Name: Multi-fotón intracelular de sodio Imaging Combinado con Desembalado focal UV-mediada de glutamato en las neuronas CA1 Piramidal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprende a analizar la dinámica de sodio intracelular en neuronas CA1 del hipocampo mediante imagen multifotónica combinada con desencapsulación UV focal de glutamato. Este método permite estudiar señales iónicas en compartimentos celulares pequeños.

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Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación Alemana de Ciencias (DFG, Ro2327 / 6-1) a CRR Los autores desean agradecer a S. Durry y C. Rodrigo de asistencia técnica de expertos, y M. Dubbert (Laboratorio de Electrónica, Instituto Zoológico , Universidad de Colonia, Alemania) para obtener ayuda en la aplicación del controlador de la célula Pockels y el interruptor de HF.

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses. Los autores recibieron apoyo financiero que permite publicación de acceso abierto por Rapp optoelectrónicos (Wedel, Alemania), que produce un instrumento utilizado en el artículo de vídeo. La compañía no ha estado involucrada en los experimentos ni en el manejo de los datos ni en la escritura manuscrita.

El presente estudio muestra que SBFI es muy adecuado para formación de imágenes de dos fotones de los transitorios de sodio intracelulares en pequeños compartimentos celulares. Tiene que tenerse en cuenta, sin embargo, que la eficiencia cuántica de SBFI es más bien baja 15 y relativos cambios en la concentración de sodio son bastante pequeñas con actividad fisiológica. Por lo tanto, la medición de alta resolución de los transitorios de Na + en los procesos de finos es una tarea relativamente tedioso, y binning o promediación de varios ensayos puede ser necesario para obtener señales satisfactorios. Además, la cinética de los transitorios de sodio son sorprendentemente lenta, por lo que es obligatorio para grabar durante períodos de tiempo prolongados. Esta observación se corresponde con los de estudios anteriores, donde la caries monoexponencial de los transitorios de sodio en las dendritas neuronales y en los astrocitos se caracteriza por constantes de tiempo grandes descomposición en el intervalo de 10 segundos a temperatura ambiente 1,2,6. Por lo tanto los transitorios de sodio parecen ejercer un momento co mucho más lentourse y mucho más grandes constantes de tiempo de decaimiento, en comparación con los transitorios de calcio 16. Ponga a un lado estos inconvenientes, las imágenes de sodio ha demostrado ser una herramienta valiosa para la investigación de las propiedades fisiológicas de subdominios neuronales. Por ejemplo, las imágenes de sodio puede servir para controlar la actividad sináptica excitatoria en o cerca de las sinapsis activas. Debido esencialmente de sodio no está tamponada 8,17, transitorios de sodio inducida por la actividad están relacionadas linealmente a una amplia gama de la liberación de glutamato sináptico de glutamato o exógenamente aplicados. Ellos por lo tanto, representan indicadores directos e imparciales de la actividad glutamatérgica neuronal. Además, colorantes indicadores de sodio presentan una alta K d &#39;s (de SBFI K d está en el intervalo de 25 mM 1). Incluso en las concentraciones de colorante intracelulares relativamente altas usadas para lograr el brillo suficiente (generalmente 0,5-1 mM), el alto K d &#39;s implica que los propios tintes no actúan como amortiguadores para sodium. En consecuencia, no distorsionan el curso amplitud ni el tiempo de los transitorios de sodio, que es siempre una preocupación cuando tintes sensibles al calcio se introducen en las células 18. Por lo tanto, se puede suponer que las señales detectadas representan una buena medida de los cambios &quot;reales&quot; en sodio intracelular. Su evolución en el tiempo lento implica entonces que la velocidad para la difusión intracelular de sodio en las neuronas es mucho menor que anteriormente supone 19. Un requisito fundamental para la exitosa ejecución de los experimentos que abordan las propiedades de las vías de transmisión y de afluencia de sodio sinápticos excitatorios en espinas y dendritas es la inducción de una activación rápida y muy localizada de estructuras postsinápticas. Esto se puede conseguir mediante la aplicación rápida y local de glutamato o agonistas de glutamato en la vecindad directa de una columna o una dendrita por la fotolisis de flash de compuestos enjaulados. Fotólisis flash hace dama no mecánicamentege el tejido, está libre de artefactos de movimiento y está bien establecido para la investigación de cuestiones relacionadas (por ejemplo, la señalización de calcio local). El diámetro de la mancha uncaging fue de 1,5 micras en el plano xy. Uncaging cerca de una señal de sodio dendritas espinosas inducidas en las dos espinas y la dendrita padres. Considerando que las señales tendían a ser más grande en las espinas más cercanos al lugar uncaging, las amplitudes en la dendrita de los padres y espinas más lejos todavía eran bastante similares a aquellos en proximidad directa de la mancha uncaging. Uncaging se realizó durante 300 mseg durante el cual corrientes hacia el interior aumentaron en amplitud. Glutamato Uncaged podría haber difundido en el tejido durante el mismo período de tiempo, la activación de los receptores ionotrópicos de glutamato y la entrada de sodio en las regiones dendríticas y espinas más lejos del punto uncaging. Un problema intrínseco que se produce cuando se utiliza un láser UV para la fotólisis de compuestos enjaulados administrados a través de la solución de baño de célulases &#39;de filtrado interno&#39;. Debido a la alta tasa de absorción de la jaula, la luz UV se atenúa fuertemente a lo largo del camino desde el objetivo a la zona de estimulación 20,21. Una manera posible de evitar esto es la perfusión local con la jaula que se limita sólo a la zona de estimulación, lo que disminuye, además, la cantidad de compuesto necesaria enjaulado a un mínimo. En comparación con uncaging mediada por escaneo láser UV, cerca de infra-rojo de dos fotones uncaging 22 es espacialmente más precisa, principalmente debido a la precisión de la estimulación se incrementa en el eje z. Por otro lado, debido a la sección transversal pequeña de las jaulas comúnmente utilizados para longitudes de onda más largas como se emplea con excitación de dos fotones, ya sea una alta concentración del compuesto enjaulado o muy alta, se necesitan intensidades de luz potencialmente fototóxicas. Además, uncaging de dos fotones requiere una inversión mucho mayor en el equipo; entre otros, un láser IR adicional, más los componentes ópticos necesarios, se necesitan. Tanto SBFI y MNI-glutamato son excitables en el rango de longitud de onda idénticas. Esto puede conducir a una interdependencia involuntaria de láser UV uncaging y SBFI o láser de formación de imágenes IR y MNI-glutamato, lo que resulta en el blanqueo de SBFI por el flash uncaging y / o un uncaging continua de glutamato por el haz IR. Sin embargo, como se muestra en la Figura 6C, ni un destello UV por sí mismo ni la formación de imágenes de múltiples fotones causado tales efectos recíprocos en las condiciones experimentales. Sistemas UV en flash similar a la descrita aquí se utilizan de forma rutinaria en muchos otros laboratorios y pueden con relativa facilidad pueden incorporar en cualquier microscopio de imagen multi-fotón existente. Ofrece la ventaja de que el haz de láser para la fotólisis se puede colocar libremente en el campo de visión. Además, el sistema permite un reposicionamiento rápido y automatizado del haz de láser y el volumen de liberación, respectivamente, en el campo de visión durante un experimento. Our modificación simplifica y mejora el posicionamiento preciso del punto uncaging, de modo que los marcos de la formación de imágenes de software pueden servir para ajustar los marcos de imagen y uncaging congruentemente. Tomados en conjunto, de células enteras patch-clamp de sodio y de formación de imágenes multi-fotón en dendritas y espinas de las neuronas centrales, combinada con un procedimiento modificado para uncaging UV-inducida por la luz de glutamato, permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido. De este modo, puede servir para analizar las propiedades de la transmisión sináptica excitatoria y de señales de sodio en las neuronas postsinápticas en el tejido intacto.

Las recientes mejoras en técnicas microscópicas, tales como la microscopía de luz multi-fotón han permitido el estudio de parámetros morfológicos y fisiológicos de las células del cerebro en el tejido intacto con alta resolución espacial y temporal. Combinado con la electrofisiología, estas técnicas son ampliamente utilizados para analizar las señales eléctricas relacionadas con la actividad de las neuronas, así como las señales de calcio concomitantes en pequeños compartimentos subcelulares, es decir, en finas dendritas y espinas dendríticas. Además de los transitorios de calcio, la actividad sináptica también induce señales de sodio en las dendritas y espinas, las propiedades de las que son en gran parte inexplorado. Tales señales pueden ser analizados mediante formación de imágenes de dos fotones de sodio intracelular ([Na +] i), que permite la medición en línea de [Na +] i transitorios por períodos prolongados sin blanqueo tinte significativa o foto-daño 1,2. Para imágenes de i [Na +] </sub&gt;, sólo unos pocos colorantes indicadores químicos están disponibles, por ejemplo, Corona Verde o Asante Natrium Verde 3,4. La sonda fluorescente más comúnmente utilizado para obtener imágenes de Na + es isoftalato de benzofurano (SBFI) de unión de sodio. Es un radiométrica, colorante UV excitada similar a la conocida colorante sensible al calcio fura-2 y se ha empleado para formación de imágenes convencional Na + en muchos tipos de células (por ejemplo, 5,6). Hay diferentes posibilidades de excitar el colorante y la recogida de su fluorescencia. Si se requiere alta resolución temporal (es decir, una velocidad de fotogramas de imagen de alta) en combinación con la información espacial, SBFI puede ser excitado con una lámpara de arco de xenón o un diodo (LED) dispositivo emisor de luz de alta potencia y su emisión detectada con una carga de alta velocidad dispositivo-junto (CCD) 7,8 cámara. Para la resolución espacial máxima profundidad en el tejido, la microscopía de barrido láser multi-fotón es el método de elección 9. El efficie cuántica relativamente bajancy de SBFI requiere concentraciones relativamente altas de tinte (0,5-2 mM), y la carga directa de la forma de membrana impermeable de SBFI a través de un microelectrodo agudo 10 o parche pipeta 1. Usando SBFI, trabajo anterior realizado en cortes de tejido agudos de hipocampo de roedores demostró transitorios sodio relacionados con la actividad en las dendritas y espinas de las neuronas piramidales CA1 que son causadas principalmente por el influjo de sodio a través de receptores ionotrópicos NMDA 1,2. Para el estudio de las propiedades de dichas señales de sodio locales en más detalle, la activación específica de los receptores postsinápticos por aplicación de agonistas de los receptores es un método muy adecuado de elección. Para imitar la actividad presináptica y la liberación del transmisor, la aplicación debe ser relativamente breve y centrado para permitir la estimulación local. Esto, sin embargo, resulta ser bastante difícil en el tejido intacto. Aplicación de presión local de agonistas de los receptores utilizando una pipeta con punta fina permite ap muy focalplicatura, pero alberga el riesgo potencial para producir el movimiento de la estructura de interés (por ejemplo, como una dendrita o espinas dendríticas), y por lo tanto dificulta la proyección de imagen de alta resolución. La idoneidad de la iontoforesis de sustancias neuro-activo depende de sus propiedades eléctricas y las altas amplitudes de corriente puede producir artefactos celulares también. Una forma de soslayar estos obstáculos es el empleo de compuestos foto-activado y su fotólisis flash. Básicamente, dos principios diferentes se utilizan para la foto-activación de sustancias enjaulados: I) de campo amplio de flash fotólisis 11 y II) uncaging focal empleando módulos de análisis en combinación con el láser 12. Si bien en todo el campo de flash fotólisis se utiliza para activar las regiones más grandes de interés, por ejemplo, una célula entera, se emplea uncaging focal para estimular específicamente pequeños compartimentos celulares. En el presente estudio se demuestra un procedimiento para de células enteras patch-clamp y multi-pformación de imágenes de sodio Hoton en las dendritas y espinas de las neuronas centrales, combinada con un procedimiento modificado para uncaging inducida por luz UV de glutamato, que permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido.

<table><tbody><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>Hilgenberg</td><td></td><td>1405059 75 x 2 mm, espesor de pared 0,3 mm</td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>IR-DIC Cámara de</td></tr><tr><td>deconvolución</td><td>SVI</td><td>Huygens Pofessional X11</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de fibra óptica</td><td>Ocean Optics</td><td>USB 4000</td><td>Espectrómetro de fibra óptica en miniatura</td></tr><tr><td>Tubos de filtro</td>Filtro centrífugo <td>VWR</td><td></td><td>, 0,2 y micro; m</td></tr><tr><td>Software de imagen</td><td>Olympus Europe</td><td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de potencia de haz IR</td><td>Control de</td><td>intensidad de rayo láser personalizado + cambio rápido a cero en flyback a través de pockels cell</td>IR laser SpectraPhysics Mai-Tai fs-pulsado Ti:Sa láser sintonizable (710 - 990 nm);<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>Monitor de alimentación IR</td><td>Micromanipulador hecho</td><td></td><td></td>a medida</tr><tr><td>Burleigh</td><td></td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio/Sistema de imagen</td><td>Olympus Europe</td><td>BX51WI/FV300</td><td>Tanto el microscopio como los sistemas de imagen fueron fuertemente modificados</td></tr><tr><td>Rueda de filtro ND</td><td>Newport</td><td>50Q04AV.2</td><td>Sílice fundida UV, densidad óptica 0,05 - 2,0</td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de abrazadera de parche</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>Narishige</td><td>Modelo PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Sistema neumático de expulsión de fármacos</td><td>NPI Electronic</td><td>PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>Célula Pockels</td><td>Conoptics</td><td>350-80 LA-BK</td><td>EOM, utilizado como interruptor rápido y para el ajuste de potencia</td></tr><tr><td>Célula Pockels driver</td><td>Conoptics</td><td>M302-RM Amplificador diferencial de</td><td>alta tensión</td></tr><tr><td>Obturador</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>ALMgF2 recubierto de cuchillas BeCu Controlador de</td></tr><tr><td>obturador Controlador</td><td></td><td></td>de obturador hecho <td>a medida</td></tr><tr><td></td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz VCM D1</td><td></td></tr><tr><td>Rebanadora/Vibratome</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Software de desenjaulado</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td><td></td></tr><tr><td>Láser UV</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>cw DPSSL, 355 nm; 10 mW; PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>Sistema de escaneo láser UV</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>Sistema de escaneo galvanométrico</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre del compuesto</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios/ Descripción</fuerte></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-127</td><td>Antagonista del receptor AMPA; PRECAUCIÓN</td></tr>: <tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>antagonista del receptor NMDA; PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>SBFI K+ sal</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibidor de canales de Na+ dependientes de voltaje; PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>NMI-L-Glutamato,</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>Glutamato enjaulado liberado tras la absorción de rayos UV</td></tr></tbody></table>

multi-fotón intracelular de sodio imaging combinado con desembalado focal uv-mediada de glutamato en las neuronas ca1 piramidal

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Microscopía de fluorescencia Multi-fotón ha permitido el análisis de parámetros morfológicos y fisiológicos de las células del cerebro en el tejido intacto con alta resolución espacial y temporal. Combinado con la electrofisiología, se utiliza ampliamente para estudiar las señales de calcio relacionados con la actividad en pequeños compartimentos subcelulares tales como dendritas y espinas dendríticas. Además de los transitorios de calcio, la actividad sináptica también induce señales de sodio postsinápticos, las propiedades de los cuales son sólo marginalmente entendidos. Aquí se describe un método para su conjunto de células patch-clamp combinado y de imagen de sodio multi-fotón en celulares dominios micro de las neuronas centrales. Además, se introduce un procedimiento modificado para la ultra-violeta (UV) uncaging inducida -light de glutamato, que permite la activación fiable y focal de receptores de glutamato en el tejido. Para este fin, las grabaciones de células enteras se realizaron en Cornu Ammonis subdivisión 1 (CA1) neuronas piramidales en cortes de tejido agudos de lahipocampo del ratón. Las neuronas se llenaron con el colorante fluorescente SBFI sensible al sodio a través del parche pipeta, y multi-fotón de excitación de SBFI permitieron la visualización de las dendritas y espinas adyacentes. Para establecer uncaging focal inducida por UV, varios parámetros, incluyendo la intensidad de luz, volumen afectado por el haz uncaging UV, el posicionamiento de la viga así como la concentración del compuesto enjaulado fueron probados y optimizados. Nuestros resultados muestran que la perfusión local con glutamato enjaulado (MNI-glutamato) y su focal resultado-UV uncaging en corrientes hacia el interior y los transitorios de sodio en las dendritas y espinas. Transcurso de tiempo y la amplitud de las dos corrientes de entrada y las señales de sodio se correlacionan con la duración del impulso de uncaging. Además, nuestros resultados muestran que las señales intracelulares de sodio están bloqueados en presencia de bloqueadores para los receptores de glutamato ionotrópicos, lo que demuestra que están mediadas por la entrada de sodio, aunque esta vía. En resumen, nuestro método proporciona una herramienta fiable para lainvestigación de señales intracelulares de sodio inducida por la activación del receptor en el tejido cerebral focal intacto.

En el presente estudio, se demuestra un procedimiento para la microscopía de múltiples fotones de la dinámica de sodio celulares con el fluorescente SBFI colorante dependiente del sodio en las neuronas piramidales CA1 del ratón aguda cortes de tejido del hipocampo. Por otra parte, nos muestran cómo combinar esta técnica de imagen con uncaging basado escaneo láser de compuestos neuro-activa (por ejemplo, glutamato enjaulado) y su precisión extrema a la micro-dominios celulares. Cargando neuronas con SBFI a través de la pipeta patch-permitieron la visualización de toda la célula incluyendo finas dendritas y espinas adyacentes mediante el empleo de excitación multi-fotón (Figura 6A, B, D y la Figura 7a). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500"> Figura 6. señales de sodio y corrientes sinápticas inducidas por el flash fotólisis de glutamato enjaulado. (A) Maximimagen de proyección al de una neurona piramidal CA1 cargado con SBFI a través de la pipeta de parche (PP). El cuadro indica el área que se muestra ampliada en B. LP indica la posición y orientación de la pipeta para perfusión local de glutamato enjaulado. (B) de alta potencia de proyección máxima de una pila de secciones ópticas de una dendrita con espinas dendríticas adyacentes. Las pilas de secciones ópticas se sometieron z-alineación y deconvolución. La cruz roja indica que la región de orientación del haz uncaging. La línea de puntos naranja delimita la región de interés de la que se registró la emisión de fluorescencia. El cuadro indica el área que se muestra ampliada en D. (C) A la izquierda: la señal de sodio (fila superior) y somática corriente de entrada (fila inferior) inducida por el flash fotólisis de glutamato enjaulado (indicado por el flash de color amarillo). La línea roja representa un ajuste de los datos experimentales. El área gris representa el período en el que el flash uncaging (300mseg) obstruyó la obtención de imágenes de fluorescencia SBFI Derecha:. Sin pre-perfusión con glutamato enjaulado, la misma UV-flash ni evocó un cambio en la emisión de SBFI, ni una corriente hacia el interior (D) Izquierda:. Imagen de alta potencia de la dendrita y adyacentes espinas según lo delineado en B. Junto, la misma imagen con valores de gris invertidos. Las líneas punteadas indican las regiones de interés en la que se registró la emisión de fluorescencia. La cruz roja indica la localización del haz de uncaging Derecha:. Transitorios de sodio inducida por la radiación UV-flash fotólisis de glutamato enjaulado. Azul traza: señales de sodio en la dendrita; trazo rojo: la respuesta de tres espinas adyacentes al lugar uncaging promedio; verde rastro: la respuesta de tres espinas distantes promedio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para una versión más grande de esta figura.</a> Después de la perfusión local con enjauladoglutamato, la aplicación de un UV-flash cerca de una dendrita resultó en una disminución transitoria en la emisión de fluorescencia de SBFI, lo que refleja un aumento en la concentración de sodio intracelular (Figura 6C, D y la Figura 7B). Al mismo tiempo, una corriente hacia el interior se registró en el soma (Figura 6C y la Figura 7B). El aumento de la duración del destello UV resultó en el aumento de las amplitudes tanto de la provocada corrientes hacia el interior y las señales de sodio (datos no mostrados), lo que indica que el sistema estaba dentro de su rango dinámico y que las respuestas ni uncaging ni celulares se saturaron. Aplicación de un UV-flash de idéntica duración o más para rebanadas que no habían sido pre-perfundido con glutamato enjaulado, nunca provocó cambios en la fluorescencia SBFI ni corrientes hacia el interior, lo que indica que estas señales se deben a la uncaging de glutamato (Figura 6C). Por otra parte, estos resultados muestran que u no se observa la interdependencia de los componentes Imaging- y uncagingnder nuestras condiciones experimentales. Señales de sodio también puede ser detectada en las espinas dendríticas (Figura 6D). Mientras que no trató de lograr la estimulación de una sola columna sólo con uncaging glutamato, amplitudes máximas tendían a ser ligeramente superior en las espinas cerca del lugar uncaging, mientras que las espinas mostraron más lejos cambios de fluorescencia prácticamente idénticas a la dendrita padres (Figura 6D). Finalmente, se estudió la vía para la entrada de sodio en dendritas y espinas en respuesta a uncaging de glutamato. Para este fin, empleamos CNQX y APV, que son bloqueadores selectivos para los receptores de glutamato de sodio-permeable, ionotrópicos de la AMPA- y NMDA-subtipo, respectivamente. Nuestros resultados muestran que las señales de sodio intracelular inducida por glutamato y las corrientes provocadas somáticas se omitieron en la presencia de estos bloqueadores (Figura 7B). Tras lavado de los bloqueadores, las señales se recuperaron. Esto demuestra That uncaging de glutamato activa los receptores de glutamato ionotrópicos en las neuronas piramidales de CA1, que median el flujo de sodio en las dendritas y espinas, lo que resulta en los transitorios de sodio intracelular y corrientes hacia el interior. <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600"> Figura 7. perfil farmacológico de señales de sodio evocados y corrientes hacia el interior. (A) SBFI lleno de CA1 neurona piramidal con parche pipeta (PP) unido a la soma (B) Izquierda:. Transitoria de sodio y la corriente somática inducida por la foto-activación de glutamato enjaulado en una dendrita y espinas adjuntos Centro:. Perfusión con el bloqueadores de los receptores de glutamato ionotrópicos CNQX y APV inhibe tanto la señal de sodio y la corriente hacia el interior inducida por uncaging Derecha:. Tras lavado de los bloqueadores, las señales se restauran. Los represen línea rojact que un ajuste de los datos experimentales. El área gris representa el período en el que el flash uncaging (300 ms) obstruyó la obtención de imágenes de fluorescencia SBFI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para una versión más grande de esta figura.</a>

Se describe la combinación de focal foto-activación inducida por UV de compuestos neuroactivos con células enteras patch-clamp y las imágenes de múltiples fotones de los transitorios de sodio intracelulares en dendritas y espinas de las neuronas del hipocampo en cortes de tejido agudas del cerebro de ratón.

Multi-fotón intracelular de sodio Imaging Combinado con Desembalado focal UV-mediada de glutamato en las neuronas CA1 Piramidal

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

El objetivo general de este procedimiento es evocar y analizar la dinámica del sodio en pequeños compartimentos celulares, como las espinas y las dendritas de las neuronas centrales en el tejido intacto. Esto se logra preparando primero un corte agudo de hipocampo de ratón, cargando una neurona piramidal con el colorante fluorescente sensible al sodio SBFI a través de una pipeta de parche y visualizando la morfología celular mediante excitación multifotónica. Los siguientes pasos son elegir una dendrita espinosa para el experimento y Foley inyectar un compuesto fotoactivado, como el glutamato enjaulado, cerca de esta dendrita.A continuación, se aplica un destello UV al glutamato sin jaula de Foley utilizando un láser UV que se ha colocado con precisión para dirigirse a un pequeño volumen cerca de la dendrita elegida. El paso final es monitorear los cambios resultantes en la fluorescencia de SBFI en la dendrita y monitorear los cambios resultantes en el sodio en las espinas adyacentes. También se registran las corrientes de membrana que las acompañan.En última instancia, el uso de las herramientas farmacológicas adecuadas, como los bloqueadores de receptores, permitirá el estudio de los mecanismos que generan las señales de sodio intracelular evocadas. Este método proporciona una herramienta fiable para la investigación de las señales intracelulares de sodio en pequeños compartimentos celulares y en tejido cerebral intacto. Aquí combinamos la pinza de parche de célula completa y la obtención de imágenes de sodio multifotónico con un procedimiento modificado para el desenjaulamiento inducido por luz ultravioleta.Nos permite monitorear las respuestas celulares ante aplicaciones precisas y focales de compuestos neuroactivos. El procedimiento será demostrado por Karl KA y por Kaan Kleinhans, un estudiante de posgrado en mi laboratorio. Para comenzar la disección del tejido, coloque inmediatamente el cerebro en una placa de Petri con disección helada, líquido cefalorraquídeo artificial o un líquido cefalorraquídeo y diseccione un hemisferio realizando un corte sagital a lo largo de la línea media.Realice un segundo corte en la orientación deseada como superficie de bloqueo. A continuación, conéctalo a la etapa de corte de un vibram con superpegamento. Después de sacar la cámara de corte y el elemento de enfriamiento del vibram del congelador, coloque la etapa de corte con la sección de cerebro en la cámara.A continuación, coloque el elemento de enfriamiento en la cámara y sumerja el tejido en un líquido cefalorraquídeo A de disección helada. A continuación, corte 250 micrómetros de grosor. Para cortes sagitales del hipocampo con un viome.Asegúrese de que los fluidos de CS estén burbujeando en todo momento. Después de cortar, mantenga el tejido en una malla en un vaso de precipitados con un líquido cefalorraquídeo A normal e incube a 34 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, mantenga el tejido a temperatura ambiente.Este experimento debe realizarse en un entorno oscuro, pero se muestra aquí en condiciones de poca luz para fines de filmación. Para preparar primero el hardware, encienda los componentes del sistema multifotónico y ajuste la alineación del rayo láser infrarrojo como se describe en el protocolo de texto. A continuación, ajuste la longitud de onda del láser multifotónico y la intensidad del haz modificando la configuración de la célula pcal y los fotomultiplicadores.A continuación, encienda y calibre el sistema de desenjaulado colocando un portaobjetos de muestra fluorescente debajo de la lente del objetivo. Inicie la rutina de calibración del software de control de la unidad de desenjaulado. Ajuste el láser UV a varios puntos dentro de su rango de escaneo mientras la fluorescencia se captura con una cámara CCD haciendo clic en el punto láser UV.En cada punto, ajuste la posición de los espejos de escaneo galvánico para que correspondan a una determinada coordenada en el software. El posicionamiento preciso del punto de desenjaulado se logra importando una imagen del sistema de imágenes a través de una conexión de red entre las computadoras de desenjaulado y de imagen. Usando el software de captura de pantalla, lea continuamente los fotogramas del software de imágenes y ajuste las imágenes.Y una vez terminados, los fotogramas de jaula se exportan de forma congruente cada 10 fotogramas del software de imagen como imagen de referencia a la unidad de flash para garantizar un ajuste adecuado durante todo el experimento. A continuación, encienda los componentes de electrofisiología de los micromanipuladores y el dispositivo de aplicación de presión para la entrega del compuesto enjaulado a la región objetivo. Tire de las pipetas para la abrazadera de parche de celda completa y la profusión local utilizando capilares de vidrio de silicato de boro pulidos al fuego.A continuación, coloque la loncha en el baño experimental y, para fijarla con una rejilla, coloque el baño en la etapa del microscopio y perfunda permanentemente la rebanada con un líquido cefalorraquídeo A. Comience la fijación del parche de célula completa cargando la pipeta de parche con solución intracelular o ICS que contenga SBFI, luego cargue la pipeta de perfusión local con un compuesto enjaulado. Conecte las pipetas a los micromanipuladores correspondientes y coloque el electrodo de referencia en el baño.Elija una celda piramidal CA con un soma que se encuentre de 30 a 70 micrómetros por debajo de la superficie del corte para garantizar una morfología celular intacta, así como una baja dispersión y atenuación del haz de liberación. Acérquese a esta célula con una pipeta de parche que emplee microscopía de vídeo IR DIC. Aplique una succión suave hasta obtener un sello giga.Compensa la capacidad rápida. A continuación, rompe la membrana y abre la célula para obtener la configuración de la célula. Por último, evalúe la viabilidad de la célula en el modo de pinza amperimétrica.Inyecte una corriente despolarizante y verifique la actividad de aumento resultante para realizar imágenes y estimulación. En primer lugar, añada tetro DOIND a un CSF para evitar la activación de los canales de sodio dependientes de voltaje y la generación de potenciales de acción. Visualice la morfología celular mediante la excitación de múltiples fotones y la fluorescencia SBFI resultante.Elige una dendrita espinosa para el experimento. Acérquese para obtener imágenes a una resolución más alta y coloque un cuadro de clip alrededor de la dendrita. A continuación, coloque la pipeta con el compuesto enjaulado cerca de la dendrita.Coloque la pipeta para permitir una perfusión local eficiente de la dendrita elegida. Ajuste el láser de desenjaulado para colocar el punto de desenjaulado cerca de la estructura de interés. A continuación, establezca las regiones de interés en la dendrita elegida y las espinas adyacentes mediante un software de imágenes.Acérquese a la región de interés e inyecte el compuesto enjaulado durante varios segundos con parche de inicio de baja presión, pinza y registros de fluorescencia a través de la señal de activación. Durante la profusión local del compuesto enjaulado, el haz de excitación se atenúa por completo para evitar el blanqueo. A continuación, detenga la profusión local del compuesto enjaulado.A continuación, aumente la intensidad del láser de dos fotones para permitir una excitación eficiente de SBFI y aplique un flash UV para inicializar en el monitor de jaula los cambios en la fluorescencia de SBFI, así como la corriente somática, proceda a detener el registro después de que la fluorescencia de SBFI se haya recuperado a la línea de base. Para obtener la morfología, registre una pila XY, Z de la región del cuadro de clip establecida para las mediciones realizadas. Asegúrese de que esta pila esté sobremuestreada espacialmente para permitir una deconvolución óptima de la imagen y aumentar la calidad y la resolución de la imagen.La carga de neuronas con SBFI a través de la pipeta de parche permitió la visualización de toda la célula, incluidas las dendritas finas y las espinas adyacentes, mediante el empleo de excitación multifotónica después de la perfusión local con glutamato enjaulado. La aplicación de un destello UV cerca de una dendrita resultó en una disminución transitoria en la emisión fluorescente de SBFI, lo que refleja un aumento en la concentración de sodio intracelular. Al mismo tiempo, se registró una corriente interna en la aplicación de SOMA de un flash UV a las rebanadas, que no habían sido preperfundidas con glutamato enjaulado.Nunca provocaron cambios en la fluorescencia de SBFI ni en las corrientes internas que indiquen que estas señales se deben al enjaulamiento del glutamato. Las amplitudes de los picos fueron ligeramente más altas en las espinas cercanas al punto de desenjaulamiento, mientras que los patrones para las espinas posteriores se asemejaron a la dendrita madre. La vía para la entrada de sodio en las dendritas y espinas en respuesta al desenjaulamiento del glutamato se estudió utilizando bloqueadores selectivos para los receptores ionotrópicos de glutamato permeables al sodio, señales de sodio intracelulares inducidas por glutamato y las corrientes somáticas provocadas se omitieron en presencia de estos bloqueadores.Al lavarse los bloqueadores, se recuperan las señales, lo que demuestra que el desenjaulamiento del glutamato activa los receptores citotrópicos de glutamato en una neurona piramidal, lo que resulta en corrientes transitorias y entrantes de sodio intracelular. Al intentar este procedimiento, es importante recordar elegir la intensidad más baja posible para el láser infrarrojo para minimizar cualquier daño a la preparación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de los pasos críticos de nuestro enfoque experimental para estudiar la señalización de sodio en microrrestos celulares Una vez dominada, esta técnica permite obtener imágenes de alta resolución de la actividad evocada por las señales de iones intracelulares en el tejido intacto, que está libre de artefactos de movimiento introducidos por otras técnicas.

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Investigación

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Neurociencia

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