Name: El análisis de la remodelación neurovascular en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprende a analizar la remodelación neurovascular en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales. Este método permite estudiar simultáneamente cambios neuronales y vasculares tras lesión isquémica cerebral.

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Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Basilea, Departamento de Biomedicina, y la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (31003A_141007). Markus Saxer proporcionó soporte técnico.

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas del 22 de septiembre de 2010 (2010/63/UE) y fueron revisados y autorizados por las autoridades suizas.
1. Configuración de cultivos organotípicos de cortes entorinino-hipocampos
<ol>
	<li>Preparar cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales (EHOSC) a partir de crías de ratón del día postnatal 4 (P4) utilizando el método de incubación estática4,11. En este caso, utilice ratones C57Bl6 y CB6F1.
	<ol>
		<li>Tome aproximadamente 30 minutos por cachorro de ratón para la preparación de los cultivos en rodajas, es decir, 3 horas para una camada de 6 cachorros de ratón. Lleve a cabo todos los pasos en condiciones estériles en un banco de trabajo de flujo laminar con instrumentos quirúrgicos esterilizados.</li>
		<li>Para evitar una posible interferencia de la posición de la rebanada a lo largo del eje septo-temporal, utilice únicamente rebanadas del hipocampo de la mitad septal. Si no se indica lo contrario, lleve a cabo todos los pasos en RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Corta la cabeza de un cachorro de ratón P4 con unas tijeras quirúrgicas. No se requiere anestesia para este paso.
	<ol>
		<li>Extirpa el cráneo alrededor del cerebro e identifica la fisura entre el extremo caudal de los hemisferios cerebrales y el mesencéfalo. Retire con cuidado la parte del cerebro rostral al mesencéfalo del cráneo y colóquelo en un medio de preparación helado que consista en MEM suplementado con una forma estabilizada de L-glutamina.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Continúe la disección bajo un microscopio estereoscópico con el cerebro sumergido en el medio de preparación helado. Extirpa las meninges restantes de los hemisferios corticales. Identificar el hipocampo en la superficie caudal medial del hemisferio y separarlo junto con la corteza entorrinal adyacente del resto del cerebro.
	<ol>
		<li>Transfiera el tejido a una picadora de tejidos y corte en rodajas de 400 μm de espesor en condiciones asépticas transversales al eje septotemporal del hipocampo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Colocar los rodajas en insertos de cultivo celular (aproximadamente 6 rodajas por inserto) e incubarlas en placas de 6 pocillos con 1 ml por pocillo de medio de incubación (47 ml de MEM, 25 ml de Eagle Medium, 25 ml de suero de caballo, 1 ml de glutamax I, 1 ml de una solución estéril de glucosa al 10%, pH 7,3) en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 °C. Cambie el medio al día siguiente y luego cada dos días hasta 1 semana.</li>
</ol>
2. Hipoxia in vitro y privación de oxígeno-glucosa con reperfusión
<ol>
	<li>Consulte la Tabla 1 para obtener un cronograma exacto del procedimiento. Cultive EHOSC durante 5 días (DIV5) antes de la exposición a hipoxia o OGD. En este momento, cambie el medio de un medio de incubación que contiene un 25% de suero de caballo a un medio libre de suero con la siguiente composición: Medio neurobasal con un 2% de suplemento de B27, un 1% de glutamax y un 0,1% de glucosa adicional.</li>
	<li>Prepare el medio OGD como se detalla en la Referencia 7 . Las concentraciones finales de los componentes serán las siguientes: 0,3 mM CaCl2, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCO3, 70 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgSO4 y 10 mM sacarosa a pH 6,8. Agregue 1 ml de medio OGD a cada pocillo de dos placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos.
	<ol>
		<li>Perfundir el medio OGD con N2 durante 1 hora en una cámara de hipoxia y luego sellar y mantener O/N en una incubadora a 37 °C.</li>
		<li>Utilice tiras anaeróbicas como indicadores hipóxicos. Considere que el medio está libre de oxígeno cuando el color de las tiras cambió de rosa a blanco.</li>
		<li>Para la inducción de la hipoxia, use medio libre de suero con glucosa en lugar de medio OGD. Antes de usar, perfunda el medio con N2 en una cámara de hipoxia como se detalla anteriormente para el medio OGD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Antes de que las rodajas se expongan a la OGD, vuelva a perfundir el medio OGD con N2 durante 30 min. Añada 2 μl de una solución de yoduro de propidio (PI) de 1 mg/ml por pocillo (para una concentración final de 2 μg/ml) a las rodajas durante 30 min y seleccione solo las rodajas sanas para la experimentación, según lo indicado por el bajo número de células PI positivas.</li>
	<li>Utilice el programa de exposición y reperfusión de OGD indicado en la Figura 1. Prive a los cortes de solo oxígeno (hipoxia) o de oxígeno y glucosa (OGD) durante 15 minutos.
	<ol>
		<li>Para la inducción de hipoxia o OGD, transfiera los cortes al medio OGD y manténgalos durante 15 minutos en la cámara de hipoxia. Asegúrese de que todos los fluidos que quedan en los lados del inserto se aspiren cuando los cultivos se cambien de medio regular a medio OGD y viceversa.</li>
		<li>Después de hipoxia o OGD, se reemplace el medio OGD con medio libre de suero oxigenado y se permite que los cultivos se recuperen durante 3, 24 o 48 horas en medio libre de suero en la incubadora regular a 37 °C con 5% de CO2. Añadir PI de nuevo antes de la fijación para la determinación de la muerte celular.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Tratamientos farmacológicos de cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales
<ol>
	<li>Cultivo de EHOSCs durante 5 días (DIV5) en medio de incubación antes de la exposición a tratamientos farmacológicos. Iniciar los tratamientos farmacológicos durante la OGD o inmediatamente después de la OGD cuando los cortes se transfieren a un medio libre de suero.</li>
	<li>Tratamientos para la protección contra la OGD.
	<ol>
		<li>Añadir 100 μM de 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX) o 1 μM de tetrodotoxina (TTX) al medio de cultivo durante la inducción de OGD (durante 15 min) o inmediatamente después de la inducción de OGD durante 30 min. A continuación, incubar en medio libre de suero normóxico durante 48 horas antes de la fijación.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tratamientos para la inducción de la muerte excitotóxica.
	<ol>
		<li>Después de 5 días en medio de incubación, cambie los cultivos a un medio libre de suero que contenga 100 μM (RS)-α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA) durante 30 min.</li>
		<li>Retire el medio de cultivo que contiene AMPA por aspiración (tenga cuidado de eliminar cualquier medio residual en los insertos), luego transfiera las rodajas a placas frescas con medio libre de suero normal y manténgalas durante 48 horas hasta la fijación.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Fijación e inmunotinción de cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales
<ol>
	<li>Tinción con yoduro de propidio (PI).
	<ol>
		<li>Añada PI durante 30 min al medio de cultivo de rodajas vivas a una concentración de 2 μg/ml. Observe los cultivos vivos con un microscopio invertido equipado con óptica de fluorescencia y seleccione las rodajas para tratamientos posteriores. Para la tinción de PI en combinación con inmunohistoquímica, agregue la solución de PI 30 min antes de la fijación de los cultivos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fijación de las lonchas.
	<ol>
		<li>Retire el medio de cultivo de la placa de 6 pocillos y agregue 3 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% recién preparado a cada pocillo. A continuación, coloque la placa de 6 pocillos en un frigorífico y fije el O/N a 4 °C.</li>
		<li>Retire la solución de PFA al día siguiente y lave las rodajas 3-4 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Extracción de los cortes del inserto de cultivo celular y procedimiento de bloqueo para la inmunohistoquímica de secciones flotantes.
	<ol>
		<li>Separe y retire con cuidado las rodajas de los insertos de cultivo con un pincel artístico del tamaño 0 o menor. Transfiera cada rebanada individual a un pocillo de una placa de 96 pocillos llena de tampón de bloqueo (PBS con 3% de suero de cabra normal (NGS) y 2% de Triton-X100). Mantenga las lonchas en el tampón de bloqueo durante 2 horas a RT bajo agitación constante por un agitador orbital.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inmunotinción de los cultivos en rodajas
	<ol>
		<li>Para el marcaje de los vasos sanguíneos, utilice antilaminina policlonal a una dilución de 1:200 en PBS, que contenga 1% de NGS y 0,5% de Triton-X100.</li>
		<li>Para el marcaje de las neuronas, utilice la proteína 2 asociada a los antimicrotúbulos (MAP2) en una dilución de 1:500 en PBS, que contiene un 1% de NGS y un 0,5% de Triton-X100.</li>
		<li>Incubar las rodajas con anticuerpos primarios durante 48 h a 4 °C con agitación constante. Después del período de incubación, lávelos en PBS con Triton-X100 al 0,5% durante 3-4 veces.</li>
		<li>Diluir anticuerpos secundarios 1:500 en PBS que contengan 1% de NGS y 0,5% de Triton-X100. Incube las rodajas durante 2 horas en RT en la oscuridad con los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos Alexa. Utilice el anticuerpo secundario anti-conejo o anti-ratón de cabra adecuado conjugado con Alexa 350 o 488.</li>
		<li>Retire la solución de anticuerpos secundarios y lave las rodajas tres veces con solución salina tamponada Tris (TBS); móntelas en portaobjetos de vidrio y cubra los portaobjetos con Mowiol.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Microscopía de los cortes teñidos</li>
	<li>Vea los cortes teñidos en un microscopio estándar con equipo de epifluorescencia o con un microscopio confocal. Tome imágenes con una cámara adecuada. Para algunas imágenes, invierta el contraste de fluorescencia para producir vasos teñidos de oscuridad sobre un fondo brillante (Figuras 5 y 6).</li>
</ol>
5. Determinación de la densidad regional de vasos en los cultivos
<ol>
	<li>Cuantifique la densidad de buques en función de los cruces de buques como se describe en la Referencia 8.</li>
	<li>Use rodajas teñidas para laminina para estas mediciones. Superponga imágenes grabadas con un aumento de 10X con una cuadrícula de 6 x 6, donde cada cuadrícula es igual a 100 x 100 μm por cuadrado, campo total de 0,25 mm2.</li>
	<li>Superponga tres de estas cuadrículas en la región CA1, CA3, DG y EC (Figura 2). Cuente los vasos que cruzan las líneas de la cuadrícula.</li>
	<li>Para obtener resultados con una buena relevancia estadística, realice mediciones en al menos 3 experimentos independientes, cada uno de los cuales incluya datos de 3 cachorros de ratón con 3 cortes por cachorro de ratón.</li>
	<li>Determinar el valor promedio de los cruces de buques a partir de las cuadrículas para cada región y realizar un análisis estadístico por ANOVA con corrección de Bonferroni como prueba post hoc (p<0.05 definida como significativa) utilizando un software estadístico adecuado.</li>
</ol>

<ol><li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection%3A+navigating+past+failure+to+future+success%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li>
<li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two%3A+modeling+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Neurol+J%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li>
<li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures%3A+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li>
<li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4%2C+GDNF%2C+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li>
<li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li>
<li>Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+%E2%80%98ischemia%E2%80%99+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li>
<li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice%3A+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li>
<li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li>
<li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li>
<li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li>
<li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE) y fueron revisados y autorizados por las autoridades suizas. Los autores no tienen nada que revelar.

Con los métodos presentados aquí, los cultivos de cortes organotípicos del hipocampo se pueden utilizar como una herramienta versátil para estudiar los cambios plásticos en el tejido neural después de una lesión. Si bien los cultivos de cortes organotípicos se han utilizado en el pasado para estudiar las reacciones neuronales después de la isquemia6, 7 , el nuevo aspecto del estudio simultáneo de los cambios vasculares mejora significativamente las aplicaciones potenciales de este método. La inducción de OGD o...

El sistema nervioso central es particularmente sensible a la pérdida o reducción del suministro de oxígeno y glucosa por parte de la vasculatura. Incluso una interrupción bastante breve del suministro de sangre al cerebro puede inducir una pérdida permanente de la función de las áreas cerebrales relevantes, lo que conduce a los síndromes típicos de accidente cerebrovascular. Además de la pérdida neuronal en las áreas primarias afectadas, generalmente hay una pérdida neuronal tardía adicional a través del daño secundario. Desafortunadamente, hasta ahora no se disponía de un tratamiento neuroprotector para la reducción de la muerte neuronal secundaria1. Los esfuerzos de investigación para estudiar los mecanismos del daño secundario se basan en el uso de modelos animales de isquemia cerebral como la oclusión de la arteria cerebral media y varias técnicas de oclusión trombótica (para una revisión reciente, ver2). Paralelamente, también debido a las limitaciones y preocupaciones éticas con el uso de modelos animales, se ha utilizado el cultivo de cortes organotípicos de varios tejidos del SNC que permiten el estudio de las reacciones neuronales a diversos tipos de lesiones3-5.
Para estudiar la reacción neuronal en condiciones que imitan la lesión cerebral isquémica, se ha desarrollado el sistema modelo de privación de oxígeno y glucosa (OGD). En este modelo, los cultivos en rodajas se exponen temporalmente a un medio que carece de glucosa y que se ha equilibrado con nitrógeno gaseoso en ausencia de oxígeno. Con este tratamiento, es posible inducir una lesión y pérdida neuronal bastante similar a la observada después de una lesión isquémica in vivo6, 7. En el hipocampo, este tratamiento induce una pérdida neuronal específicamente en el CA1, pero no en el área CA3 ni en el giro dentado del hipocampo. Por el contrario, el estudio de las reacciones vasculares en los cultivos de cortes hasta ahora no se ha llevado a cabo de manera generalizada. Una razón obvia es la falta de circulación y perfusión de los vasos sanguíneos en el modelo de cultivo en cortes. Sin embargo, hemos demostrado previamente que es posible mantener los vasos sanguíneos en cultivos de corte del SNC durante varios días8, 9.
El objetivo general de este método es no solo monitorear el destino de las neuronas después de la OGD, sino también extender el estudio al destino y la remodelación de la vasculatura, que es una parte importante de la respuesta a la lesión. Hasta ahora, estos estudios han requerido el uso de experimentos con animales (De Jong et al., 1999; Cavaglia et al., 2001). En el protocolo que aquí se presenta, detallaremos cómo se pueden realizar estos estudios en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales desafiados con hipoxia o por lesiones excitotóxicas, seguidos de un análisis de la supervivencia neuronal y de las reacciones de los vasos sanguíneos. Este protocolo se basa en un estudio publicado previamente sobre este tema10 y puede ser útil para cualquier laboratorio interesado en las interacciones neurovasculares en el SNC.

<table><tbody><tr><td>Medio esencial mínimo MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>forma estabilizada de L-glutamina</td></tr><tr><td>Insertos de cultivo celular</td><td>Millicell Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Medio basal Eagle&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Suero para caballos</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Tiras anaeróbicas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>Solución de yoduro de propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>R& Sistemas D</td><td>0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>R& Sistemas D</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>R& D systems</td><td>1078/1</td><td></td></tr><tr><td>antilaminina policlonal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-ratón 350</td><td>Sondas moleculares</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-ratón 488</td><td>Sondas moleculares</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-conejo 350</td><td>Sondas moleculares</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-conejo 488</td><td>Sondas moleculares</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Software estadístico</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prisma</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain picadora de tejidos</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de hipoxia</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

el análisis de la remodelación neurovascular en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

La lesión cerebral isquémica es una de las afecciones más comunes y devastadoras que compromete la función cerebral adecuada y, a menudo, conduce a déficits funcionales persistentes en los pacientes afectados. A pesar de los intensos esfuerzos de investigación, todavía no existe una opción de tratamiento eficaz disponible que reduzca la lesión neuronal y proteja las neuronas de las áreas isquémicas de la muerte secundaria tardía. La investigación en esta área suele implicar el uso de modelos animales elaborados y problemáticos. Los cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales desafiados con privación de oxígeno y glucosa (OGD) se establecen modelos in vitro que imitan la isquemia cerebral. El aspecto novedoso de este estudio es que se estudian los cambios en los vasos sanguíneos cerebrales además de los cambios neuronales y se puede comparar y correlacionar la reacción tanto del compartimento neuronal como del compartimento vascular. Los métodos presentados en este protocolo amplían sustancialmente las aplicaciones potenciales del enfoque de cultivo de cortes organotípicos. La inducción de OGD o hipoxia por sí sola puede aplicarse por medios bastante sencillos en cultivos de cortes organotípicos y conduce a un daño fiable y reproducible en el tejido neural. Esto contrasta con los complicados y problemáticos experimentos con animales que inducen accidentes cerebrovasculares e isquemia in vivo. Al ampliar el análisis para incluir el estudio de la reacción de la vasculatura, se podrían proporcionar nuevas formas de preservar y restaurar las funciones cerebrales. El enfoque de cultivo en cortes presentado aquí podría convertirse en una herramienta atractiva e importante para el estudio de la lesión cerebral isquémica y podría ser útil para probar posibles medidas terapéuticas dirigidas a la neuroprotección.

La privación de oxígeno y glucosa y la hipoxia inducen la muerte neuronal y la reducción de vasos sanguíneos específicamente en la región CA1 del hipocampo. 
La privación de oxígeno y glucosa (OGD) o la falta de oxígeno por sí sola durante 15 minutos indujo una marcada muerte celular, evidenciada mediante tinción con yoduro de propidio, específicamente en el área CA1 del hipocampo (Figura 3), de manera similar a lo descrito previamente7. Al utilizar marcadores para visualizar la re...

Se presenta un protocolo para cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales, que permite reproducir muchos aspectos de la lesión cerebral isquémica. Al estudiar los cambios en la neurovasculatura además de los cambios en las neuronas, este protocolo es una herramienta versátil para estudiar los cambios plásticos en el tejido neural después de una lesión.

El análisis de la remodelación neurovascular en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar simultáneamente los cambios de las neuronas y los vasos sanguíneos en un modelo de cultivo de tejidos de lesión cerebral isquémica. Esto se logra primero estableciendo cultivos de rodajas de hipocampo rinoceronte. El segundo paso es imitar la lesión cerebral isquémica exponiendo los cultivos a condiciones hipóxicas.El último paso es analizar y correlacionar la supervivencia neuronal y los cambios vasculares. En última instancia, se utiliza un enfoque in vitro basado en cultivos orgánicos de cortes de hipocampo para mostrar las complejas interacciones entre las neuronas y la vasculatura en condiciones isquémicas. La principal ventaja de esta técnica es que, después de un desafío hipóxico, la supervivencia neuronal y los cambios en los vasos sanguíneos se pueden estudiar simultáneamente en un sistema modelo de cultivo en cortes.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroisquemia, como revelar las complejas interacciones entre las neuronas y la vasculatura y las condiciones isquémicas. Para comenzar, prepárese, ingrese a los cultivos de cortes organotípicos de hipocampo de rinoceronte de día postnat

the-analysis-neurovascular-remodeling-entorhino-hippocampal

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El organoptypic modelo del hipocampo es una parte la...

El organotípicos rebanada hipocampo modelo de cultivo para el examen de la lesión neuronal

Se describe un método para preparar organotípicos rodajas de hipocampo que se pueden adaptar fácilmente a otras regiones del cerebro. Cortes de cerebro se ponen en membranas porosas y medios de cultivo se le permite formar una interfase. Este método conserva la arquitectura bruto del hipocampo durante un máximo de 2 semanas en la cultura.

Organotípicos culturas rebanada hipocampo

Este protocolo describe un ensayo de corte organotípicos optimizado para el cerebro postnatal y de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración de los neuroblastos en la corriente migratoria rostral.

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

Se describe una técnica para estudiar las células NG2 y los oligodendrocitos utilizando un sistema de cultivo en cortes del prosencéfalo y el cerebelo.  Este método permite examinar la dinámica de proliferación y diferenciación de las células dentro del linaje de oligodendrocitos, donde el entorno extracelular puede manipularse fácilmente mientras se mantiene la citoarquitectura tisular.

Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización

Aquí se describe una técnica para el estudio de la neurogénesis postnatal del hipocampo mediante la técnica de cultivo de cortes organotípicos. Este método permite la manipulación in vitro de la neurogénesis adulta y permite la aplicación directa de agentes farmacológicos para el hipocampo cultivadas.

Culturas organotípicos rebanada de Estudios de Postnatal neurogénesis

Las culturas Organotypic rebanada hippocampal (OHSC) representan un modelo en vitro que simula muy bien la situación en vivo . Aquí describimos un vibratome base mejorado rebanar protocolo para obtener rodajas de alta calidad para uso en la evaluación del potencial neuroprotector de nuevas sustancias o el comportamiento biológico de las células tumorales.

Culturas de rebanada Hippocampal Organotypic como un modelo para estudio neuroprotección e invasividad de las células tumorales

Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

Se presenta un protocolo para preparar cultivos de rebanadas flotantes a partir del cerebro humano adulto. El protocolo es una variación del método de cultivo de rebanadas ampliamente utilizado utilizando inserciones de membrana. Es simple, rentable y recomendado para ejecutar ensayos a corto plazo destinados a desentrañar mecanismos de neurodegeneración detrás de las enfermedades cerebrales asociadas a la edad.

Cultivos de rebanadas flotantes a corto plazo del cerebro humano adulto

Describimos un protocolo para la expresión específica de tipo celular del sensor basado en FRET genéticamente codificado ATeam1.03YEMK en cultivos de rebanadas organotípicas del forebrain del ratón. Además, mostramos cómo utilizar este sensor para imágenes dinámicas de los niveles de ATP celular en neuronas y astrocitos.

Imagen de ATP intracelular en rebanadas de tejido organotípico del cerebro del ratón utilizando el sensor basado en FRET ATeam1.03YEMK

Aquí, describimos la preparación de las rebanadas organotípicas de la corteza rinal-hipocampo. Bajo una privación gradual y controlada del suero, estas rebanadas representan la evolución epiléptica-como acontecimientos y se pueden considerar un modelo ex vivo del epileptogenesis. Este sistema representa una excelente herramienta para monitorear la dinámica de la actividad espontánea, así como para evaluar la progresión de las características neuroinflamatorias a lo largo del curso de la...

Un Modelo De Epileptogénesis En La Corteza Rinal-Hipocampo Organotípica Slice Cultivos

En este artículo, proporcionamos un método reproducible para generar y mantener cortes organotípicos de la médula espinal a largo plazo trasplantados con células madre neurales como modelo ex vivo para probar terapias de reemplazo celular.

Cultivo a largo plazo de cortes organotípicos de médula espinal de ratón como plataforma para validar el trasplante de células en lesiones de la médula espinal

Aprende a analizar la remodelación neurovascular en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales. Este método permite estudiar simultáneamente cambios neuronales y vasculares tras lesión isquémica cerebral.

El análisis de la remodelación neurovascular en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales

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