Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los cambios relativos en el nivel de una proteína en los centrosomas en diversas condiciones. Por ejemplo, en un punto específico del ciclo celular después de la inhibición del proteasoma, esto se logra tratando primero las células que están creciendo en cubreobjetos con el inhibidor del proteasoma MG one 15 o con el solvente de control DMSO. A continuación, se añade inmediatamente BRDU a ambas células y se incuban durante cuatro horas en una incubadora de cultivos celulares.

El segundo paso es transferir los cubreobjetos a una placa de 24 pocillos para fijar las celdas. A continuación, las células se tiñen con anticuerpos contra BRDU y las proteínas de interés, y luego con los anticuerpos secundarios correspondientes. El paso final es adquirir imágenes de células BRDU positivas utilizando un microscopio de fluorescencia y un software de imágenes digitales para aplicar un tiempo de exposición y una longitud del eje Z idénticos a las células de cada muestra.