Name: Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Aprende a analizar la diferenciación hematopoyética mediante infección retroviral de cuerpos embrioides derivados de células madre embrionarias murinas. Este método permite estudiar la expresión génica temporal.

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Este trabajo fue apoyado por una Beca Piloto y de Factibilidad del Centro de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana (IUSM) para la Excelencia en Hematología Molecular (NIDDK, 5P30DK090948). Se proporcionaron fondos adicionales a través de una subvención para el mejoramiento biomédico del IUSM. Nos gustaría agradecer a la Dra. Karen Cowden Dahl por comentar sobre el manuscrito.

1. embrioide Cuerpo (EB) Formación <ol><li> Gelatina-ADAPT CES que se han mantenido en fibroblastos de embrión de ratón (MEFs). CES Passage 3 veces en 6 así placa de cultivo tisular recubiertas con gelatina al 0,1% para eliminar MEFs. <ol><li> Se cultivan las células en medio de mantenimiento con ESC LIF para mantener las células no diferenciadas (Tabla 1). Hacer seguras las células nunca exceden el 80% de confluencia. Utilice el paso bajo (10 o menos pasajes después de la eliminación de los MEF) para la diferenciación de las células. </li></ol></li><li> En el día antes de los CES se cultivan durante la diferenciación EB, el paso de las células para que sean aproximadamente 50-70% de confluencia el día siguiente. Continuar el cultivo de células en un medio de mantenimiento ESC para mantener la pluripotencia celular. </li><li> En el día de la diferenciación, los medios de mantenimiento aspirado de ESC y se lava con 1 ml de tampón fosfato salino (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, y 11,9 mM de tampón de fosfato, pH 7,4) por pocillo de una placa de 6 pocillos. <ol><li> Añadir 200 l de 0,25% trypsen / EDTA a cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 3 min. </li><li> Inactivar la tripsina / EDTA, con 800 l de medio de diferenciación. Pipetear hacia arriba y hacia abajo en un 2 ml pipeta serológica con una punta de p200 a ruptura de las células en una suspensión de células individuales. Asegúrese de que la punta p200 encaje perfectamente en el extremo para medios de comunicación no suben entre la pipeta y la interfaz de punta. </li><li> Pipet arriba y abajo aproximadamente 5-10 veces. Tenga cuidado de no crear burbujas durante el pipeteado. </li></ol></li><li> Células de transferencia a un tubo cónico de 15 ml. Abra el volumen a 10 ml con PBS. Centrifugar a 315 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante. Lavar dos veces con 5 ml de PBS para eliminar residuos de medios que contienen LIF. Centrifugar como en el paso 1.4 para cada lavado. <ol><li> Resuspender el sedimento celular final en 2 ml de medio de diferenciación (Tabla 2). </li></ol></li><li> Contar las células con un hemocitómetro o contador de células y la placa 6.000-10.000 células / ml en una placa de Petri de 10 cm(Cultura no tejido tratado). <ol><li> Determinar las exactas células / ml empíricamente para cada línea de ESC. Utilice placas de Petri estériles normalmente utilizados para el trabajo bacteriana o placas de baja adherencia. NOTA: Para obtener los mejores resultados de la diferenciación, los EBS deben formar esferas que permanecen en suspensión sin conectar a la placa. Pruebe varias marcas de placas para encontrar que tienen la menor adherencia. </li><li> Incubar los CES diferenciadores en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos con 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Stock </td><td> Concentración final </td><td> Volumen </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> S<html> igma / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (ES apantallado) </td><td> 100% </td><td> 15% </td><td> 75 ml </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Los ácidos no esenciales Amino </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / estreptomicina </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> 14,3 M </td><td> 114 M </td><td> 4 l </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr><tr><td> Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) </td><td> 10 7 unidades / ml </td><td> 1000 unidades / ml </td><td> 50 l </td><td> Millipore </td><td> ESG1107 </td></tr></tbody></table>ontenido &quot;&gt; Tabla 1: ESC Mantenimiento Media. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Stock </td><td> Concentración final </td><td> Volumen </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (User Proyectado para la diferenciación óptima) </td><td> 100% </td><td> 15% </td><td> 75 ml </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Los ácidos no esenciales Amino </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Vida Technologías </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / estreptomicina </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> 14,3 M </td><td> 114 M </td><td> 4 l </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Diferenciación Media. 2. preparar células EB para la infección del Virus <ol><li> En la fase de desarrollo deseado (entre el día 2 y el día 3), transferir los EBS de la placa de 10 cm Petri a 15 ml tubo cónico. Lavar la placa con 5 ml de PBS y añadir el lavado al tubo cónico. </li><li> Sedimentar las EBS a 315 xg a temperatura ambiente durante 5 min. Lávese las EB células con 5 ml de PBS. </li><li> Añadir 1 ml de solución de desprendimiento celular descongelado (proteolítica que contiene enzimas y colagenolíticas) y colocar los tubos en un baño de agua a 37 ° C (o incubadora) durante 30 minutos con occagitación asional (de parpadeo o la luz agitación). </li><li> Añadir 1 ml de medio de diferenciación. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 2 ml con una punta de pipeta p200. Se coloca el tubo en el baño a 37 ° C de nuevo por 30-60 min. </li><li> Centrifugar las células a 315 xg durante 5 min y se lavan las células con PBS. </li></ol> Infección 3. Virus <ol><li> Resuspender las células en 1,5 ml de medio de diferenciación. Transferir la suspensión celular a una placa de cultivo no tisular de 6 pocillos tratada. </li><li> Preparar el retrovirus mediante técnicas estándar de anticipación. Añadir 5 a 100 l de sobrenadante viral a las células en función de la titulación viral. No agregue polibrene para mejorar la infección, ya que inhibe la posterior reforma de EBS. </li><li> Spinoculate las células con virus por centrifugación a 2120 xg durante 90 min a temperatura ambiente. </li></ol> 4. Diferenciar virales EB células infectadas en gotas colgantes <ol><li> Añadir 2 ml de medio de diferenciación a cada pocillo de infected EB suspensión celular. </li><li> Pipetear 3,5 ml de suspensión celular infectado EB en un depósito de reactivo estéril para multipipettors. Utilice la multipipettor pipetear 15-20 filas de ocho 20 l cae sobre la tapa invertida de la placa de Petri de 15 cm. </li><li> Añadir 10 ml de PBS estéril o agua a la mitad inferior de la placa de Petri. Luego invierta la tapa con las gotas y el lugar en la placa de Petri. Asegúrese de que los cuelguen gotas boca abajo de la tapa con PBS o agua por debajo para mantener la cámara húmeda. </li><li> Colocar las cápsulas en la 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos con 5,0% de CO 2. </li><li> Después de 2 días, recoger EBS formados en el ahorcamiento gotas por invertir la tapa y el lavado con 4,5 ml de medio de diferenciación. <ol><li> Medios de transferencia y EB a una nueva cultura de 10 cm no tejido placa Petri. Lavar la tapa una vez más con 3 ml de medio de diferenciación y la transferencia a la placa de 10 cm. </li></ol></li><li> Cosecha células para el análisis por citometría de flujo después de un total de 8días de cultivo a partir de la transferencia inicial de las células a medio de diferenciación (-LIF). </li></ol> 5. células Preparación para el Análisis citómetro de flujo <ol><li> Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta de 10 ml. Lavar la placa con 5 ml de PBS y transferir al mismo tubo cónico. </li><li> Células de pellets a 315 x g. Lavar pellets con 10 ml de PBS. </li><li> Añadir 1 ml de solución de desprendimiento de las células descongeladas y se colocan los tubos en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min con agitación ocasional. Para la detección de algunos antígenos de la superficie celular, la tripsina puede usarse en su lugar. </li><li> Añadir 1 ml de medio de diferenciación y pipetear arriba y abajo con una pipeta de 2 ml. Utilice una punta de p200 a la final de la pipeta para ayudar a romper-up digiere EB en suspensión de células individuales. <ol><li> Se coloca el tubo en un baño a 37 ° C de nuevo durante 60 minutos para que las proteínas integrales de membrana para reciclar a la superficie celular. </li></ol></li><li> Pellet células a 315 xg durante 5 min. </li><li> Lave el wi célulasº 0,1% albúmina de suero bovino fracción V (BSA) preparado en PBS (PBS / BSA) y se incuban las células con anticuerpos específicos marcados con fluorescencia. </li></ol> 6. Flow Analysis Citometría de Progenitores Hematopoyéticas <ol><li> Coloque 10 6 células EB derivados en un 5 ml 12 x 75 mm ronda tubo inferior. Para ajustar la compensación de citómetro de flujo, utilizar cuentas de compensación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Células de pellets a 315 x g. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en solución de PBS / BSA residual en el tubo. </li><li> Para la detección de ESC HPC, incubar las células con anticuerpos marcados con fluorescencia: anti-ratón CD41-PE (R-ficoeritrina) y anti-CD117 de ratón (cKit) -APC / CY7 (aloficocianina Cyanine 7). <ol><li> Diluir los anticuerpos 1: 100 en PBS / BSA. Añadir 100 l de anticuerpo diluido a cada muestra. Determinar la correcta dilución de anticuerpo para cada proveedor, clon, y mucho o anticuerpo. Determinar dilución óptima para el etiquetado de las células individualmente. </li&gt; </ol></li><li> Incubar las muestras en hielo en la oscuridad durante 30 min. </li><li> Añadir 2 ml de células PBS / BSA y pellets a 315 g durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en 300 l de PBS u otro tampón isotónico. </li><li> Filtro resuspendieron las células a través de una tapa de filtro de células (0,35 M) para eliminar grandes agregados de células. </li><li> Analice las células en un citómetro de flujo. </li></ol>

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Los autores no tienen intereses financieros en competencia a revelar.

Como se discutió anteriormente, los clones que expresan induciblemente ESC un gen de interés se pueden generar utilizando sistemas de doxiciclina, sin embargo, la generación de estas líneas es mucho tiempo y mano de obra intensiva. Descrito en este protocolo es un método para expresar un gen de interés en suspensión de células individuales preparado a partir de ESC derivado EBS. Estas células infectadas son luego reformaron en EBS en la horca caída examinar posterior diferenciación. En el ejemplo (Figura 3),</st...

Las células madre embrionarias (ESC) murinas son pluripotentes, permanecen indiferenciadas y se renuevan automáticamente en presencia de la citocina Factor Inhibidor de la Leucemia (LIF)1. Al retirarse el LIF, se diferenciarán espontáneamente en estructuras tridimensionales (3D) llamadas cuerpos embrioides (EB)2. La arquitectura 3D permite el desarrollo de las tres capas germinales ectodermo, endodermo y mesodermo, que luego dan lugar a tipos de tejido maduro3. Las ESCs son un modelo excepcional para dilucidar los mecanismos moleculares de la diferenciación celular, en particular la investigación del desarrollo de células progenitoras hematopoyéticas tempranas (HPCs)4. 
La expresión génica en las ESCs puede ser manipulada por varias técnicas que permiten determinar el papel de las moléculas individuales en el desarrollo. Una de las técnicas más comunes es el uso de la recombinación homóloga para generar líneas ESC, que carecen de un gen de interés5,6. También hay una serie de técnicas que se han utilizado para sobreexpresar genes. La primera técnica utilizada para modificar la expresión génica en las ESC fue infectarlas con retrovirus recombinantes7,8. Sin embargo, el gen de interés a menudo se silencia a medida que las ESC se diferencian en tipos de células progenitoras y maduras. El uso de lentivirus ha tenido éxito en limitar el silenciamiento de los genes viralmente expresados9. Otros vectores virales utilizados para la sobreexpresión incluyen el adenovirus y el virus adenoasociado10. Además, las técnicas de transfección estándar para introducir plásmidos de expresión de manera estable son ampliamente utilizadas para la expresión de transgenes ESC11. Una dificultad con estos sistemas es que a menudo la expresión de un gen específico tiene diferentes efectos dependiendo de su expresión temporal. Por ejemplo, la proteína Smad1 afecta el desarrollo de las células hematopoyéticas de manera diferente durante las diferentes etapas del desarrollo de la EB12,13. 
Este problema puede evitarse mediante la generación de ESCs que expresan induciblemente un gen de interés. El sistema más común para expresar transgenes de forma inducible en ESCs utiliza el operón de resistencia a la tetraciclina de E. Coli (Escherichia coli). Se han desarrollado varios sistemas diferentes de tetraciclinas. Una de las estrategias más populares fue desarrollada por Kyba y colaboradores14. Generaron una línea ESC (Ainv15), que tiene el gen transactivador de tetraciclina inversa insertado en el locus ROSA26 constitutivamente activo. Se introdujeron un elemento de respuesta a tetraciclina (TRE), un sitio LoxP aguas abajo (locus de X-over P1 del bacteriófago P1) y un casete de neomicina sin promotor en el locus HPRT (hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa) en el cromosoma X. Utilizando un enfoque de recombinación de CRE, se puede insertar en el sitio LoxP un gen de interés, junto con un promotor eucariota para impulsar la expresión del gen de resistencia a la neomicina. Los ESC correctamente dirigidos se aíslan mediante la selección G418. A continuación, estos clones específicos deben someterse a pruebas para determinar la expresión inducible del transgén mediante doxiciclina (o tetraciclina). Este enfoque ha generado con éxito líneas ESC que expresan induciblemente HoxB4, Stat5, SCL y Smad714-17. Sin embargo, la generación de estas líneas celulares inducibles lleva mucho tiempo. Aquí se describe un método para desagregar los cuerpos embrioides (EB) derivados de ESC en suspensiones de una sola célula, infectar retroviralmente las suspensiones celulares en diferentes días de desarrollo y luego reformar las EB colgándolas. La diferenciación aguas abajo se evalúa posteriormente mediante citometría de flujo. En este artículo se muestra un ejemplo de cómo la expresión de miRNA en células derivadas de EB afecta a la diferenciación hematopoyética. Este método es útil para investigar el papel de los genes después de que se deriva el tejido específico de la capa germinal.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-mercaptoetanol</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>FBS (ES Screened)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Definido)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales Life</td><td>Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Life Tecnologías</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>LIF ESGRO</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>ACCUMAX</td><td>Millipore</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos Falcon 6- pozo</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placas no tratadas 6 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri Falcon 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri Falcon 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-148</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 5 ml con tapón de filtro de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>Resinas estériles blancas</td><td>U.S.A. Scientific</td><td>111-0700</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD41 PE-conjugado</td><td>Biolegend</td><td>133906</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD117 APC/CY7-conjugado</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>RW4 ESC ATCC</td><td></td><td>CRL-12418</td><td></td></tr></tbody></table>

infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el análisis de la diferenciación hematopoyética

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Las células madre embrionarias (ESC) son un modelo excepcional para dilucidar los mecanismos moleculares de la diferenciación celular. Son especialmente útiles para investigar el desarrollo de células progenitoras hematopoyéticas tempranas (HPC). La expresión génica en las ESC puede manipularse mediante varias técnicas que permiten determinar el papel de las moléculas individuales en el desarrollo. Una dificultad es que la expresión de genes específicos a menudo tiene diferentes efectos fenotípicos dependiendo de su expresión temporal. Este problema puede evitarse mediante la generación de ESCs que expresan induciblemente un gen de interés utilizando tecnología como el sistema transgénico inducible por doxiciclina. Sin embargo, la generación de estas líneas celulares inducibles es costosa y requiere mucho tiempo. Aquí se describe un método para desagregar cuerpos embrioides (EB) derivados de ESC en suspensiones de una sola célula, infectando retroviralmente las suspensiones celulares y luego reformando las EB mediante gotas colgantes. A continuación, la diferenciación aguas abajo se evalúa mediante citometría de flujo. Utilizando este protocolo, se demostró que la expresión exógena de un gen de microARN al comienzo de la diferenciación de ESC bloquea la generación de HPC. Sin embargo, cuando se expresa en células derivadas de EB después de que se produce el mesodermo naciente, el gen de microARN mejora la diferenciación hematopoyética. Este método es útil para investigar el papel de los genes después de que se deriva el tejido específico de la capa germinal.

En estos estudios gelatinizadas RW4 (derivada de la cepa de ratón 129X1 / SvJ) CES se utilizaron. EBS se aislaron a los 3 días de la diferenciación. Para obtener los mejores resultados los OC deben estar esférica y no adherente (Figura 1A, B). Después de la espinoculación con el virus de co-expresión de la GFP marcador fluorescente junto con un gen de interés, EBS se reformó por el método de la gota colgante. EBS se reformaron con éxito a partir de suspensiones celulares preparadas a partir de 2,0, 2,5 ...

La manipulación de la expresión génica temporal en la diferenciación de células madre embrionarias (ESC) se puede lograr utilizando sistemas de genes inducibles. Sin embargo, la generación de estas líneas celulares es costosa y requiere mucho tiempo. Este protocolo logra la expresión rápida de un transgén en la diferenciación de células derivadas de ES y el posterior análisis de la diferenciación hematopoyética posterior.

Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar cómo la expresión de un gen en diferentes momentos durante la diferenciación de las células madre embrionarias afecta a la diferenciación hematopoyética. Después de la transducción del cuerpo embrionario, la suspensión de una sola célula por centrifugación, los cuerpos embrionarios se reforman mediante gota colgante y se cultivan para permitir una mayor diferenciación en células hematopoyéticas. A continuación, se preparan suspensiones unicelulares de los cuerpos embrionarios reformados, se incuban con anticuerpos conjugados con fluorocromo y se analizan en un citómetro de flujo para la diferenciación hematopoyética.En última instancia, este método demuestra si la expresión de un gen durante la diferenciación de células madre embrionarias afecta al desarrollo hematopoyético. Es especialmente útil para demostrar las funciones de genes que solo pueden estar activos después de la formación de tejido embrionario temprano. Por lo tanto, de las técnicas comunes para expresar un gen aventurero en diferentes momentos durante la diferenciación de células madre embrionarias requieren la generación de líneas de células madre embrionarias e

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo detalles de la derivación de células madre hematopoyéticas trasplantables a partir de células madre embrionarias de ratón (ESC) y su posterior inyección en ratones receptores irradiados letalmente. En pocas palabras, el CES se diferencian como cuerpos embrioides, que luego se infectan con HOXB4 retrovirales y co-cultivadas con células del estroma y OP9 citocinas hematopoyéticas.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

Este protocolo describe los métodos para construir un modelo de ratón humanizado de médula ósea/hígado/timo con inmunidad modificada basada en células madre contra la infección por VIH.

-Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado

células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) se derivan de las células endoteliales especializadas (hemogenic) durante el desarrollo, sin embargo, se sabe poco sobre el proceso por el cual algunas células endoteliales especifican a convertirse en la formación de la sangre. Demostramos un método basado en citometría de flujo permite el aislamiento simultáneo de las células endoteliales y hemogenic HSPC de tejidos embrionarios murinos.

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

Presentamos un protocolo rápido y flexible para un sistema de expresión in vivo basado en un solo receptor de células T (TCR) retroviral.  Los vectores retrovirales se utilizan para transducir células progenitoras de la médula ósea con el fin de estudiar el desarrollo y la función de las células T in vivo como alternativa a los ratones transgénicos TCR.

Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

El protocolo descrito aquí detalla la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos embrionarios de ratón a través de la sobreexpresión de un conjunto mínimo de factores de transcripción. Esta tecnología puede trasladarse al sistema humano para proporcionar plataformas para futuros estudios de la hematopoyesis, la enfermedad hematológica y el trasplante de células madre hematopoyéticas.

La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic

Se describe una técnica para el uso de células madre embrionarias murinas para generar dos o tres cuerpos embrioides dimensionales. A continuación, explicamos cómo inducir la diferenciación neural de las células del cuerpo embrioides por ácido retinoico, y cómo analizar su estado de diferenciación de células progenitoras por inmunofluorescencia marcador e inmunotransferencia.

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Se describen protocolos para la edición del genoma altamente eficiente de células madre hematopoyéticas murinas (HSPC) por el sistema CRISPR/Cas9 para desarrollar rápidamente sistemas de modelos de ratón con modificaciones genéticas específicas del sistema hematopoyético.

Edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 para el estudio de células hematopoyéticas en modelos de enfermedades

Aquí se presenta un protocolo para la supresión efectiva de la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones mediante la utilización de la transferencia de células adoptivas (ACT) de linfocitos T específicos de antígeno viral derivado de células madre (Ag). Este procedimiento puede adaptarse para una posible inmunoterapia basada en ACT de infección por VHB.

Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones

Aquí describimos un método para la sobreexpresión retroviral y la transferencia adoptiva de células murinas B-1a para examinar la migración celular in vivo B-1a y la localización. Este protocolo puede ampliarse para diversos ensayos funcionales posteriores, incluida la cuantificación de la localización celular del donante B-1a o el análisis de factores secretos derivados de células de donantes después de la transferencia adoptiva.

Sobreexpresión retroviral de CXCR4 en células murinas B-1a y transferencia adoptiva para la migración celular B-1a dirigida a la médula ósea y la producción de IgM

Aprende a analizar la diferenciación hematopoyética mediante infección retroviral de cuerpos embrioides derivados de células madre embrionarias murinas. Este método permite estudiar la expresión génica temporal.

Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética (Video) | JoVE Journal

Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética

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