Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

El objetivo general de este procedimiento es generar cultivos de cardiomiocitos de alta calidad a partir de células madre pluripotentes y caracterizar adecuadamente el producto final mediante citometría de flujo. Para lograr esto, se generan cultivos monocapa de alta calidad de células madre pluripotentes indiferenciadas. A continuación, se induce la cardiomiogénesis modulando la trayectoria del viento utilizando moléculas pequeñas.

A continuación, los cardiomiocitos se fijan, se impregnan y se tiñen en condiciones específicamente optimizadas para cada anticuerpo. Finalmente, las células se analizan mediante citometría de flujo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cultivos que son altamente positivos para los marcadores cardíacos, TNNI tres e IRX cuatro y demuestran potenciales de acción similares a los ventriculares.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los de los cuerpos de empleados y trenzados, es que es relativamente sencilla de implementar y es rentable. Además, la técnica genera cultivos de células que son altamente positivas por troponina I cardíaca. Sin la variación subyacente interna y la eficiencia observada por otros protocolos, la demostración visual del método es crítica, ya que la calidad de la célula de prediferenciación afectará significativamente la eficiencia de la diferenciación. Además, la fijación inadecuada y permeable antes de la tinción de anticuerpos conducirá a resultados de citometría de flujo subóptimos que demuestran que el procedimiento será shabo bachar, un estudiante graduado de mi laboratorio.

El aspecto más desafiante del siguiente procedimiento es mantener células madre pluripotentes indiferenciadas de alta calidad antes de la diferenciación. El uso de células con características de crecimiento subóptimas afectará significativamente la eficiencia de la diferenciación. Comience este procedimiento con HPC bien establecidas cultivadas en seis platos recubiertos de matriz bien calificados por HESC.

Revise las células bajo el microscopio para asegurarse de que exhiban una morfología homogénea. Si las células exhiben una morfología epitelial neural o similar a un fibroblasto, como se muestra aquí, no deben usarse. Asegúrese de que las células proliferen de forma robusta cuando se asientan a 0,75 millones por pozo, pasándolas aproximadamente cada tres días al 75%Paso de confluencia de las células con disociación al nivel de una sola célula al menos cinco veces antes del inicio del paso de diferenciación A.

Las células primero aspiran el medio de crecimiento E ocho y lavan las células dos veces con cuatro mililitros de PBS precalentadas a temperatura ambiente. A continuación, agregue un mililitro de solución de desprendimiento de celdas a temperatura ambiente a cada pocillo y deje el pocillo sin tocar hasta que los límites de las celdas comiencen a redondearse. Esto suele tardar de tres a siete minutos y puede observarse macroscópicamente y confirmarse con un microscopio.

A continuación, utilizando una pipeta de vidrio taponada de algodón con una perilla, desalojó las células y las transfirió a un tubo cónico de 15 mililitros que contenía un mililitro de medio DM EMF 12. Esto inactivará la solución de desprendimiento de celda. Retire una alícuota de 10 microlitros de la solución celular y mézclela con 10 microlitros de azul de trian en un tubo de microcentrífuga.

Cuente las células y luego para recolectarlas centrifugar, el tubo cónico de 15 mililitros a 130 GS durante cinco minutos. A temperatura ambiente durante la centrifugación, cuente las células utilizando un hemocímetro automatizado. Se espera una viabilidad del 70 al 80% en el futuro.

Base todos los números de células en los recuentos totales de células en lugar de los recuentos de células viables. Después del centrifugado, aspire el medio y vuelva a suspender el pellet de celda en D-M-E-M-F 12 a una concentración final de 0,75 veces 10 a las seis celdas por 500 microlitros, agregue 0,5 mililitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de seis pocillos en la que cada pocillo contiene dos mililitros de medio E ocho. Con el inhibidor de rocas, balancee suavemente la placa de adelante hacia atrás y de lado a lado para dispersar uniformemente las células por el pozo.

Regrese las celdas a la incubadora con un 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados. 24 horas después del empaque. Comience a reemplazar el medio diariamente usando dos mililitros por pocillo de E ocho con sin inhibidor de roca.

Optimizar la densidad de siembra para lograr un 100% de confluencia antes del inicio de la diferenciación. En el día cero, las células son 100% confluentes con una morfología compacta y un mínimo de residuos celulares. Comience el proceso de diferenciación reemplazando el medio E ocho por dos mililitros de diferenciación. Medio.

Número uno, agregue 1.2 microlitros de CHIR a cada uno. Bueno, en los días uno y dos, es común observar una muerte celular significativa del 40 al 50%. Sin embargo, las células adheridas conservarán una morfología compacta.

Durante este tiempo, el medio se vuelve anaranjado y turbio. Si se observa un medio rosado, que indica una muerte celular excesiva, confirme la viabilidad celular con azul triam y suspenda si la muerte celular supera el 70%De lo contrario, el primer día, repita el proceso de reemplazar el medio con dos mililitros de diferenciación fresca. Medio. Número uno, agregue 1.2 microlitros de CHIR a cada pocillo y en los días dos o tres, reemplace con medio de diferenciación fresco.

Número uno, durante los días tres a cuatro, las células se recuperarán y la densidad aumentará el día cuatro. Reemplace el medio en cada pocillo con una diferenciación fresca. Medio número uno y un microlitro de IWR uno.

Durante los días cinco a seis, se produce una muerte celular mínima y pueden comenzar a aparecer parches densos en el día cinco, reemplazando el medio con una diferenciación fresca. El medio número uno, y agregue un microlitro de IWR uno a cada pocillo en el día seis a siete, reemplace el medio con diferenciación fresca. Medio número uno.

Hacia el séptimo y octavo día, se logra una monocapa confluente con una morfología compacta intercalada con parches densos. Para el octavo día, las células comenzarán a contraerse espontáneamente y las primeras contracciones a menudo serán visibles en los parches densos. En el octavo día, reemplace el medio con una nueva diferenciación. Medio.

Número dos, continuar reemplazando con el medio de diferenciación número dos, cada dos días durante la duración de la cultura. Para el día 10 se observa una contracción más robusta y continuará extendiéndose por todo el cultivo en los días siguientes. Este video muestra las células en el día 30 y aquí se muestran las células en el día 55.

Para recolectar células para la citometría de flujo, realice la recolección y el recuento de disociación celular como se realizó anteriormente. Tenga en cuenta que no es necesario mantener las células estériles en este punto. Mientras vórtice suavemente el pellet de la celda, agregue 100 microlitros de solución de fijación al pellet de la celda gota a gota.

A continuación, incubar el tubo en hielo durante 15 minutos. Agregue tres mililitros de solución de lavado de celdas, recoja las células por centrifugación después del centrifugado, aspire la solución mientras se agita el vórtice. Agregue 100 microlitros de solución permeable a la célula gota a gota como antes.

A continuación, incubar el tubo en hielo durante 30 minutos. Agregue tres mililitros de solución de lavado de celdas. Recoja las células por centrifugación y aspire la solución.

Repita durante un total de dos lavados después de la permeación. Realizar la tinción de anticuerpos como se describe en el documento adjunto utilizando una pipeta P 1000 a 400 microlitros de solución de mantenimiento celular para las células y disgregarlas pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, humedezca previamente una tapa de filtro de celdas en un tubo de fondo redondo con 50 microlitros de solución de mantenimiento de celdas.

Coloque el tubo en hielo. La tapa del filtro de celdas evita que los agregados de celdas obstruyan el citómetro de flujo. A continuación, transfiera la solución celular a la tapa del filtro celular y permita que la suspensión celular drene por gravedad.

Golpee suavemente la parte inferior del tubo en la mesa de trabajo para que las células se recojan en un tubo. Vuelva a colocar el tubo en hielo lo más rápido posible. Enjuague el colador con 250 microlitros de solución de mantenimiento celular para garantizar la máxima recuperación de las células.

Mantener las células en hielo y protegerlas de la luz hasta que sean analizadas por citometría de flujo para determinar la calidad de los cardiomiocitos generados. Utilizando este protocolo, las células se diferenciaron durante 10 días y se tiñeron con anticuerpos contra TNNI tres a, marcador de cardiomiocitos pan, TNNT dos un marcador de músculo estriado e IRX marcador de cardiomiocitos ventriculares cuatro A. Tenga en cuenta que la fijación y las condiciones de permeabilidad se optimizaron para cada anticuerpo para lograr el máximo porcentaje de células positivas.

Los histogramas muestran que el 99% de las células controladas fueron positivas para TNNI tres y el 96% fueron positivas para IRX cuatro. Además, las células fueron altamente positivas para otros marcadores de diferenciación cardíaca, incluidos TNNT dos, MLC dos V y MLC dos. Hay que tener en cuenta que la afirmación sobre la pureza de los cardiomiocitos y la identidad celular se basa en TNNI tres e IRX cuatro.

La tinción de MC dos V y MC dos A no está restringida por la cámara durante el desarrollo y el TNNT dos también se encuentra en el músculo esquelético. El potencial de acción mostrado aquí se registró a partir de un solo cardiomiocito que se contrajo espontáneamente en el día 46 de diferenciación utilizando el pinzamiento de parche de célula completa. El perfil de potencial de acción indica que se obtuvieron cardiomiocitos ventriculares similares.

También se observó un pequeño porcentaje de perfiles tipo ganglionar. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar cultivos de cardiomiocitos de alta calidad a partir de células madre pluripotentes y cómo caracterizarlos mediante citometría de flujo. En general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades debido a los desafíos comunes encontrados para mantener las células madre como monocapas de alta calidad antes del inicio de la diferenciación.

No olvide que trabajar con un fijador puede ser peligroso y personal. Siempre se debe usar equipo de protección, como una bata de laboratorio o guantes, mientras se realiza este procedimiento.