Ensayo de crecimiento basado en reportero para el Análisis Sistemático de la degradación de proteínas

El objetivo general de este procedimiento es determinar las variaciones en las tasas de degradación de proteínas de manera sistemática acoplándolas a la cinética del crecimiento de levaduras en cultivo líquido. Esto se logra mediante el crecimiento inicial de células que expresan una proteína reportera compuesta por una señal de degradación acoplada a un marcador metabólico durante la noche a la fase estacionaria en un medio selectivo adecuado. A continuación, se mide la densidad óptica de las células para determinar la cinética de crecimiento de las células, y luego se calcula el tiempo mínimo de duplicación de las células durante la fase logarítmica a partir de la cinética de crecimiento utilizando un programa de software designado.

En última instancia, el tiempo mínimo de duplicación calculado se puede utilizar para definir las variaciones en la cinética de degradación de proteínas. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes como el ciclamato o los ensayos de degradación de persecución por pulso son que nuestra técnica es sencilla de configurar. La adquisición y el análisis de datos son sencillos y el diseño del ensayo es extremadamente modular.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la degradación de macetas, como qué elementos se requieren para el reconocimiento de macetas mal dobladas por el sistema de macetas de ubiquitina. La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando quise hacer un cribado para identificar las proteínas que implicaban la eliminación de ubiquitina de su subconjunto. Así que establecí una forma sencilla de comparar varias muestras para preparar las células para el análisis.

Comience por transformar las células de levadura atrófica de buey adecuadas, como TRY 4 67, con un plásmido que contenga una fusión Deron U tres y un marcador metabólico adicional para la selección y el mantenimiento de plásmidos. Para la selección y el mantenimiento de plásmidos, cultive las células en placas de agar bajo un medio sintético definido adecuado, que carezca de marcadores de selección de aminoácidos, transfiera las colonias supervivientes a parches, transfiera las células de los parches a medios líquidos e incube durante la noche a 30 grados Celsius hasta que se alcance una fase estacionaria. Luego, para 15 muestras o menos, diluya 50 microlitros de las células del cultivo nocturno con 150 microlitros de medio sintético definido por pocillo.

En una placa de fondo transparente de 96 pocillos, utilice un lector de microplacas para determinar los valores de OD 600 de las muestras. A continuación, después de calcular el volumen exacto necesario para obtener células de levadura en una cantidad equivalente a un OD 600 de 0,25, se centrifugan las células durante un minuto a 12.000 veces G y a temperatura ambiente, se vuelven a suspender las células en un mililitro del medio selectivo adecuado para obtener un DO 600 de 0,25 y se transfieren 200 microlitros de la cepa diluida a un pocillo de una nueva placa de 96 pocillos cuando sean mayores de 15 Las muestras deben ser analizadas. Transfiera 10 microlitros de las células estacionarias cultivadas durante la noche a un pocillo de una nueva placa de 96 pocillos que contenga 190 microlitros del medio selectivo apropiado para medir la cinética de crecimiento de las células de levadura transformadas en condiciones selectivas.

A continuación, configure un lector de microplacas multimodo a una temperatura de incubación de 30 grados Celsius, 600 intervalos de medición de 15 minutos y ciclos de agitación orbitales y lineales de un minuto cada siete minutos. A continuación, incubar las células a 30 grados centígrados en el lector de microplacas durante 12 a 24 horas. Cuando las células hayan alcanzado la fase estacionaria, exporte los datos sin procesar a un archivo de hoja de cálculo para determinar la cinética de crecimiento de la levadura utilizando MDT Calc.

Asegúrese de que el archivo de hoja de cálculo que contiene los datos de crecimiento esté guardado y cerrado. A continuación, abra el programa de aplicación MDT Calc en la ruta del archivo. Haga clic en el rectángulo para ubicar el archivo de la hoja de cálculo debajo del nombre de la hoja.

Introduzca el nombre de la hoja de cálculo en el que se encuentran los datos sin procesar en la posición inicial. Introduzca la coordenada de tiempo de la hoja de cálculo, el cero de la primera muestra en la columna de tiempo. Introduzca la letra que define la ubicación de la columna del punto de tiempo en segundos en columna en blanco, introduzca la letra que define la ubicación de la columna en blanco.

Por ejemplo, el pozo A de la placa de 96 pocillos. Próximo. En Valor OD, elija el valor mínimo transformado de OD 600 necesario para iniciar el cálculo MDT. Por lo general, de 0,15 a 0,25 para garantizar que el MDT se calcule solo para las muestras que alcancen el valor D 600 definido o superior.

Una vez que se haya ingresado el último valor, haga clic en el botón calcular y confirme que la barra de progreso a la derecha cambia gradualmente a verde. Por último, exporte los dos conjuntos de datos que aparecen automáticamente en la pantalla al finalizar el cálculo del MDT a una nueva hoja de cálculo. Confirme que los datos incluyen el valor MDT para cada pozo que pasa la prueba del valor mínimo de OD y la hora de inicio del intervalo a partir del cual se calculó el MDT en este experimento representativo.

Las diferencias relativas en la cinética de degradación de proteínas entre el tipo salvaje y las diversas cepas mutantes se compararon inicialmente con células delta de tipo U tipo salvaje, delta UBC siete delta o DOA 10 delta que expresan D, una VMAU, tres en un medio completo definido sintético. Luego, para medir las branquias, las células se lavaron y se incubaron en medios sintéticos definidos. Se observaron curvas de crecimiento similares con uracilo negativo y MDT calculado para todas las cepas cultivadas en medio completo sintético definido, excluyendo la posibilidad de que la deleción de alguno de los genes examinados afecte el crecimiento celular.

Por el contrario, la incubación en medios sintéticos definidos menos uracilo dio lugar a un crecimiento deficiente de las células de tipo salvaje, mientras que solo se observó un defecto de crecimiento menor en las cepas mutantes. UBC siete es absolutamente necesario para la degradación de DEG uno, VMAU tres, lo que permite una evaluación precisa incluso de los efectos parciales de varios mutantes E, dos. En consecuencia, se observa una cinética de crecimiento rápido en las células que expresan UBC siete con los mutantes del sitio activo, C 89 s y N 81 A.In además, también se encontró que dos mutantes que se predice que obstaculizan indirectamente la degradación de DEG one VMA ETH three, V 20 5G y H 90 4K mejoran el crecimiento celular en comparación con UBC siete de tipo salvaje, aunque en menor grado que los mutantes del sitio activo.

Por lo tanto, el método de las branquias se puede utilizar para medir con precisión la contribución relativa de varios factores de degradación a la estabilidad de un sustrato reportero. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el protocolo es sensible a pequeñas diferencias en las tasas de degradación de proteínas. Esto es una ventaja, pero también significa que se debe tener cuidado en el diseño y la verificación del Deron que se utilizará siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de fluorescencia de alto rendimiento, para responder a preguntas adicionales, como cuál es la propensión a la agregación de las proteínas indicadoras. Por esta razón, es una buena idea incluir también una etiqueta GFP en el reportero. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar los cambios en la tasa de degradación de proteínas de manera sistemática mediante el uso de un lector de MICROPLACAS y nuestro programa de software designado.