Medición anafilaxia local en ratones

El objetivo general de este procedimiento es medir los cambios en la permeabilidad vascular, para cuantificar las respuestas alérgicas localizadas. Esto se logra sensibilizando primero a los animales a un alérgeno, como la albúmina O. El segundo paso es desafiar los oídos con una inyección intradérmica del alérgeno.

Luego, el tinte azul de Evan se inyecta en la vena de la cola. El paso final es extraer el tinte de las orejas desafiadas incubándolas durante la noche. En la forma, la amida se utiliza en última instancia fotometría espectrospectral para cuantificar la cantidad de tinte que entró en el oído.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que la extravasación del tinte se mide por espectrometría. Esto significa que el ensayo no se somete fácilmente al sesgo del observador. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las inyecciones intradérmicas y de venas de cola son técnicamente desafiantes y requieren mucha práctica para lograr la competencia.

Comience por llevar una alícuota de solución madre de óvulos a temperatura ambiente para su uso. Cuando esté a temperatura ambiente, diluya el caldo de óvulos a una concentración de un miligramo por mililitro en un XPBS. Usa un tubo de poliestireno de cinco mililitros de fondo redondo.

Agite el tubo a velocidad media, y agregue con cuidado un volumen igual de completamente homogeneizado. Inyecte alumbre en la solución de óvulos gota a gota. Paralelamente, prepare una solución de control negativo de alumbre mezclado con PBS en una proporción de uno a uno utilizando la misma técnica.

A continuación, tapa los tubos y asegúralos al vórtice. Ejecute el vórtice en la configuración más baja durante media hora con los tubos conectados. Cuando las soluciones estén listas, proceda inmediatamente a sensibilizar a los ratones BAB.

Cargue la mezcla de óvulos y alumbre en una jeringa de un mililitro. Luego, con una aguja de calibre 27, inyecte 100 microlitros en el peritoneo de cada ratón. Repita esto para los ratones de control negativo que usaron la solución de alumbre sin óvulos durante las próximas tres semanas.

Repita este proceso para un total de tres inyecciones por ratón después de la última inyección, espere al menos dos semanas antes de realizar el ensayo de anafilaxia local a partir de óvulos congelados. Comience haciendo una solución de trabajo de cinco miligramos por mililitro en PBS. Vórdelo brevemente, usando 5% de flúor ISO.

Anestesiar un ratón sensibilizado, y cuando se quede inmóvil, bajar el iso flúor al 3%Ahora cargue una jeringa de tres 10 insulinas con 10 microlitros de la preparación de óvulos, y táptela con una aguja de calibre 31 y cargue una segunda jeringa con 10 microlitros de un XPBS. A continuación, envuelva un tubo cónico de 15 mililitros con cinta adhesiva transparente con el lado adhesivo hacia afuera bajo un microscopio de disección, asegure el lado dorsal de la oreja izquierda de un ratón anestesiado al tubo. Inserte la aguja de la jeringa PBS con el bisel hacia arriba entre las dos hojas de la oreja e inyecte lentamente los 10 microlitros completos.

Evite golpear los vasos sanguíneos. Una inyección exitosa dará como resultado un parpadeo intradérmico obvio. Es fundamental inyectar todo el volumen en el oído.

Si se filtra líquido fuera del lugar de inyección, el animal no se puede utilizar en el análisis. Además, si la aguja atraviesa el oído por completo o rasca la superficie del oído, el ensayo no es válido porque estos traumatismos confundirán los resultados en el oído derecho. Use el mismo método para inyectar los óvulos durante el período de tres minutos.

Transfiera el mouse a un bloqueador y colóquelo debajo de una lámpara de calor. A continuación, inyecte lentamente 200 microlitros de tinte azul Evans al 0,5% en la vena de la cola. Con una aguja de calibre 27, la inyección rápida puede ser dañina si el vaso se destruye antes de inyectar todo el tinte.

Continúa inyectando en el lado opuesto de la cola. Ahora espere 10 minutos y luego eutanasique al ratón con dióxido de carbono, seguido de una dislocación cervical. Una vez que el animal haya sido sacrificado, use fórceps y tijeras para quitar las orejas.

Agarre el borde de la oreja con las pinzas sin ejercer presión en el lugar de la inyección. A continuación, corte cerca, pero no a través de la cresta del cartílago en la base de las orejas. Recoja la mayor cantidad de tejido posible.

Ahora, tomando las precauciones adecuadas, coloque 700 microlitros de forma amida para cada oído en un tubo de microcentrífuga. Transfiera una oreja a cada tubo e incube durante la noche a 63 grados centígrados en un bloque de calor seco, al día siguiente se extraerá la mayor parte del tinte, pero las orejas pueden aparecer ligeramente azules. Agregue 300 microlitros de cada muestra por duplicado a una placa de 96 pocillos.

Evite transferir cualquier pelaje y no forme burbujas para los espacios en blanco. Cargue dos pocillos con 300 microlitros de forma amida. A continuación, mida la absorbancia a 620 nanómetros.

Reste los valores del fondo y analice los resultados. Los animales sensibilizados con PBS no reaccionaron al desafío con óvulos ni al desafío con PBS. Como era de esperar, ambas orejas permanecieron blancas.

El año en que recibió el desafío de PBS en animales sensibilizados a OVAs fue completamente blanco o ligeramente azul, localizado en el sitio de la inyección donde sus orejas que recibieron el desafío de óvulos se oscurecieron progresivamente durante 10 minutos después de que se administró el tinte, el tejido del oído tratado con IDE de los animales sensibilizados con PBS tuvo lecturas de absorbancia insignificantes después de la exposición de PBS y OVA. Mientras que para los animales sensibilizados con óvulos, la inyección de PBS generalmente resultó en una lectura de absorbancia media de 0,13. Por el contrario, un desafío de óvulos de 50 microgramos dio como resultado una lectura de absorbancia media de 0,58.

La cantidad de óvulos utilizados para el desafío se puede ajustar dentro de ciertos límites. Por ejemplo, un desafío de 20 microgramos resultó en una absorbancia media de 0,30. Sin embargo, un desafío de menos de 20 microgramos no dio resultados confiables.

Aunque es un desafío una vez que una persona es competente en las inyecciones intradérmicas e intravenosas, esta técnica se puede realizar en un animal en aproximadamente 15 minutos con dos personas trabajando juntas, una realizando las inyecciones en el oído y la otra realizando las inyecciones en la vena de la cola. El procedimiento se puede realizar en 10 animales en aproximadamente una hora. Este ensayo es muy versátil, ya que se puede utilizar tanto para la anafilaxia cutánea activa como para la pasiva.

También se puede utilizar para una amplia variedad de alérgenos. No olvide que el flúor puede tener efectos negativos en el sistema reproductivo humano. Úselo solo en una habitación bien ventilada y tenga un recipiente de limpieza conectado a la cámara de inducción para neutralizar los gases residuales si está embarazada.

Mientras usa flúor, use una mascarilla con filtro de carbón para minimizar la exposición.