El análisis de la remodelación neurovascular en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales

El objetivo general de este procedimiento es estudiar simultáneamente los cambios de las neuronas y los vasos sanguíneos en un modelo de cultivo de tejidos de lesión cerebral isquémica. Esto se logra primero estableciendo cultivos de rodajas de hipocampo rinoceronte. El segundo paso es imitar la lesión cerebral isquémica exponiendo los cultivos a condiciones hipóxicas.

El último paso es analizar y correlacionar la supervivencia neuronal y los cambios vasculares. En última instancia, se utiliza un enfoque in vitro basado en cultivos orgánicos de cortes de hipocampo para mostrar las complejas interacciones entre las neuronas y la vasculatura en condiciones isquémicas. La principal ventaja de esta técnica es que, después de un desafío hipóxico, la supervivencia neuronal y los cambios en los vasos sanguíneos se pueden estudiar simultáneamente en un sistema modelo de cultivo en cortes.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroisquemia, como revelar las complejas interacciones entre las neuronas y la vasculatura y las condiciones isquémicas. Para comenzar, prepárese, ingrese a los cultivos de cortes organotípicos de hipocampo de rinoceronte de día postnatal de estallidos de ratón. Después de extirpar el cráneo, identifique la fisura entre el extremo cordal de los hemisferios cerebrales y el mesencéfalo.

Retire con cuidado las partes del cerebro rostral al mesencéfalo y colóquelo en un medio de preparación helado que consista en MEM suplementado. Continúe la disección bajo un microscopio estereoscópico, manteniendo el cerebro sumergido en el medio de preparación helado. Extirpa las meninges restantes de los hemisferios corticales.

A continuación, identifique el hipocampo en la superficie cordal medial del hemisferio y sepárelo junto con la corteza RH adyacente del resto del cerebro. Transfiera el tejido a una picadora de tejidos y corte rodajas de 400 micras de grosor transversales al eje temporal septal del hipocampo. Coloque las rodajas en insertos de cultivo celular e incube en placas de seis pocillos con un mililitro de medio de incubación en una atmósfera humidificada.

Cambie el medio al día siguiente y luego cada dos días hasta una semana A continuación, prepare el medio OGD. Agregue un mililitro de medio OGD a cada pocillo de dos seis. Las placas de cultivo de tejidos de pocillos perfunden el medio OGG con nitrógeno durante una hora en una cámara de hipoxia, y antes de sellar y almacenar durante la noche en una incubadora a 37 grados centígrados, utilizar tiras anaeróbicas como indicadores hipóxicos.

Considere que el medio está libre de oxígeno cuando el color de las tiras cambia de rosa a blanco. Cuando esté listo, seleccione las células sanas mediante yoduro de propidio o tinción PI. Añadir pi durante 30 minutos al medio de cultivo a una concentración de dos microgramos por mililitro.

Vea los cultivos vivos con un microscopio invertido equipado solo con óptica de fluorescencia. Las rebanadas con pocas celdas marcadas, como se muestra aquí, deben seleccionarse para un estudio adicional, las rebanadas con muchas celdas marcadas, como se muestra aquí. No debe usarse para la inducción de OGD.

Transfiera las rodajas al medio OGD y manténgalas durante 15 minutos en la cámara de hipoxia, asegúrese de que todos los fluidos que quedan en los lados del inserto se aspiren en los cultivos del interruptor. Del medio regular al medio OGD y viceversa después de la OGD, reemplace el medio OGD con medio libre de suero oxigenado y permita que los cultivos se recuperen durante 3, 24 o 48 horas. En medio libre sérico, añadir pi de nuevo antes de la fijación para determinar la muerte celular.

Si el estudio requiere tratamientos farmacológicos, indíquelos durante la OGD o inmediatamente después, cuando los cortes se transfieran a la producción libre de suero. Medio para tinción de PI. En combinación con inmunohistoquímica, añadir la solución de PI 30 minutos antes de la fijación de los cultivos.

Después de fijar las celdas durante la noche, retire la solución de PFA y lave las rodajas de tres a cuatro veces. Con PBS, comience el procedimiento de bloqueo separando cuidadosamente las rodajas de los insertos de cultivo y transfiriéndolas a un pocillo de una placa de 96 pocillos llena de tampón de bloqueo. Mantenga las lonchas en el tampón de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente bajo agitación constante por un agitador orbital.

Después de agregar los anticuerpos primarios de elección, incubar durante 48 horas a cuatro grados centígrados con agitación constante después del período de incubación. Lávelos en PBS con 0.5%Triton X 103 a cuatro veces. A continuación, siga los procedimientos estándar en todo el anticuerpo secundario antes de montar las secciones de tinte en portaobjetos de vidrio con cubreobjetos.

Vea los cortes teñidos en un microscopio estándar con equipo de epifluorescencia o con un microscopio confocal. Para algunas imágenes, invierta el contraste de fluorescencia para producir vasos teñidos de oscuro sobre un fondo brillante utilizando rodajas teñidas para laminina. Imágenes grabadas superpuestas de 10 aumentos con una superposición de cuadrícula de seis por seis, tres de estas cuadrículas en la región ca uno, CA tres DG y DC.

Y contar los buques que cruzan las líneas de la cuadrícula para obtener resultados con buena relevancia estadística. Tome medidas de al menos tres experimentos independientes, cada uno de los cuales incluye datos de tres bocanadas de ratón con tres rodajas por cachorro de ratón. La comparación de los cultivos de control con los tratados revela que la hipoxia induce la muerte neuronal y la pérdida de vasos sanguíneos en aproximadamente una región del hipocampo.

En estos ejemplos, la tinción de PI se muestra en rojo y se fusiona con la tinción de laminina en verde a las tres horas después del tratamiento con hipoxia, no hay tinción de PI visible y no hay cambios vasculares evidentes. Después de 24 horas, aparece la tinción de PI y también es evidente la pérdida de vasos sanguíneos. Tanto la tinción de PI como la pérdida de vasos sanguíneos se hacen más evidentes después de 48 horas.

La OGD por sí sola induce tanto la pérdida neuronal como la pérdida de vasos sanguíneos. En ca, una aplicación de TTX o CN QX previno tanto la pérdida neuronal como se observó con la tinción de PI y la pérdida de vasos sanguíneos revelada por el tratamiento de tinción de laminina con 100 micromolares A MPA durante 30 minutos indujo una pérdida neuronal generalizada en la mayoría de las áreas del hipocampo, pero la pérdida de vasos sanguíneos permaneció restringida al área CA uno. La cuantificación de los vasos sanguíneos confirma la pérdida selectiva en una zona de CA.

Después de este procedimiento, se pueden realizar tratamientos farmacológicos o modificaciones genéticas para identificar agentes neuroprotectores eficaces y comprender mejor los mecanismos de la remodelación vascular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar cultivos similares al hipocampo intermedio e inducir OGD seguido de un análisis de la supervivencia neuronal y los cambios vasculares.