Name: Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a cuantificar niveles de proteína en centrosomas mediante inmunofluorescencia cuantitativa en células RPE1 fijas. Este ensayo normaliza la intensidad de fluorescencia a un estándar interno para comparar muestras procesadas separadamente.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (GM77311) y una subvención inicial de The Ohio Cancer Research Associates (a H.A.F.). SM fue parcialmente apoyado por una beca Up on the Roof del Programa de Genética del Cáncer Humano del Centro Oncológico Integral de la Universidad Estatal de Ohio.

1. Cultivo Celular <ol><li> Utilice la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), las células epiteliales del pigmento de la retina inmortalizadas (hTERT-RPE1; se hace referencia aquí como RPE1). NOTA: RPE1 células son células humanas diploides, casi no transformadas que se utilizan comúnmente para estudiar el montaje centriolo y ciliogenesis. Estas células siguen un ciclo normal de duplicación centriolo coordinado con un ciclo celular regulado. </li><li> Passage un casi confluente 100 mm placa de cultivo celular de las células RPE1 a 1: 5 dilución del cultivo original en un plato de 100 mm fresco que contiene 10 ml de DME / F-12 (1: 1) el medio suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina (medio completo se conoce como DME / medio F-12). Se cultivan las células a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2. <ol><li> Incubar 12 mm cubreobjetos de vidrio redondas en 50 ml de HCl 1 N en un vaso de vidrio cubierto, O / N sin agitación, a 60 ° C en un baño de agua o una incubadora. </li><li> After descartando la solución de ácido, lavar los cubreobjetos tres veces en 100 ml de agua destilada por incubación durante 15 min con agitación ocasional. Repetir el lavado de manera similar en 70% de etanol y 95% de etanol. </li><li> Seque los cubreobjetos mediante la difusión individualmente a cabo en un papel secante de laboratorio en una cabina de bioseguridad, seguido de esterilización con radiación UV durante 60 min. </li></ol></li><li> Coloca 2-4 cubreobjetos secos en un 35 mm placa de cultivo celular. Diluir la solución de fibronectina o fibronectina como polímero de ingeniería (concentración de solución madre de 1 mg / ml) a una concentración de 25 mg / ml en cultivo celular PBS. <ol><li> Coloque 80-100 l de la solución diluida sobre cada cubreobjetos y se incuba durante 60 min a recubrir el lado superior del cubreobjetos. Lavar los cubreobjetos tres veces usando PBS antes de la adición de medio completo. </li></ol></li></ol> 2. Las células de cultivo y tratamiento de las células con inhibidores del proteasoma <ol><li> Paso 2 x 10 5 crecer de forma asíncronaING RPE1 células en cada placa de 35 mm que contiene cubreobjetos y crecer las células en 2 ml de medio completo. Reemplace el medio de cultivo cada 24 horas con medio completo fresco precalentado. <ol><li> Para analizar el efecto de la inhibición del proteasoma en el nivel centrosomal de la proteína de prueba (aquí VDAC3 o γ-tubulina), crecen las células en dos placas de 35 mm de 44 hr. Reemplazar el medio de cultivo con medio completo y añadir ya sea MG115 o DMSO como disolvente de control a una concentración final de 5 mM o 0,05%, respectivamente. Al mismo tiempo, añadir BrdU a las células a una concentración final de 40 mM y se incuban las células durante 4 horas. </li><li> Traslado cada cubreobjetos en una placa de 24 pocillos. Añadir metanol 500 l refrigerada a cada pocillo y se incuba la placa a -20 ° C durante 10 min para fijar las células sobre los cubreobjetos. Lavar inmediatamente los cubreobjetos tres veces con tampón de lavado 500 l (1X PBS que contenía 0,5 mM de MgCl 2 y 0,05% de Triton X-100). </li></ol></li><li> Se recoge el residuolas células de la placa de 35 mm y centrifugar las células a 1000 xg durante 5 min. Utilice el sedimento de células para analizar la proteína total por el Western Blot (paso 6). </li></ol> 3. Pulso BrdU y Chase Ensayo para analizar los niveles de proteína en diferentes fases del ciclo celular <ol><li> Para analizar la variación del nivel de una proteína (aquí VDAC3, SAS6 o Cep135) en los centrosomas en diferentes fases del ciclo celular, crecer las células en dos placas de 35 mm que contienen cubreobjetos de 44 hr. Sustituir el medio de cultivo con medio completo que contenía 40 mM BrdU e incubar las células durante 4 horas en la incubadora de cultivo celular. </li><li> Desde un plato, transferir los cubreobjetos a una placa de 24 pocillos para fijar las células utilizando metanol frío como se describe en el paso 2.1.2. </li><li> Después del pulso BrdU 4 horas, se elimina el medio que contiene BrdU-, lavar las células una vez con PBS y una vez con medio completo, se añade medio fresco, y luego crecer las células en ausencia de BrdU durante diversos tiempos (normalmente otro 4 hrpara las células RPE1) antes de la fijación de las células tal como se describe en el paso 2.1.2. NOTA: Para las células RPE1, la mayoría de las células BrdU-positivas están en S tarde o G2 fases después de una persecución de 4 horas. Esto se debe determinar de forma independiente para cada tipo de célula. </li></ol> 4. La inmunotinción <ol><li> Se incuban las células fijadas sobre cubreobjetos en 200 l de tampón de bloqueo (2% de BSA y 0,1% Triton X-100 en 1X PBS) durante 30 min. <ol><li> Se incuban las células con una mezcla de anticuerpos primarios (típicamente uno en conejo y otro criados en ratón) diluido en tampón de bloqueo O / N a 4 ° C en una cámara humidificada. </li><li> Para hacer una cámara húmeda, poner una toalla de papel húmeda en la mitad inferior de una caja de puntas de pipeta de 1.000 l vacía. Colocar una tira de Parafilm sobre la superficie rack, y detectar una gota (15-20 l) de la solución de anticuerpo en el Parafilm para cada cubreobjetos para ser incubados. Invertir un cubreobjetos sobre una gota de solución de anticuerpo (de modo que las células están inmersas) y cercala tapa de la caja de propina. </li><li> Invierta cubreobjetos de nuevo y volver de nuevo a la placa de 24 pocillos. Lavar cubreobjetos y luego se incuba en 150 l mezcla de anticuerpo secundario (aquí tinte anti-conejo conjugado fluorescente verde y colorante rojo fluorescente conjugado anti-ratón diluidos en tampón de bloqueo) durante 1 hora a RT. Lavar los cubreobjetos tres veces. NOTA: Los anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado son sensibles a la luz. Proteja las muestras de la luz durante los pasos 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li> Preparar para la tinción de anti-BrdU mediante la fijación de las células teñidas RPE1 de nuevo con 500 l de metanol enfriada a -20 ° C durante 10 min, como se describe en el paso 2.1.2. Lavar los cubreobjetos tres veces. NOTA: Esta fijación asegura el etiquetado de anticuerpos primaria y secundaria de la proteína (s) de interés durante el proceso de hidrólisis ácida en el siguiente paso. <ol><li> Se incuban las células en 200 l de HCl 2 N durante 30 min a RT. Neutralizar con 300 l de 1 M Tris-Cl, pH 8 unad lavar las células tres veces con tampón de lavado. </li><li> Bloquear las células de nuevo utilizando 200 l de tampón de bloqueo durante 30 min a RT. </li><li> Se incuban las células con anticuerpo de rata anti-BrdU (diluido en tampón de bloqueo) durante 45 min a 37 ° C en una cámara humidificada. Devolver los cubreobjetos de nuevo a la placa de 24 pocillos, lavar y luego se incuba con el tinte azul-anticuerpo conjugado fluorescente anti-rata secundario (diluido en 150 l de tampón de bloqueo en el plato de 24 pocillos durante 1 hora a RT. </li></ol></li><li> Lavar los cubreobjetos tres veces. Detectar una gota (aproximadamente 3-6 l) de una solución de montaje que contiene antifade reactivo en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Invierta un cubreobjetos, con vistas al-células hacia abajo, hacia la solución de montaje. Limpie el exceso de líquido presionando suavemente el cubreobjetos contra la diapositiva utilizando tejido de limpieza suave. Aplicar esmalte de uñas transparente a lo largo del borde del cubreobjetos para sellarlo sobre el portaobjetos de microscopio. </li></ol> 5. La inmunofluorescencia Imagen acquisition y análisis <ol><li> Utilice un objetivo de inmersión en aceite 100X Plan de Apo (con una apertura numérica 1.4) para adquirir las imágenes de las células RPE1 BrdU-positivas a temperatura ambiente. <ol><li> Ponga un portaobjetos en el microscopio (ver equipos) adjunto con una cámara capaz de imagen digital. Para cada fluoróforo, determinar el tiempo de exposición apropiado (típicamente entre 300-1.000 mseg) manualmente mediante el examen de todas las muestras de un experimento. Antes de la adquisición de imágenes de una célula, determinar manualmente la parte superior apropiado y plano focal inferior a lo largo del eje Z (típicamente 0,2 m de tamaño de paso). Adquirir imágenes de diferentes muestras que están en cubreobjetos separadas utilizando el tiempo de exposición idénticos para diferentes fluoróforos a lo largo del eje Z utilizando un paquete de software de formación de imágenes de microscopía digital. </li></ol></li><li> Realizar deconvolución (en estos casos usando No algoritmo de vecino) de todas las pilas de imágenes adquiridas a lo largo del eje Z. <ol><li> Obtener la proyección total de intensidad de cada pila de imágenes a lo largo deel eje Z. </li></ol></li><li> En las células donde centrosomas están cerca (distancia entre dos centrosomas es inferior a 2 micras), dibuja un pequeño cuadrado (típicamente 20 a 30 píxeles por lado) alrededor de los dos centrosomas y marcar el área seleccionada. <ol><li> Dibuja un cuadrado más grande (por lo general 24 a 35 píxeles por lado) que rodea a la primera plaza y marcar el área seleccionada de la gran plaza. </li><li> Obtener el área (A) y la intensidad de la fluorescencia total (F) de cada fluoróforo en cada caja (S denota pequeña caja y L denota caja grande). </li><li> Analizar la corrección de fondo intensidad de la fluorescencia de cada fluoróforo utilizando la fórmula descrita por Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x A S / (A L - A S)]. </li><li> Obtener la intensidad de fluorescencia normalizada de la proteína de interés (aquí VDAC3 o SAS6) mediante el cálculo de la relación de la intensidad de fluorescencia de sus fl fondo corregidofluoróforo a la del fluoróforo utilizado para el estándar elegido interna (aquí γ-tubulina, SAS6 o Cep135). </li></ol></li><li> En el caso de análisis de las células donde centrosomas están bien separados (distancia entre dos centrosomas es mayor que 2 micras), analizar cada centrosoma separado trazando dos conjuntos separados de cajas. Dibuja un cuadrado pequeño (típicamente 15 a 25 píxeles por lado) alrededor de cada centrosoma y marcar el área seleccionada. Dibuja un cuadrado más grande (20 a 30 píxeles por lado) que rodea a la primera plaza y marcar el área seleccionada. <ol><li> Obtener el área (A) y la intensidad de la fluorescencia total (F) de cada fluoróforo en cada caja, y calcular las intensidades de fluorescencia con corrección de fondo de cada fluoróforo, por separado para cada centrosoma, como se describe en el paso 5.3.3. </li><li> Combinar las intensidades de fluorescencia con corrección de fondo de cada proteína a partir de los dos centrosomas para obtener el nivel centrosomal total de esa proteína en esa célula. </li><li> Obtenga elintensidad normalizada para la proteína de interés mediante el cálculo de la relación de su intensidad total de centrosomal a la intensidad centrosomal total del patrón interno. </li></ol></li><li> Analizar al menos 15 a 25 células para cada condición experimental y dibujar el gráfico en una hoja de cálculo. </li></ol> 6. Análisis de la proteína total usando Western Blot <ol><li> Resuspender las células en ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) mM tampón que contiene Tris-HCl 50 pH 8, NaCl 150 mM, 1% Nonidet P-40, 1% de desoxicolato de sodio, 0,1% de dodecil sulfato de sodio (SDS) y se incuba durante 10 min en hielo para lisar las células. <ol><li> Centrifugar la mezcla a 10.000 xg durante 10 min, separar el lisado de la fracción de sedimento y medir la concentración total de proteínas de cada lisado usando un kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA). </li></ol></li><li> Mezclar 40 g de lisado con 4x SDS-PAGE de tampón de carga (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% de glicerol, ditiotreitol 100 mM, 0,1% Bromophenol azul). <ol><li> Hervir las muestras durante 10 minutos y correr las muestras en un 12,5% de desnaturalización SDS-PAGE a una tensión constante de 200 V. </li></ol></li><li> Transferir las proteínas separadas en SDS-PAGE a una membrana de nitrocelulosa utilizando la técnica de Western Blot (a un voltaje constante de 90 V durante 1 hora en frío). <ol><li> Bloquear la membrana con leche desnatada al 3% en 1 x PBS, y luego se incuba la membrana con soluciones de anticuerpos primarios diluidos (en este caso de conejo anti-VDAC3, conejo anti-γ-tubulina y el ratón anti-α-tubulina) durante 1 hr a RT. </li><li> Después de lavar la membrana tres veces (5 min cada incubación con agitación) usando tampón PBS-T (1x PBS y 0,2% Tween-20), incubar la membrana en una mezcla de infrarrojo cercano (IR) colorante fluorescente conjugado anti-conejo y tinte fluorescente IR anticuerpos secundarios anti-ratón conjugados (diluido en PBS-T) durante 1 hora. </li><li> Lavar la membrana tres veces y luego escanear la membrana para analizar las bandas utilizando un f infrarrojossistema de imágenes luorescence adecuado para la detección de inmunotransferencia. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Microscopía cuantitativa en biología celular se asocia comúnmente con los ensayos de formación de imágenes de células vivas, como Energía de Resonancia Fluorescente Transfer (FRET), la fluorescencia de recuperación después de photobleaching (FRAP), etc. Sin embargo, hay cada vez más ejemplos de los biólogos celulares en desarrollo diferentes ensayos de microscopía cuantitativos para fijo las células en los últimos años 27,34-36. Es importante destacar que, el progreso en la comprensión de la biología...

Los centrosomas consisten en un par de centriolos rodeados por el material pericentriolar (PCM). Siendo los principales centros organizadores de microtúbulos (COMT) en células de mamíferos, los centrosomas actúan como los dos polos de husos mitóticos en células en división, y por lo tanto ayudan a mantener la integridad genómica 1. En las células quiescentes (por ejemplo, durante la fase G0), uno de los dos centriolos del centrosoma, a saber, el centríolo madre, se transforma en un cuerpo basal de montar el cilio primario, un orgánulo sensorial que sobresale hacia fuera de la superficie de la célula 2. Una vez que las células vuelvan a entrar en el ciclo celular, los cilios primarios se desmonta y cada centríolo dirige el montaje de un procentriole en su extremo proximal que se alarga gradualmente para formar un centríolo madura 3. En el inicio de la fase S, una estructura de rueda de carro como que proporciona la simetría 9 veces a la centriolo se forma sobre la superficie de cada centríolo existente y se convertirá en la base de cada procentriole. SAS6 tsombrero es indispensable para el montaje es reclutado centríolo para formar el eje de la rueda de carro 4-6. Otras proteínas centriolares se ensamblan en la rueda de carro en un muy regulado, proximal a distal manera 7. Después de completar con precisión la duplicación centríolo, las células se ensamblan materiales pericentriolar adicionales para construir dos centrosomas funcionales para el final de la fase G2 8. Además de los componentes básicos centriolares 9-11, varias otras proteínas, incluyendo quinasas, fosfatasas, chaperones, los componentes de andamios, proteínas de membrana asociados y maquinaria degradación están asociados con centríolos, cuerpos basales y PCM en diferentes momentos del ciclo celular 12-16. A menudo se observó que los niveles centrosomales de muchas proteínas están temporalmente regulados por mecanismos de focalización centrosomales y / o la degradación proteasomal en centrosomas. Es importante destacar que las fluctuaciones en el nivel centrosomal de varias proteínas tales como PLK4, Mps1, SAS6, y CP110 unat diferentes puntos del ciclo celular parece ser crucial para regular el montaje centriolo 5,17-22, y en el caso de Mps1 la prevención de esta degradación centrosomal conduce a la formación de un exceso de 19 centríolos. Por otra parte, las fracciones centrosomales de varias proteínas son menos lábiles en comparación con piscinas citosólicas. Por ejemplo siRNA mediada baja regulación de Centrin 2 (Cetn2) llevó a sólo una disminución moderada del nivel de proteína en los centríolos pesar de la gran reducción en sus niveles de células enteras 23. Por tanto, es crucial para medir los cambios en el nivel de proteínas centrosomales en el centrosoma en lugar de medir el conjunto de los niveles de proteína celular al evaluar sus funciones centrosoma específico. En este estudio, hemos desarrollado un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para cuantificar el nivel relativo de una proteína en los centrosomas. Este ensayo se desarrolló especialmente para analizar células que son de diferentes muestrasy por lo tanto no puede ser reflejado al mismo tiempo. Estas muestras pueden ser células que fueron tratados con diferentes reactivos (es decir, las drogas versus control), recogidas en diferentes puntos de tiempo (es decir, el pulso frente a la persecución), o están en diferentes fases del ciclo celular. El principio de este ensayo radica en la medición de la intensidad fluorescente con corrección de fondo correspondiente a una proteína en una pequeña región y para normalizar dicho valor contra el mismo para otra proteína cuyos niveles no varían en las condiciones experimentales elegidas. Varios estudios en la biología del centrosoma han utilizado recientemente varias técnicas de microscopía cuantitativa, tanto en células vivas o fijas, para determinar la función del centrosoma específica de proteínas candidatas 24-27. Similares a los ensayos, la presente técnica también mide la corrección de fondo intensidad de fluorescencia de la proteína de prueba. Sin embargo, la inclusión de la normalización utilizando un patrón interno en este ensayo probablemente ofrecería mayorprecisión y confianza en el análisis de dos muestras diferentes que se encuentran en dos cubreobjetos diferentes. Por otra parte, además de examinar el nivel de proteína en los centrosomas, con ajustes menores este método se puede aplicar a un conjunto diverso de condiciones experimentales o en otros sitios celulares. Aquí, combinamos nuestro ensayo microscopía cuantitativa con una estrategia de pulso y persecución BrdU para comparar las células de las etapas del ciclo celular diferentes. En lugar de utilizar técnicas de detención del ciclo celular estándar y de liberación para estudiar diversos puntos de tiempo del ciclo celular, las células que crecen de forma asíncrona se incuban con BrdU para marcar las células en la fase S, y las células marcadas son perseguidos durante diversos tiempos (normalmente 4-6 horas). La mayoría de las células marcadas estarán en la fase S inmediatamente después del pulso. La longitud de la persecución se elige de manera que después de la caza, las células marcadas serán a finales de S, G2, o mitosis, que puede ser verificado por las características morfológicas, de posición AS- de centrosomas con respecto a nucLei, distancia entre los centrosomas, la condensación de cromosomas, etc. Por lo tanto, la longitud de la persecución depende de la duración media de S, G2 y la fase M de un tipo de célula particular. Dado que este enfoque evita inhibidores del ciclo celular, tales como hidroxiurea, afidicolina, nocodazol, etc., permite un análisis más fisiológicamente relevantes del ciclo celular. Por lo tanto, aquí demostrar que el ensayo de microscopía de fluorescencia cuantitativa solo, o en combinación con BrdU ensayo de pulso-caza, es una técnica simple pero potente para medir con precisión los cambios relativos en el nivel de una proteína centrosomal candidato durante un ciclo celular imperturbable. Se midió el nivel de centrosomal VDAC3, una proteína que se identificó recientemente en los centrosomas, además de las mitocondrias 16,28, el uso de estos ensayos. Los resultados obtenidos aquí verificar nuestra observación anterior de que la piscina centrosomal de VDAC3 está regulada por la degradación, y también varía en un dependen del ciclo celulart forma 16, además, la validación de la aplicabilidad de este método.

<table><tbody><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F8141</td><td>Stock de 1 mg/ml en agua</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma</td><td></td><td>SCP0005 Stock de 10 mM en DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Stock de 10 mM en DMSO</td></tr><tr><td>Anti-&#947;-tubulina (monoclonal de ratón, clon GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 en tampón de bloqueo IIF&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-VDAC3 (policlonal de conejo)&nbsp;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>1:50 en tampón de bloqueo IIF, 1:1.000 en tampón de bloqueo</td></tr><tr><td>WB Anti-Sas6 (monoclonal de ratón)&nbsp;</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-81431</td><td>1:100 en tampón de bloqueo</td></tr><tr><td>IIF Anti-Cep135 (policlonal de conejo)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 en tampón de bloqueo IIF</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (monoclonal de rata)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 en tampón de bloqueo IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 Cabra Anti-Rata IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A21093</td><td>1:200 en tampón de bloqueo IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21202</td><td>1:1.000 en IIF tampón</td></tr><tr><td>de bloqueo Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21203</td><td>1:1.000 en IIF tampón de bloqueo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21206</td><td>1:1.000 en IIF tampón de bloqueo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21207</td><td>1:1.000 en IIF tampón de bloqueo</td></tr><tr><td>Anti-&#947;-tubulina (policlonal de conejo)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1.000 en WB tampón</td></tr> <tr><td>de bloqueoAnti-&#945;-tubulina (monoclonal de ratón, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20.000 en tampón de bloqueo de WB</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Burro Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10.000 en tampón de bloqueo WB</td></tr><tr><td>IgG de ratón (H& L) Anticuerpo IRDye800CW Anticuerpos Rockland conjugados</td><td></td><td>610-731-002</td><td>1:10,000 en tampón de bloqueo WB</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Reagent &nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>Medios de montaje</td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondos 12CIR.-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Olympus IX-81</td><td>Cámara Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394 IR</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo de inmersión en aceite 100X Plan Apo</td><td>Apertura numérica</td><td>Olympus</td><td></td> 1.4</tr><tr><td>Paquete de software de diapositivas</td><td>Innovaciones en imágenes inteligentes Sistema de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>imagen IR Odyssey Li-cor</td><td>Biosciences Ensayo de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ácido bicinconínico (BCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Cubo</td> <td>UV estrechoFiltro Olympus</td><td>U-M622</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Cubo Azul Estrecho</td><td>Filtro Olympus</td><td>U-M643</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Cubo Verde Estrecho</td><td>Filtro</td><td></td> <td>Olympus U-M663</td></tr></tbody></table>

cuantitativa inmunofluorescencia ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Los centrosomas son pequeñas pero importantes orgánulos que sirven como los polos del huso mitótico para mantener la integridad genómica o ensamblar cilios primarios para facilitar las funciones sensoriales en las células. El nivel de una proteína puede ser regulada de manera diferente en los centrosomas que en otros lugares .cellular, y la variación en el nivel centrosomal de varias proteínas en diferentes puntos del ciclo celular parece ser crucial para la adecuada regulación de montaje centríolo. Hemos desarrollado un ensayo de microscopía de fluorescencia cuantitativa que mide los cambios relativos en el nivel de una proteína en los centrosomas en células fijadas de diferentes muestras, tales como en las diferentes fases del ciclo celular o después del tratamiento con varios reactivos. El principio de este ensayo radica en la medición de la intensidad fluorescente con corrección de fondo correspondiente a una proteína en una pequeña región, y normalizar que la medición contra el mismo para otra proteína que no varía bajo la c experimental elegidoondition. Utilizando este ensayo en combinación con pulso de BrdU y la estrategia de persecución para estudiar ciclos celulares no perturbadas, hemos validado cuantitativamente nuestra reciente observación de que la piscina centrosomal de VDAC3 está regulada a centrosomas durante el ciclo celular, probablemente por la degradación mediada por proteasoma específicamente a los centrosomas.

Nuestros estudios recientes identificaron novela localización centrosomal y la función de VDAC3, una de las porinas mitocondriales 16,28. La inmunotinción de varias células de mamíferos que incluyen células RPE1 utilizando un anticuerpo VDAC3 específica mostró prominente tinción centrosomal y comparativamente débil tinción mitocondrial. También demostramos que VDAC3 centrosomal se asocia preferentemente con el centríolo madre, y la piscina centrosomal tanto de la endógena y expresó ectópica VDAC3 está regulad...

Aquí, se desarrolla un novedoso ensayo de fluorescencia cuantitativa para medir los cambios en el nivel de una proteína, específicamente en los centrosomas, normalizando la intensidad de fluorescencia de esa proteína a la de un estándar interno apropiado.

Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los cambios relativos en el nivel de una proteína en los centrosomas en diversas condiciones. Por ejemplo, en un punto específico del ciclo celular después de la inhibición del proteasoma, esto se logra tratando primero las células que están creciendo en cubreobjetos con el inhibidor del proteasoma MG one 15 o con el solvente de control DMSO. A continuación, se añade inmediatamente BRDU a ambas células y se incuban durante cuatro horas en una incubadora de cultivos celulares.El segundo paso es transferir los cubreobjetos a una placa de 24 pocillos para fijar las celdas. A continuación, las células se tiñen con anticuerpos contra BRDU y las proteínas de interés, y luego con los anticuerpos secundarios correspondientes. El paso final es adquirir imágenes de células BRDU positivas utilizando un microscopio de fluorescencia y un software de imágenes digitales para aplicar un tiempo de exposición y una longitud del eje Z idénticos a las células de cada muestra.A continuación, se analizan las imágenes para cuantificar el nivel relativo de romal VDA C3. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia cuantitativa se utiliza para mostrar que el grupo somal Centro de VDA C3 se duplica cuando el proteasoma se inhibe durante la fase S. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la citometría de flujo, la inmunotransferencia o el microscopio cuantitativo, es que esta técnica analiza el nivel romal relativo de la proteína en dos muestras tratadas de manera diferente que se procesan en dos cubreobjetos diferentes. Este método utiliza la normalización a un estándar interno para controlar la necesidad de procesar las dos poblaciones de células experimentales.Por separado, este método puede proporcionar información sobre la regulación de proteínas específicas en los centrosomas. También se puede aplicar a otras situaciones, como otras estructuras subcelulares o el examen de grupos específicos de proteínas que se encuentran en múltiples sitios dentro de la célula. Para comenzar el experimento, el paso dos veces 10 al quinto crecimiento asincrónico de células RPE una en placas de 35 milímetros previamente preparadas con labios cúbicos y hacer crecer las células en dos mililitros de medio completo.Reemplace el medio de cultivo cada 24 horas con medio precalentado fresco después de 44 horas. Reemplace el medio de cultivo con un medio completo que contenga 0.05% DMSO o MG uno 15 a una concentración final de cinco micromolares, y simultáneamente agregue BRDU a las células a una concentración final de 40 micromolares e incube las células durante cuatro horas. A continuación, transfiera cada cubreobjetos a una placa de 24 pocillos.Agregue 500 microlitros de metanol previamente labrado a cada pocillo e incube la placa a menos 20 grados centígrados para fijar las celdas. Después de 10 minutos, lave inmediatamente los cubreobjetos tres veces con 500 microlitros de tampón de lavado. Incubar las células fijas en cubierta, deslizar 200 microlitros de tampón de bloqueo durante 30 minutos mientras las células se incuban.Prepare una cámara humidificada colocando una toalla de papel húmeda en la mitad inferior de una caja vacía de puntas de pipeta de 1000 microlitros. Coloque una tira de perfume en la superficie del estante y agregue una gota de 20 microlitros del anticuerpo de conejo anti V DDA tres y ratón anti gamma tubulina diluido en tampón de bloqueo sobre la paraforma. Después del bloqueo, invierta un cubreobjetos en cada gota de solución de anticuerpos.Asegúrese de que las celdas estén sumergidas y cierre la tapa de la caja de puntas. Incubar las células con anticuerpos primarios durante la noche a cuatro grados centígrados en la cámara humidificada. Invierta de nuevo los tirantes de la tapa y devuélvalos a la 24.Lave bien los cubreobjetos, luego incube en una solución de 150 microlitros de anticuerpos secundarios, diluidos en tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente Después de la incubación, lave los cubreobjetos tres veces con tampón de lavado. Fije el EPR teñido con 500 microlitros de metanol enfriado a menos 20 grados centígrados. Después de que las celdas se hayan fijado durante 10 minutos, lávelas tres veces en tampón de lavado.A continuación, incube las células en 200 microlitros de dos HCL normales durante 30 minutos. A temperatura ambiente, neutralizar las células con 300 microlitros de un molar tris CL pH ocho, y lavar las células tres veces. Con tampón de lavado, bloquee las celdas con 200 microlitros de tampón de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después del bloqueo, incubar las células con anticuerpo anti BRDU para ratas y tampón de bloqueo durante 45 minutos a 37 grados centígrados en la cámara humidificada. Regrese los comprobantes de la cubierta al 24. Lavar y lavar bien las células.A continuación, incubarlos con anticuerpo secundario diluido en 150 microlitros de tampón bloqueante. En un plato de 24 pocillos durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, lave los cubreobjetos tres veces con un punto XPBS, una gota de seis microlitros de una solución de montaje que contenga reactivo Antifa en un microscopio de vidrio.Deslice hacia adentro un cubreobjetos con el lado de la celda hacia abajo sobre la solución de montaje. Con un pañuelo de limpieza suave, presione suavemente el cubreobjetos contra el portaobjetos para eliminar el exceso de líquido y selle el cubreobjetos en el microscopio. Deslízalo aplicando esmalte de uñas a lo largo del borde del cubreobjetos.Utilice un objetivo de inmersión en aceite APO plano de 100 x con una apertura numérica de 1,4 para adquirir las imágenes de las células RPE positivas para BRDU a temperatura ambiente. Determine el plano focal superior e inferior adecuado a lo largo del eje Z con un tamaño de paso de 0,2 micras y adquiera imágenes a lo largo del eje Z. A continuación, realice la deconvolución de todas las pilas de imágenes adquiridas a lo largo del eje Z.Obtener la proyección de intensidad total de cada imagen. Apílelo a lo largo del eje Z para celdas cuyos centrosomas están separados por menos de dos micras. Dibuje un pequeño cuadrado de 20 a 30 píxeles por lado alrededor de ambos centrosomas y marque el área seleccionada.Dibuja un cuadrado más grande de 24 a 35 píxeles por lado alrededor del primer cuadrado y marca el área seleccionada del cuadrado grande. A continuación, obtenga el área y la intensidad de fluorescencia total de cada fluoro cuatro. En cada cuadro, calcule la intensidad de fluorescencia corregida de fondo de cada fluoro. Cuatro.Por último, se obtiene la intensidad de fluorescencia normalizada de VDA C3 calculando la relación entre la intensidad de fluorescencia corregida de fondo y su flúor. Cuatro a la de los fluoro cuatro utilizados para el estándar interno elegido, se capturaron imágenes de campos aleatorios de células RPE uno en crecimiento asíncrono incubadas con BRDU y el inhibidor del proteasoma MG one 15 o el solvente de control DMSO y mostraron ADN y BRDU. El fondo corrigió la intensidad de fluorescencia correspondiente al Centro Somal.VD 3 fue aproximadamente 2,5 veces mayor en las células tratadas con MG 15 que en las células de control, como se demuestra en este diagrama de caja y bigotes. Cuando los datos se normalizaron para la fluorescencia total de VD tres frente a la de la gamma tubulina, el pliegue aumentó, disminuyó ligeramente a aproximadamente el doble. La tinción de VD C3 en citos no romales o en el nivel celular total de VD tres no se vio afectada por la inhibición del proteasoma.Por lo tanto, el grupo romal de VDA C3 está regulado por la degradación mediada por proteasoma. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los anticuerpos contra la proteína de prueba y el estándar interno deben elevarse en diferentes especies de huéspedes y que las imágenes de ambas muestras deben adquirirse utilizando parámetros de imagen idénticos, como el número de cesáreas y los tiempos de exposición, para minimizar el efecto de las imágenes digitales.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

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Este protocolo describe un enfoque basado en la espectroscopia de la fluorescencia fluctuación para investigar las interacciones entre las proteínas median las interacciones célula-célula, es decir, proteínas localizadas en las ensambladuras de la célula, directamente en las células vivas. Ofrecemos directrices detalladas sobre la calibración del instrumento, adquisición de datos y análisis, incluyendo las correcciones a las fuentes de posible artefacto.

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

Describimos el uso de immunoblotting cuantitativa para validar la histología inmunofluorescencia juntada con análisis de la imagen como medio de cuantificación de la proteína de interés en muestras de tejido formalina-fijo, parafina-encajado (FFPE). Nuestros resultados demuestran la utilidad de la histología de la inmunofluorescencia para determinar la cantidad relativa de proteínas biomarcadoras en muestras de biopsia de rutina.

Immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina

Aquí, describimos un enfoque cuantitativo para determinar la distribución de una proteína sináptica en relación con un marcador proteico utilizando tinción de inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis basados en computadoras.

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Describimos un protocolo que utiliza la hibridación in situ por fluorescencia (FISH) para visualizar múltiples ARN herpesvirales dentro de células humanas infectadas lyéticamente, ya sea en suspensión o adherente. Este protocolo incluye la cuantificación de la fluorescencia produciendo una relación nucleocitotoplasmática y se puede extender para la visualización simultánea de proteínas huésped y virales con inmunofluorescencia (IF).

Fluorescencia cuantitativa en hibridación situ (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos genéticos específicos en células infectadas por KSHV

La ubicuidad CENP-A es un requisito importante para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de la dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular. Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación de la proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) etiquetada por EYFP.

Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)

Este método describe un protocolo de inmunofluorescencia y un canal de cuantificación para evaluar la distribución de proteínas con patrones de organización nuclear variados en linfocitos T humanos. Este protocolo proporciona orientación paso a paso, comenzando con la preparación de la muestra y continuando con la ejecución de análisis semiautomatizados en Fiji, concluyendo con el manejo de datos por parte de un cuaderno de Google Colab.

Una línea versátil para analizar los cambios dinámicos en los cuerpos nucleares en una variedad de tipos de células

Aprende a cuantificar niveles de proteína en centrosomas mediante inmunofluorescencia cuantitativa en células RPE1 fijas. Este ensayo normaliza la intensidad de fluorescencia a un estándar interno para comparar muestras procesadas separadamente.

Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

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