Proyección de imagen de calcio en las neuronas

Las imágenes de calcio son una técnica extremadamente útil para investigar la variedad de funciones que tienen los iones de calcio en el funcionamiento de las neuronas. Los iones de calcio generan una multitud de señales intracelulares que controlan funciones clave, como la liberación de neurotransmisores de las vesículas sinápticas. Los métodos de imagen de calcio permiten la medición directa del flujo dinámico de calcio dentro de las neuronas y el tejido neuronal. Este video proporciona una descripción general de cómo funcionan los tintes indicadores de calcio, cómo se completa un experimento de imágenes de calcio y, finalmente, analiza algunas de las aplicaciones de esta técnica.

Primero, repasemos los principios bioquímicos de los colorantes indicadores de calcio.

Los colorantes indicadores de calcio son moléculas quelantes modificadas, como Fura-2, que se componen de dos componentes principales. El primero es el sitio quelante que se une al calcio de forma selectiva. El segundo es un sitio fluorescente que emite luz a una longitud de onda específica cuando es iluminado por una longitud de onda de excitación de luz ultravioleta.

La unión del calcio al colorante altera sus propiedades de fluorescencia, lo que proporciona una forma de cuantificar los cambios en la concentración de calcio, que está representada aquí por la diferencia en la intensidad fluorescente emitida por esta neurona a dos longitudes de onda de excitación diferentes.

La mayoría de los colorantes indicadores de calcio se modifican aún más para permitir que atraviesen fácilmente la membrana celular y se introducen en la solución de baño con las neuronas o se inyectan en el tejido cerebral para estudios en animales completos.

Algunos colorantes tienen propiedades de doble excitación o doble emisión dependiendo de si el calcio está unido o no. Tomemos, por ejemplo, el colorante Fura-2, que tiene una longitud de onda de excitación diferente cuando el calcio está unido y cuando no lo está. Al tomar la relación de la intensidad de emisión en las dos longitudes de onda de excitación, se puede hacer una estimación mucho más precisa de la concentración de calcio.

Los colorantes de doble excitación o emisión, como Fura-2, se denominan indicadores de calcio radiométricos. Existen colorantes no radiométricos que tienen longitudes de onda de excitación y emisión únicas. Sin embargo, son más susceptibles al fotoblanqueo, que es el debilitamiento o la pérdida de fluorescencia con la exposición prolongada a la luz.

Un paso clave antes de usar un tinte en un experimento es calibrar las mediciones de fluorescencia tomadas del tinte con soluciones de concentraciones de calcio conocidas. Esto permitirá a los científicos estimar con precisión las concentraciones de calcio intracelular en función de las intensidades de emisión medidas durante los experimentos.

Ahora que hemos aprendido cómo funcionan los indicadores de calcio, exploremos cómo obtener imágenes del flujo de calcio en las neuronas plateadas.

Comience preparando el colorante indicador de calcio de elección, como Fura-2, y mezclándolo con soluciones fisiológicas adicionales. Agite la solución para asegurar una mezcla adecuada. Una vez que esté suficientemente mezclado, transfiéralo a un plato. Ahora coloque el cubreobjetos con las neuronas cultivadas en el plato con la solución de colorante. A continuación, incuba las neuronas en la oscuridad durante el tiempo requerido a la temperatura adecuada, que en este caso es de 30 minutos a 37 ?C. Después del período de incubación, transfiera el cubreobjetos a un plato sin el tinte.

El siguiente paso es montar el cubreobjetos en la cámara de imágenes del microscopio. Una vez montado, conecte la línea de entrada del sistema de perfusión y llene lentamente la cámara. Asegure la cámara a la platina del microscopio e instale las líneas de perfusión de salida, asegurando un flujo continuo en todo el sistema de perfusión.

Ahora que la etapa del microscopio está lista, enfoca las neuronas con luz visible. Pruebe el tinte iluminando las células a longitudes de onda de 340 y 380 nm. Recordemos que con Fura-2, las neuronas no activadas deberían emitir más luz cuando se excitan a 380 nm, ya que el calcio no se une.

A continuación, ajuste la configuración de la cámara para optimizar el rango dinámico antes de comenzar el experimento. Recopile una imagen en cada longitud de onda y, a continuación, utilice la región de interés o la herramienta ROI para medir la intensidad del fondo en cada longitud de onda. Introduzca los valores de fondo en el software de control para que se puedan restar de las imágenes posteriores.

Una vez completada la configuración inicial, elija los cinco o más campos de visión que se van a visualizar para el experimento y guarde las coordenadas en el software de control. Durante el experimento, la etapa automatizada se mueve a un campo, recoge una relación de la intensidad del campo a longitudes de onda de 340 y 380 nm, y pasa al siguiente campo hasta que se recogen todos los campos.

En algunos experimentos, se añade un agente farmacológico al líquido de perfusión que provoca cambios en los niveles de calcio intracelular. Una solución con alto contenido de potasio, que despolariza las neuronas, puede hacer que la concentración de calcio intracelular aumente, como se muestra en esta serie de imágenes de lapso de tiempo y sirve como un buen control positivo. Una vez finalizada la recopilación de datos, se procede al análisis.

Para analizar los resultados, seleccione regiones de interés que incluyan neuronas o partes de neuronas mediante el software. A continuación, utilice el software para medir la información de la intensidad radiométrica de la imagen de ambas longitudes de onda en cada ROI en todas las imágenes recopiladas. Con esta información, se puede hacer una evaluación cuantitativa de los cambios en las concentraciones de calcio intracelular a lo largo del tiempo.

Ahora que ya sabes cómo se obtienen las imágenes de calcio en las neuronas, veamos algunas de las formas en que este valioso método se aplica en la investigación actual.

En primer lugar, las imágenes de calcio se utilizan para investigar cómo fluye el calcio intracelular en relación con la actividad neuronal.

En este estudio, las neuronas individuales se llenaron con un tinte indicador de calcio mientras se registraba el parche. El control preciso del potencial de membrana habilitado por la técnica de fijación de parche proporciona información sobre la dinámica del flujo de calcio.

Las imágenes de calcio permiten a los investigadores investigar la actividad de red altamente sincrónica de las neuronas.

Aquí, los neurocientíficos utilizaron imágenes de calcio para evaluar la señal fluorescente de 40 neuronas. Con esta información, se pueden determinar las propiedades de la red, como la propagación de la señal y las correlaciones neuronales.

La dinámica del calcio también puede revelar cómo las neuronas procesan las señales del mundo exterior, como los olores.

En este experimento, se cultivaron órganos sensibles a las feromonas extraídos de la nariz de un ratón. Las neuronas dentro del tejido se incubaron con Fura-2 y se tomaron imágenes mientras se les presentaban odorantes como orina o feromonas purificadas. Al manipular la expresión de las proteínas receptoras de olores en las neuronas olfativas, es posible visualizar directamente cómo una sola proteína influye en la capacidad de una célula para responder a olores únicos.

Acabas de ver la introducción de JoVE a las imágenes de calcio en las neuronas. En este video, discutimos las propiedades detrás de la técnica y revisamos un experimento típico.

Dadas las muchas funciones importantes del calcio, las imágenes de calcio seguirán siendo una herramienta vital en la comprensión de las neuronas y cómo interactúan entre sí.

¡Gracias por mirar!