Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los cambios relativos en el nivel de una proteína en los centrosomas en diversas condiciones. Por ejemplo, en un punto específico del ciclo celular después de la inhibición del proteasoma, esto se logra tratando primero las células que están creciendo en cubreobjetos con el inhibidor del proteasoma MG one 15 o con el solvente de control DMSO. A continuación, se añade inmediatamente BRDU a ambas células y se incuban durante cuatro horas en una incubadora de cultivos celulares.

El segundo paso es transferir los cubreobjetos a una placa de 24 pocillos para fijar las celdas. A continuación, las células se tiñen con anticuerpos contra BRDU y las proteínas de interés, y luego con los anticuerpos secundarios correspondientes. El paso final es adquirir imágenes de células BRDU positivas utilizando un microscopio de fluorescencia y un software de imágenes digitales para aplicar un tiempo de exposición y una longitud del eje Z idénticos a las células de cada muestra.

A continuación, se analizan las imágenes para cuantificar el nivel relativo de romal VDA C3. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia cuantitativa se utiliza para mostrar que el grupo somal Centro de VDA C3 se duplica cuando el proteasoma se inhibe durante la fase S. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la citometría de flujo, la inmunotransferencia o el microscopio cuantitativo, es que esta técnica analiza el nivel romal relativo de la proteína en dos muestras tratadas de manera diferente que se procesan en dos cubreobjetos diferentes. Este método utiliza la normalización a un estándar interno para controlar la necesidad de procesar las dos poblaciones de células experimentales.

Por separado, este método puede proporcionar información sobre la regulación de proteínas específicas en los centrosomas. También se puede aplicar a otras situaciones, como otras estructuras subcelulares o el examen de grupos específicos de proteínas que se encuentran en múltiples sitios dentro de la célula. Para comenzar el experimento, el paso dos veces 10 al quinto crecimiento asincrónico de células RPE una en placas de 35 milímetros previamente preparadas con labios cúbicos y hacer crecer las células en dos mililitros de medio completo.

Reemplace el medio de cultivo cada 24 horas con medio precalentado fresco después de 44 horas. Reemplace el medio de cultivo con un medio completo que contenga 0.05% DMSO o MG uno 15 a una concentración final de cinco micromolares, y simultáneamente agregue BRDU a las células a una concentración final de 40 micromolares e incube las células durante cuatro horas. A continuación, transfiera cada cubreobjetos a una placa de 24 pocillos.

Agregue 500 microlitros de metanol previamente labrado a cada pocillo e incube la placa a menos 20 grados centígrados para fijar las celdas. Después de 10 minutos, lave inmediatamente los cubreobjetos tres veces con 500 microlitros de tampón de lavado. Incubar las células fijas en cubierta, deslizar 200 microlitros de tampón de bloqueo durante 30 minutos mientras las células se incuban.

Prepare una cámara humidificada colocando una toalla de papel húmeda en la mitad inferior de una caja vacía de puntas de pipeta de 1000 microlitros. Coloque una tira de perfume en la superficie del estante y agregue una gota de 20 microlitros del anticuerpo de conejo anti V DDA tres y ratón anti gamma tubulina diluido en tampón de bloqueo sobre la paraforma. Después del bloqueo, invierta un cubreobjetos en cada gota de solución de anticuerpos.

Asegúrese de que las celdas estén sumergidas y cierre la tapa de la caja de puntas. Incubar las células con anticuerpos primarios durante la noche a cuatro grados centígrados en la cámara humidificada. Invierta de nuevo los tirantes de la tapa y devuélvalos a la 24.

Lave bien los cubreobjetos, luego incube en una solución de 150 microlitros de anticuerpos secundarios, diluidos en tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente Después de la incubación, lave los cubreobjetos tres veces con tampón de lavado. Fije el EPR teñido con 500 microlitros de metanol enfriado a menos 20 grados centígrados. Después de que las celdas se hayan fijado durante 10 minutos, lávelas tres veces en tampón de lavado.

A continuación, incube las células en 200 microlitros de dos HCL normales durante 30 minutos. A temperatura ambiente, neutralizar las células con 300 microlitros de un molar tris CL pH ocho, y lavar las células tres veces. Con tampón de lavado, bloquee las celdas con 200 microlitros de tampón de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después del bloqueo, incubar las células con anticuerpo anti BRDU para ratas y tampón de bloqueo durante 45 minutos a 37 grados centígrados en la cámara humidificada. Regrese los comprobantes de la cubierta al 24. Lavar y lavar bien las células.

A continuación, incubarlos con anticuerpo secundario diluido en 150 microlitros de tampón bloqueante. En un plato de 24 pocillos durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, lave los cubreobjetos tres veces con un punto XPBS, una gota de seis microlitros de una solución de montaje que contenga reactivo Antifa en un microscopio de vidrio.

Deslice hacia adentro un cubreobjetos con el lado de la celda hacia abajo sobre la solución de montaje. Con un pañuelo de limpieza suave, presione suavemente el cubreobjetos contra el portaobjetos para eliminar el exceso de líquido y selle el cubreobjetos en el microscopio. Deslízalo aplicando esmalte de uñas a lo largo del borde del cubreobjetos.

Utilice un objetivo de inmersión en aceite APO plano de 100 x con una apertura numérica de 1,4 para adquirir las imágenes de las células RPE positivas para BRDU a temperatura ambiente. Determine el plano focal superior e inferior adecuado a lo largo del eje Z con un tamaño de paso de 0,2 micras y adquiera imágenes a lo largo del eje Z. A continuación, realice la deconvolución de todas las pilas de imágenes adquiridas a lo largo del eje Z.

Obtener la proyección de intensidad total de cada imagen. Apílelo a lo largo del eje Z para celdas cuyos centrosomas están separados por menos de dos micras. Dibuje un pequeño cuadrado de 20 a 30 píxeles por lado alrededor de ambos centrosomas y marque el área seleccionada.

Dibuja un cuadrado más grande de 24 a 35 píxeles por lado alrededor del primer cuadrado y marca el área seleccionada del cuadrado grande. A continuación, obtenga el área y la intensidad de fluorescencia total de cada fluoro cuatro. En cada cuadro, calcule la intensidad de fluorescencia corregida de fondo de cada fluoro. Cuatro.

Por último, se obtiene la intensidad de fluorescencia normalizada de VDA C3 calculando la relación entre la intensidad de fluorescencia corregida de fondo y su flúor. Cuatro a la de los fluoro cuatro utilizados para el estándar interno elegido, se capturaron imágenes de campos aleatorios de células RPE uno en crecimiento asíncrono incubadas con BRDU y el inhibidor del proteasoma MG one 15 o el solvente de control DMSO y mostraron ADN y BRDU. El fondo corrigió la intensidad de fluorescencia correspondiente al Centro Somal.

VD 3 fue aproximadamente 2,5 veces mayor en las células tratadas con MG 15 que en las células de control, como se demuestra en este diagrama de caja y bigotes. Cuando los datos se normalizaron para la fluorescencia total de VD tres frente a la de la gamma tubulina, el pliegue aumentó, disminuyó ligeramente a aproximadamente el doble. La tinción de VD C3 en citos no romales o en el nivel celular total de VD tres no se vio afectada por la inhibición del proteasoma.

Por lo tanto, el grupo romal de VDA C3 está regulado por la degradación mediada por proteasoma. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los anticuerpos contra la proteína de prueba y el estándar interno deben elevarse en diferentes especies de huéspedes y que las imágenes de ambas muestras deben adquirirse utilizando parámetros de imagen idénticos, como el número de cesáreas y los tiempos de exposición, para minimizar el efecto de las imágenes digitales.