiera una copa de retina a la cámara de electroporación y colóquela dentro del electrodo en forma de U.
Coloque la retina de modo que la parte posterior de la misma quede hacia la parte inferior del electrodo y el cristalino mire hacia arriba. A continuación, coloque el ánodo de forma que toque la parte anterior del ojo junto al cristalino. A continuación, utiliza el pedal del electro raider para emitir cinco pulsos eléctricos.
Cuando termine, transfiera la copa de retina electroporada a una nueva placa de Petri llena de HBSS libre de calcio y magnesio. Repita el procedimiento de electroporación con cada copa de retina adicional. Se pueden electroporar hasta seis copas retinianas con la misma solución de plásmido sin una disminución significativa en la eficiencia de la transfección.
A continuación, utilice pinzas dentadas adheridas para extraer suavemente el cristalino y el cuerpo vítreo de cada muestra electroporada mientras mantiene el ojo en su lugar con la parte posterior de las pinzas dumont curvas una vez retiradas, proceda a la disociación y cultivo de las células de la retina electroporadas utilizando técnicas estándar. Las células de la retina que se muestran aquí fueron electroporadas con expresión de GFP, plásmido, disociadas y cultivadas durante cuatro días. Las micrografías fluorescentes mostraron núcleos de tinción y células de la retina que expresaban GFP.
Se realizó tinción de anticuerpos anti visina para identificar las células fotorreceptoras. Los parámetros descritos en este protocolo han sido optimizados para obtener eficiencias de transfectura que promedian el 22% en comparación con la población total después de cuatro días. En cultivo, esta medida aumenta a un promedio del 25% de eficiencia cuando solo se considera que la población de fotorreceptores se considera una vez dominada.
Esta técnica, desde la recolección de embriones hasta la electrooperación, se puede realizar en menos de 30 minutos para seis ojos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no deben pasar más de tres horas entre la recolección de los embriones y la siembra de células disociadas para obtener un cultivo de buena calidad. Esta técnica se puede aplicar a la sobreexpresión o correlación de genes, por ejemplo, utilizando un sistema de ARNi.
Además, la retina que ha sido transfectada siguiendo este procedimiento se puede utilizar para cultivos de retina organotípicos.
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Descripción general
Este artículo presenta una técnica novedosa para la transferencia génica de alta eficiencia en cultivos celulares de retina de embrión de pollo, mejorando el estudio de la biología de los fotorreceptores. El método implica la electrotransferencia de plásmidos ex ovo, mejorando significativamente las tasas de transfección en comparación con los protocolos existentes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Ingeniería genética
Antecedentes
- Los cultivos de células retinianas de pollo embrionario son importantes para la investigación de fotorreceptores.
- Las técnicas de transferencia génica son esenciales para estudios funcionales en estas células.
- Los métodos actuales tienen limitaciones en la eficiencia de transfección.
- La optimización de las etapas y las condiciones de electrotransferencia puede mejorar los resultados.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable de transferencia génica para células retinianas.
- Permitir estudios genéticos funcionales en cultivos primarios de retina.
- Mejorar las eficiencias de transfección respecto a los protocolos existentes.
Métodos Utilizados
- Recolección de embriones de pollo en la etapa 27 del sistema de Hamburger y Hamilton.
- Diseción de los ojos embrionarios y eliminación del epitelio pigmentado retiniano.
- Colocación de la copa retiniana en una cámara con solución de plásmido.
- Aplicación de la electro poración utilizando electrodos hechos a medida en condiciones optimizadas.
Resultados principales
- Alta eficiencia de transfección lograda mediante el nuevo método.
- Manipulación genética exitosa de células retinianas demostrada.
- Se establecieron condiciones optimizadas para la electroforesis.
- La técnica es aplicable para diversos estudios funcionales en biología retiniana.
Conclusiones
- La técnica de transferencia génica desarrollada mejora significativamente las capacidades de investigación en biología celular retiniana.
- Este método puede facilitar estudios avanzados sobre la función de los fotorreceptores.
- Las aplicaciones futuras podrían incluir la exploración de factores genéticos en enfermedades retinianas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La transferencia eficiente de genes en cultivos retinianos primarios aborda un cuello de botella crítico en la validación de dianas en fotorreceptores, permitiendo la interrogación funcional de genes relevantes para la enfermedad. El método de electroporación ex ovo alcanza una eficiencia de transfección del 22-25 %, lo que favorece el desarrollo de ensayos escalables para la selección de alto rendimiento de terapéuticos retinianos. Este enfoque mejora la confianza predictiva en la identificación de compuestos prometedores al proporcionar información biológicamente relevante sobre la función génica dentro de un sistema relevante para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la sobreexpresión mediada por plásmidos o el silenciamiento mediado por ARNi en cultivos primarios de fotorreceptores.
- Valor operativo: Proporciona un sistema reproducible para la validación funcional de objetivos con expresión cuantificable de transgenes en hasta el 25 % de la población de fotorreceptores.
- Valor estratégico: Brinda confianza predictiva en la selección de objetivos al vincular la manipulación genética con cambios fenotípicos en las células o con la expresión génica downstream.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera eficiencias de transfección adecuadas para mediciones cuantitativas de variables dependientes en campañas de cribado de compuestos.
- Valor operativo: Utiliza condiciones estandarizadas de electrotransferencia y electrodos personalizados para garantizar la reproducibilidad del ensayo en múltiples copas retinianas.
- Valor estratégico: Permite la reutilización de la plataforma para adaptación de alto rendimiento, ya que las culturas retinianas transfectadas pueden integrarse en flujos de trabajo de cultivos primarios de baja densidad u organotípicos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al permitir la manipulación genética en un sistema relevante para la enfermedad que modela la biología retiniana humana.
- Valor operativo: Mantiene la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante procedimientos consistentes de cultivo y disociación.
- Valor estratégico: Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo al permitir la evaluación de la función génica antes de los estudios in vivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, apoyando la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en la biología de los fotorreceptores.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante la sobreexpresión o la inhibición de genes diana en cultivos primarios de retina.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante una concentración estandarizada de la solución de plásmido (1,5 µg/µL) y parámetros optimizados de electrotransferencia (5 pulsos, 15 V, 50 ms).
- Análisis: Ofrece lecturas cuantitativas mediante la expresión de genes reporteros (por ejemplo, GFP) o inmunohistoquímica para comparar la eficiencia de transfección entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica gracias a su aplicabilidad en cultivos retinianos organotípicos derivados de retinas electrotransferidas.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable, ya que hasta seis copas retinianas pueden ser electrotransferidas con la misma solución de plásmido sin pérdida significativa de eficiencia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al alcanzar tasas de transfección cinco veces más altas que con lipofección o métodos químicos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización mediante protocolos detallados de construcción y esterilización de electrodos utilizando la flama de etanol al 96 %.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir el ruido biológico en estudios funcionales, permitiendo mejores decisiones de avance o interrupción.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos funcionales sobre el papel del gen en la supervivencia o diferenciación de los fotorreceptores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la determinación de la etapa embrionaria del embrión de pollo (etapa 27 de Hamburger y Hamilton) y en técnicas de disección microquirúrgica.
- Necesita instrumentación para la administración de electroporación mediante cinco pulsos cuadrados y la preparación de electrodos personalizados en forma de U a partir de filamento de caja.
- Exige una estandarización entre los equipos en la preparación de la solución de plásmido (basada en PBS, 1,5 µg/µL) y en el montaje de la cámara utilizando tubos microcentrífugos modificados.
- Implica consideraciones de adaptación para distintas concentraciones de plásmido o constructos de ARNi al escalar hacia estudios de inhibición.
- Incluye limitaciones prácticas, como la ventana de tres horas entre la recolección del embrión y el siembra celular para mantener la calidad del cultivo.
