Multi-fotón intracelular de sodio Imaging Combinado con Desembalado focal UV-mediada de glutamato en las neuronas CA1 Piramidal

El objetivo general de este procedimiento es evocar y analizar la dinámica del sodio en pequeños compartimentos celulares, como las espinas y las dendritas de las neuronas centrales en el tejido intacto. Esto se logra preparando primero un corte agudo de hipocampo de ratón, cargando una neurona piramidal con el colorante fluorescente sensible al sodio SBFI a través de una pipeta de parche y visualizando la morfología celular mediante excitación multifotónica. Los siguientes pasos son elegir una dendrita espinosa para el experimento y Foley inyectar un compuesto fotoactivado, como el glutamato enjaulado, cerca de esta dendrita.

A continuación, se aplica un destello UV al glutamato sin jaula de Foley utilizando un láser UV que se ha colocado con precisión para dirigirse a un pequeño volumen cerca de la dendrita elegida. El paso final es monitorear los cambios resultantes en la fluorescencia de SBFI en la dendrita y monitorear los cambios resultantes en el sodio en las espinas adyacentes. También se registran las corrientes de membrana que las acompañan.

En última instancia, el uso de las herramientas farmacológicas adecuadas, como los bloqueadores de receptores, permitirá el estudio de los mecanismos que generan las señales de sodio intracelular evocadas. Este método proporciona una herramienta fiable para la investigación de las señales intracelulares de sodio en pequeños compartimentos celulares y en tejido cerebral intacto. Aquí combinamos la pinza de parche de célula completa y la obtención de imágenes de sodio multifotónico con un procedimiento modificado para el desenjaulamiento inducido por luz ultravioleta.

Nos permite monitorear las respuestas celulares ante aplicaciones precisas y focales de compuestos neuroactivos. El procedimiento será demostrado por Karl KA y por Kaan Kleinhans, un estudiante de posgrado en mi laboratorio. Para comenzar la disección del tejido, coloque inmediatamente el cerebro en una placa de Petri con disección helada, líquido cefalorraquídeo artificial o un líquido cefalorraquídeo y diseccione un hemisferio realizando un corte sagital a lo largo de la línea media.

Realice un segundo corte en la orientación deseada como superficie de bloqueo. A continuación, conéctalo a la etapa de corte de un vibram con superpegamento. Después de sacar la cámara de corte y el elemento de enfriamiento del vibram del congelador, coloque la etapa de corte con la sección de cerebro en la cámara.

A continuación, coloque el elemento de enfriamiento en la cámara y sumerja el tejido en un líquido cefalorraquídeo A de disección helada. A continuación, corte 250 micrómetros de grosor. Para cortes sagitales del hipocampo con un viome.

Asegúrese de que los fluidos de CS estén burbujeando en todo momento. Después de cortar, mantenga el tejido en una malla en un vaso de precipitados con un líquido cefalorraquídeo A normal e incube a 34 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, mantenga el tejido a temperatura ambiente.

Este experimento debe realizarse en un entorno oscuro, pero se muestra aquí en condiciones de poca luz para fines de filmación. Para preparar primero el hardware, encienda los componentes del sistema multifotónico y ajuste la alineación del rayo láser infrarrojo como se describe en el protocolo de texto. A continuación, ajuste la longitud de onda del láser multifotónico y la intensidad del haz modificando la configuración de la célula pcal y los fotomultiplicadores.

A continuación, encienda y calibre el sistema de desenjaulado colocando un portaobjetos de muestra fluorescente debajo de la lente del objetivo. Inicie la rutina de calibración del software de control de la unidad de desenjaulado. Ajuste el láser UV a varios puntos dentro de su rango de escaneo mientras la fluorescencia se captura con una cámara CCD haciendo clic en el punto láser UV.

En cada punto, ajuste la posición de los espejos de escaneo galvánico para que correspondan a una determinada coordenada en el software. El posicionamiento preciso del punto de desenjaulado se logra importando una imagen del sistema de imágenes a través de una conexión de red entre las computadoras de desenjaulado y de imagen. Usando el software de captura de pantalla, lea continuamente los fotogramas del software de imágenes y ajuste las imágenes.

Y una vez terminados, los fotogramas de jaula se exportan de forma congruente cada 10 fotogramas del software de imagen como imagen de referencia a la unidad de flash para garantizar un ajuste adecuado durante todo el experimento. A continuación, encienda los componentes de electrofisiología de los micromanipuladores y el dispositivo de aplicación de presión para la entrega del compuesto enjaulado a la región objetivo. Tire de las pipetas para la abrazadera de parche de celda completa y la profusión local utilizando capilares de vidrio de silicato de boro pulidos al fuego.

A continuación, coloque la loncha en el baño experimental y, para fijarla con una rejilla, coloque el baño en la etapa del microscopio y perfunda permanentemente la rebanada con un líquido cefalorraquídeo A. Comience la fijación del parche de célula completa cargando la pipeta de parche con solución intracelular o ICS que contenga SBFI, luego cargue la pipeta de perfusión local con un compuesto enjaulado. Conecte las pipetas a los micromanipuladores correspondientes y coloque el electrodo de referencia en el baño.

Elija una celda piramidal CA con un soma que se encuentre de 30 a 70 micrómetros por debajo de la superficie del corte para garantizar una morfología celular intacta, así como una baja dispersión y atenuación del haz de liberación. Acérquese a esta célula con una pipeta de parche que emplee microscopía de vídeo IR DIC. Aplique una succión suave hasta obtener un sello giga.

Compensa la capacidad rápida. A continuación, rompe la membrana y abre la célula para obtener la configuración de la célula. Por último, evalúe la viabilidad de la célula en el modo de pinza amperimétrica.

Inyecte una corriente despolarizante y verifique la actividad de aumento resultante para realizar imágenes y estimulación. En primer lugar, añada tetro DOIND a un CSF para evitar la activación de los canales de sodio dependientes de voltaje y la generación de potenciales de acción. Visualice la morfología celular mediante la excitación de múltiples fotones y la fluorescencia SBFI resultante.

Elige una dendrita espinosa para el experimento. Acérquese para obtener imágenes a una resolución más alta y coloque un cuadro de clip alrededor de la dendrita. A continuación, coloque la pipeta con el compuesto enjaulado cerca de la dendrita.

Coloque la pipeta para permitir una perfusión local eficiente de la dendrita elegida. Ajuste el láser de desenjaulado para colocar el punto de desenjaulado cerca de la estructura de interés. A continuación, establezca las regiones de interés en la dendrita elegida y las espinas adyacentes mediante un software de imágenes.

Acérquese a la región de interés e inyecte el compuesto enjaulado durante varios segundos con parche de inicio de baja presión, pinza y registros de fluorescencia a través de la señal de activación. Durante la profusión local del compuesto enjaulado, el haz de excitación se atenúa por completo para evitar el blanqueo. A continuación, detenga la profusión local del compuesto enjaulado.

A continuación, aumente la intensidad del láser de dos fotones para permitir una excitación eficiente de SBFI y aplique un flash UV para inicializar en el monitor de jaula los cambios en la fluorescencia de SBFI, así como la corriente somática, proceda a detener el registro después de que la fluorescencia de SBFI se haya recuperado a la línea de base. Para obtener la morfología, registre una pila XY, Z de la región del cuadro de clip establecida para las mediciones realizadas. Asegúrese de que esta pila esté sobremuestreada espacialmente para permitir una deconvolución óptima de la imagen y aumentar la calidad y la resolución de la imagen.

La carga de neuronas con SBFI a través de la pipeta de parche permitió la visualización de toda la célula, incluidas las dendritas finas y las espinas adyacentes, mediante el empleo de excitación multifotónica después de la perfusión local con glutamato enjaulado. La aplicación de un destello UV cerca de una dendrita resultó en una disminución transitoria en la emisión fluorescente de SBFI, lo que refleja un aumento en la concentración de sodio intracelular. Al mismo tiempo, se registró una corriente interna en la aplicación de SOMA de un flash UV a las rebanadas, que no habían sido preperfundidas con glutamato enjaulado.

Nunca provocaron cambios en la fluorescencia de SBFI ni en las corrientes internas que indiquen que estas señales se deben al enjaulamiento del glutamato. Las amplitudes de los picos fueron ligeramente más altas en las espinas cercanas al punto de desenjaulamiento, mientras que los patrones para las espinas posteriores se asemejaron a la dendrita madre. La vía para la entrada de sodio en las dendritas y espinas en respuesta al desenjaulamiento del glutamato se estudió utilizando bloqueadores selectivos para los receptores ionotrópicos de glutamato permeables al sodio, señales de sodio intracelulares inducidas por glutamato y las corrientes somáticas provocadas se omitieron en presencia de estos bloqueadores.

Al lavarse los bloqueadores, se recuperan las señales, lo que demuestra que el desenjaulamiento del glutamato activa los receptores citotrópicos de glutamato en una neurona piramidal, lo que resulta en corrientes transitorias y entrantes de sodio intracelular. Al intentar este procedimiento, es importante recordar elegir la intensidad más baja posible para el láser infrarrojo para minimizar cualquier daño a la preparación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de los pasos críticos de nuestro enfoque experimental para estudiar la señalización de sodio en microrrestos celulares Una vez dominada, esta técnica permite obtener imágenes de alta resolución de la actividad evocada por las señales de iones intracelulares en el tejido intacto, que está libre de artefactos de movimiento introducidos por otras técnicas.