Name: Los ensayos toxicológicos para efectos de prueba de un epigenética de Drogas sobre el Desarrollo, Fecundidad y Sobrevivencia de los mosquitos de malaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprende a evaluar los efectos del fármaco epigenético DZNep en el desarrollo, la fecundidad y la supervivencia de los mosquitos de malaria. Este método utiliza ensayos toxicológicos para el control de vectores.

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Agradecemos a Víctor Márquez por proporcionar DZNep.HCl y a Scotty Bolling por fabricar los alimentadores de sangre. Las cepas Mopti y SUA2La de An. gambiae se obtuvieron del Centro de Recursos de Investigación y Reactivos de Referencia contra la Malaria (MR4). Este trabajo contó con el apoyo del Instituto Fralin de Ciencias de la Vida y la subvención de los Institutos Nacionales de Salud 1R21AI094289 a Igor V. Sharakhov.

NOTA: Las tres partes del protocolo de describir la exposición acuosa del fármaco DZNep a los mosquitos, larvas de una exposición a base de sangre de DZNep a hembras adultas para estudiar su efecto de fecundidad, y la inhibición de hidrolasa SAH por DZNep midieron usando una técnica colorimétrica simple. Una representación esquemática de estos ensayos se muestra en la Figura 1. 1. inmaduros Mosquito Desarrollo y Sobrevivencia ensayos NOTA: En esta sección se explica el uso de un fármaco soluble en agua que afecta el desarrollo de larvas de mosquitos y la supervivencia. <ol><li> Hatch A. gambiae huevos a 28 ° C en agua destilada (dH2O) y trasera estadio las larvas a 2º. </li><li> Tome un DNAsa seis pocillos, RNAsa placa de cultivo celular libre y verter 10 ml dH2O a cada pocillo. </li><li> Seleccione las larvas de mosquitos en 2º instar y añadir 15 larvas por pocillo. Antes de añadir larvas 2ª a la placa, put en una toalla de papel para 2-3 segundos para eliminar el exceso de agua. </li><li> Pozos de etiquetas con las cintas con códigos de colores para aleatorizar experimento. Etiquetar 2 pocillos por concentración de ensayo en cada placa (Figura 2). </li><li> Preparar un hidrocloruro de 1 mM DZNep (PM = 298,73) solución madre disolviendo 0,3 mg DZNep en 1 ml de dH 2 O. Añadir solución madre de DZNep.HCl a los pocillos marcados para alcanzar una concentración final de 0,5 mM y 5,0 mM. NOTA: La solución madre se puede almacenar a 4 ° C para el corto plazo (1 día a un mes) o -20 ° C para el largo plazo (más de un mes). NOTA: La adición de la solución madre para las concentraciones antes mencionadas no va a cambiar el volumen de agua en los pozos de manera significativa. Sin embargo, en caso de concentraciones mucho más altas, es aconsejable para disolver el compuesto en el medio larval para evitar cualquier dilución innecesaria del compuesto. </li><li> Añadir la misma cantidad de alimento para peces de escamas a cada pocillo. Cubrir la placas y los incuban a 28 ° C en una incubadora. </li><li> Registre la mortalidad de las larvas de mosquitos DZNep-tratadas y sin tratar después de un período de exposición de 24 horas. Retire y deseche cualquier larvas muertas. Repita esta grabación todos los días hasta que todo larvas mueren o pupar y emerger como adultos. Registre el tamaño de las larvas de cada segundo día, es decir, días 0, 2, 4, 6, 8, hasta que se convierten en crisálidas. </li><li> Analizar el desarrollo y la mortalidad de larvas de datos utilizando un software de análisis estadístico adecuado. NOTA: Un gráfico de barras puede ser utilizado para representar los datos de mortalidad en Microsoft Excel. Análisis multivariado de varianza (MANOVA) realiza con un software tal como JMP o SPSS revelará si diferentes dosis de la droga como resultado significativamente diferente supervivencia de larvas de mosquitos. </li></ol> 2. La fecundidad de ensayo mediante la administración de drogas a través del alimentador artificial a Femeninos mosquitos NOTA: En esta sección se detalla la adición del fármaco a la sangre unnd de dársela a los mosquitos hembras adultas utilizando un sistema de alimentación artificial. <ol><li> Configure jaulas de mosquitos adultos con igual número de mosquitos machos y hembras para el control y la caja de prueba. Proporcionar una solución de azúcar al 10% impregnado en las bolas de algodón a ambos las jaulas hasta que las hembras están listas para la alimentación (3-5 días es óptimo para Anopheles gambiae). </li><li> 2 horas antes de la alimentación de la sangre, eliminar las bolas de algodón para garantizar hembras tienen hambre. </li><li> Montar dos alimentadores sanguíneos artificiales que consisten en un embudo invertido amplia fondo de vidrio (diámetro = 50 mm, longitud = 70 mm) y un plástico que rodea sellado con pegamento industrial. Conecte los tubos de plástico (diámetro = 7 mm) para dos salidas alimentadores &#39;(diámetro = 10 mm) a través de conectores para entrada y salida de agua. Etiquetar los dos alimentadores como &quot;Control&quot; y &quot;5 mM DZNep.&quot; </li><li> El uso de un elemento de calefacción disponible en el mercado, configurar el programa para la alimentación. En &quot;Menú&quot; ir a &quot;Configuración&quot;y seleccione &quot;Consignas&quot;; aparecerán los programas precargados. Seleccione &quot;SP1&quot; y ajustar la temperatura de 37 ° C. NOTA: El elemento de calentamiento asegura que la sangre administrada se mantiene a una temperatura constante. Ajustes adicionales de programa pueden ser utilizados para diferentes especies de mosquitos o insectos. </li><li> Llene un cubo con agua y sumergir el elemento de calefacción en el agua. </li><li> Corte un pedazo cuadrado de Parafilm (50 mm x 50 mm) y se extienden para hacer una película delgada membranosa. Cubrir el fondo de los alimentadores artificiales con el Parafilm. Corte otro pedazo de Parafilm (50 mm x 10 mm), estirar y sellar los bordes de los alimentadores. </li><li> Ensamblar el sistema, la conexión de los alimentadores y elemento de calentamiento por los tubos. Una vez terminado, encienda el sistema y seleccione &quot;SP1&quot;. Pulse el botón &quot;Enter&quot; para iniciar el sistema. NOTA: El agua se calienta a conseguir 37 ° C y se mantiene a esa temperatura. </li><li> Monitorear ªtemperatura e de agua usando un termómetro en el cubo de agua. NOTA: Los conectores y tubos ayudan a mantener una circulación constante de agua a través del sistema de modo que la temperatura de la sangre se mantiene en 37 ° C. </li><li> Llene una bandeja de fondo plano con una solución de lejía al 10% que será utilizado para descontaminar cualquier derrame de sangre. </li><li> Añadir 2 ml de sangre de oveja desfibrilar a un tubo de microcentrífuga. Etiquetar esto como &quot;Control&quot;. Repita el proceso para el tubo experimental etiquetado como &quot;5 mM DZNep&quot; .Add 6 l de solución madre DZNep (véase el paso 1.5) en el tubo experimental llamado &quot;5 mM DZNep&quot; Mezclar suavemente la sangre y drogas invirtiendo varias veces. Incubar el tubo 10 min a TA. </li><li> Con una pipeta, añadir 2 ml de control y análisis de sangre a la parte superior de los alimentadores correspondientemente etiquetados. Deseche la pipeta en la solución de cloro. Cubra la jaula con una bolsa oscura y respirar aire en jaula periódicamente para fomentar females para la alimentación. </li><li> Deje que los mosquitos se alimentan durante aproximadamente 30 min. Una vez que se haya completado la alimentación, apague el elemento calefactor, tomar los alimentadores y pelar el Parafilm. Remoje el alimentador en la solución de lejía durante unos 5 minutos y enjuagar bien con agua desionizada. </li><li> Quite los alimentadores y poner las bolas de algodón con agua de azúcar en las jaulas durante 48 horas. Publicar un plato de huevos que contiene agua y papel de filtro en las jaulas durante la noche para facilitar la puesta de huevos. Etiqueta de cada plato de huevos con la respectiva concentración de ensayo o de control. </li><li> Retire el plato de huevos al día siguiente y examinar el número y la estructura de los huevos en un microscopio estéreo. Obtener imágenes mediante el software Q-colors5. Cuente el número de huevos. Analizar la diferencia en el número de huevos obtenidos de jaulas de ensayo y de control. NOTA: Una prueba t no pareada se puede utilizar para determinar si el número de huevos son significativamente diferentes (p ≤0.05). </li></ol> 3. Ensayo bioquímico de Mosquito Enzyme Inhibitionpor Drogas NOTA: En esta sección se describe un ensayo de actividad enzimática utilizando DTNB como indicador para determinar el efecto de DZNep sobre la inhibición hidrolasa SAH en machos adultos y hembras de los mosquitos. <ol><li> Preparar un M Na 2 HPO 4 solución (fosfato de sodio dibásico) 0,1 mediante la adición de 14,19 g de Na 2 HPO 4 a 1 l de dH 2 O. A continuación, preparar un M NaH 2 PO 4 solución (fosfato de sodio monobásico) 0,1 mediante la adición de 13,79 g de NaH 2 PO 4 a 1 l de dH 2 O. </li><li> Valorar el M Na solución 0,1 2 HPO 4 con el 4 solución 0,1 M NaH 2 PO a pH 8,5. NOTA: Este será la solución madre de trabajo de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Preparar una solución de homogeneización de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) mediante la adición de 0,3% Triton X-100. NOTA: La solución de homogeneización se puede almacenar a 4 ° C. </li><li> Prepare un 1,6 mM SAH (PM = 384,4) solución disolviendo 6,15 mg de HSA en 10 ml de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Preparar una solución 1,6 mM DTNB (PM = 396,4) disolviendo 6,3 mg de DTNB en 10 ml de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Mantenga la solución DTNB fresco en hielo hasta su uso. </li><li> Preparar una solución 1 mM DZNep.HCl (PM = 298,73) disolviendo 0,3 mg de DZNep en 1 ml de dH2O A continuación, se diluye la solución 1 mM DZNep en una serie de concentraciones de 1,000 M a 0,002 mM en dH 2 O. </li><li> Para medir la inhibición de hidrolasa SAH por DZNep, preparar un extracto de enzima en bruto de mosquitos: Homogeneizar 10 mosquitos adultos no sanguíneos alimentado en 1 ml de helado 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), que contiene 0,3% de Triton X- 100, utilizando un homogeneizador de tejidos de vidrio. Transferir el homogenado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar el homogeneizado durante 5 min a 10.000 xg a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un limpia1,5 ml tubo de microcentrífuga. Utilice el sobrenadante como la fuente de enzima para el ensayo bioquímico SAH. </li><li> Para el tratamiento en blanco (es decir, no DZNep, sin enzima), añadir 50 l mM SAH 1,6, 50 mM DTNB 1,6 l, y 100 l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) a los pocillos individuales de una de 96 pocillos, microplaca de fondo plano. </li><li> Para el control (es decir, no DZNep), añadir 50 l mM SAH 1,6, 50 mM DTNB 1,6 l, 50 l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) y 50 l de la enzima (SAH hidrolasa obtiene a partir de extracto bruto) para el individuo pozos. </li><li> Para los tratamientos DZNep, añadir 50 l mM SAH 1,6, 50 mM de DTNB 1,6 l, seleccionado concentración DZNep 50 l enzima y 50 l a pocillos individuales. Preparar 4 réplicas por tratamiento y control. </li><li> Leer la densidad óptica (OD) de las muestras de enzima SAH a 405 nm durante 5 minutos a intervalos de 20 seg usando un lector de microplaca de 96 pocillos. </li><li> Reste la DO en blanco del control de unnd tratamiento DO obtenida de cada pocillo. Se calcula el porcentaje restante actividad hidrolasa SAH usando la siguiente ecuación:% de actividad residual = (OD Tratamiento / Control OD) x 100. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios pasos vitales para la aplicación exitosa de este protocolo. Para el ensayo de las larvas, se debe tener cuidado para etiquetar y replicar cada concentración de ensayo correctamente. La aleatorización de las muestras de ensayo y la adición de la cantidad designada de fármaco a los pocillos de ensayo respectivos es una parte importante de este montaje experimental. Antes de añadir 2º larvas de mosquitos instar a una microplaca de 96 pocillos, cada larva se puede poner en una toalla de papel para 2-3 ...

La malaria es responsable del mayor número de muertes relacionadas con insectos en el mundo. Se estima que unos 219 millones de casos cada año se producen en todo el mundo, lo que resulta en aproximadamente 660.000 muertes, principalmente en África 1. A pesar de los esfuerzos concertados, programas contra la malaria se enfrentan a varios retos. Mientras que los mosquiteros tratados con insecticida y componentes clave formulario pulverización residual del programa, la resistencia a los insecticidas en poblaciones locales impiden estos esfuerzos 2. El rápido aumento de las poblaciones de mosquitos resistentes a los insecticidas se atribuye en gran medida a la capacidad de los mosquitos de la malaria para adaptarse rápidamente a los cambios en su entorno y explotar nichos diferentes 3,4,5. Para superar los actuales mecanismos de resistencia a los insecticidas, la exploración de nuevos objetivos insecticidas y compuestos de la próxima generación se justifica. Un protocolo simple, paso a paso para determinar la eficacia de los insecticidas experimentales sobre las diversas etapas de la vida de la malaria mosquitoes mejorarían significativamente estos esfuerzos. Los estudios farmacológicos de efectos del fármaco sobre las líneas celulares y modelos animales han establecido el uso de fármacos epigenéticos como una herramienta útil para la modulación de la genética y la fisiología de las células y los organismos. Metilación del ADN y modificación de las histonas son dos mecanismos epigenéticos que afectan la expresión génica en los organismos multicelulares sin cambiar la secuencia de ADN subyacente 6. Las modificaciones post traduccionales como la metilación juegan un papel crucial en el mantenimiento de la integridad celular y la expresión génica, y pueden afectar a varios procesos fundamentales 7,8,9. Investigación en algunas especies de insectos han puesto de relieve la importancia de la epigenética en procesos que implican la ovogénesis y células madre de mantenimiento 10, así como la compensación de dosis 11. Sin embargo, están todavía por explorar esos aspectos en los vectores de enfermedades. El uso de un compuesto para modular este sistema en los mosquitos puede proporcionarnos enmonumentos en las nuevas vías de destino insecticida. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) es un inhibidor de la metilación de la histona conocido, que impacto en diversos tipos de cánceres se han estudiado 12,13,14,15,16. DZNep es un fármaco soluble en agua estable epigenética que inhibe indirectamente la lisina de la histona metiltransferasa N (EZH2), un componente del complejo represivo polycomb 2 (PRC2) en células de mamífero. PRC2 juega un papel importante en la regulación del crecimiento de las células madre en los organismos multicelulares, y la metilación de la histona es un aspecto clave de la PRC2 mediada por silenciamiento génico. En ratones inmunodeprimidos, las células pre-tratadas con DZNep han demostrado ser menos tumorígena 17. Esta droga se está utilizado para el estudio de otras enfermedades, como la enfermedad de hígado graso no alcohólico, en el que está implicado EZH2 18. DZNep es un establecido S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) inhibidor hidrolasa 19, 20. La inhibición de los resultados de SAH hidrolasa en unaacumulación de SAH y, a su vez, conduce a la inhibición de la actividad metiltransferasa mediante la limitación de los grupos de donantes de metilo disponibles. SAH es un derivado de aminoácido utilizado por muchos organismos, incluyendo los insectos, en sus vías metabólicas. Un estudio reciente ha demostrado que DZNep en dosis bajas pueden afectar la diapausa y retrasar el desarrollo de insectos 21. Aquí, un protocolo robusto para investigar los efectos de un compuesto soluble en agua en varias etapas de la vida de los mosquitos se desarrolla. Las tres partes de este protocolo incluyen instrucciones para examinar los efectos de un compuesto soluble en agua sobre los mosquitos inmaduros, adultos hembras se alimentan de sangre, y la actividad enzimática de adulto de sexo masculino y los mosquitos hembra. En primer lugar, DZNep se disuelve en agua para estudiar el desarrollo de mosquitos inmaduros y la supervivencia. Esto se realiza a dos concentraciones para comparar las diferencias que surjan de aumento de 10 veces en la exposición al fármaco. Para explorar el efecto de las drogas en adultos hembras de los mosquitos, DZNepse añade a sangre de oveja desfibrilación y alimentados artificialmente la sangre a las hembras. Posteriormente, se examina el resultado de la droga sobre la fecundidad. Finalmente, un ensayo de actividad enzimática se realiza usando 5,5&#39;-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) como un indicador para determinar el efecto de DZNep en la inhibición de hidrolasa SAH en machos adultos y hembras de los mosquitos. Mientras que este protocolo se desarrolla con un mosquito de la malaria, Anopheles gambiae, puede ser fácilmente adaptado al estudio de los efectos de los compuestos de interés en cualquier especie de mosquito u otros insectos. Las técnicas que se detallan en este protocolo no se pueden aplicar de manera eficiente a un fármaco con poca o ninguna solubilidad en agua o medios acuosos.

<table><tbody><tr><td>Microplaca de 96 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall Fresco 76003758</td><td></td><td>Se puede utilizar una centrífuga diferente</td></tr><tr><td>Rollos de cinta de colores</td><td>Fisher</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>Sigma Aldrich SMLO305</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hueveras Papeles de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtro</td><td>Fisher</td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>Alimentadores de vidrio</td><td>Virginia Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td></td><td></td><td></td>de tejidos de vidrio</tr><tr><td>Elemento calefactor</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Percival scientific</td><td>I36VLC8</td><td>Se puede utilizar una incubadora diferente</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga, 2&nbsp; ml</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga, 1,5&nbsp; ml</td><td>Micropipeta Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-8643</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH&nbsp;</td><td>Mettler Toledo 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>tienda en -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

los ensayos toxicológicos para efectos de prueba de un epigenética de drogas sobre el desarrollo, fecundidad y sobrevivencia de los mosquitos de malaria

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Resistencia insecticida plantea un problema importante para los programas de control de la malaria. Los mosquitos se adaptan a una amplia gama de cambios en el entorno rápidamente, haciendo la malaria controlar un problema omnipresente en los países tropicales. La aparición de poblaciones resistentes a los insecticidas garantiza la exploración de nuevas vías objetivo de drogas y compuestos para el control del mosquito vector. Fármacos epigenéticos están bien establecidos en la investigación del cáncer, sin embargo, no se sabe mucho acerca de sus efectos sobre los insectos. Este estudio proporciona un protocolo sencillo para el examen de los efectos toxicológicos de 3-Deazaneplanocin A (DZNep), un fármaco epigenético experimental para el tratamiento del cáncer, en el vector de la malaria, Anopheles gambiae. Se observó un aumento dependiente de la concentración de la mortalidad y disminución en el tamaño en los mosquitos inmaduros expuestos a DZNep, mientras que el compuesto reduce la fecundidad de mosquitos adultos en relación con los tratamientos de control. Además, hubo una disminución dependiente de la droga en S -adenosilhomocisteına (SAH) la actividad hidrolasa en los mosquitos tras la exposición a DZNep en relación con los tratamientos de control. Estos protocolos proporcionan al investigador un procedimiento simple, paso a paso para evaluar varios puntos finales toxicológicos para una droga experimental y, a su vez, demuestran un enfoque único multi-conductor se utiliza para explorar los efectos toxicológicos de drogas o compuestos de epigenéticos solubles en agua intereses contra los mosquitos vectores y otros insectos.

La Figura 1 es una representación esquemática de los ensayos; que describe las diversas etapas del procedimiento indicado en este artículo. A medida que el protocolo se basa en diferentes etapas de la vida de los mosquitos, no hay una secuencia particular que deba seguirse para los experimentos se detallan aquí. El usuario puede elegir para llevar a cabo uno o más ensayos al mismo tiempo, dependiendo de la disponibilidad de la muestra. La figura 2 mue...

Se desarrolla un protocolo para examinar los efectos de un fármaco epigenético DZNep en el desarrollo, la fecundidad y la supervivencia de los mosquitos. Aquí describimos los procedimientos para la exposición acuosa de DZNep a mosquitos inmaduros y una exposición sanguínea de DZNep a mosquitos adultos, además de medir la inhibición de la hidrolasa SAH.

Los ensayos toxicológicos para efectos de prueba de un epigenética de Drogas sobre el Desarrollo, Fecundidad y Sobrevivencia de los mosquitos de malaria

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

El objetivo general del siguiente experimento es examinar los efectos de un fármaco epigenético en varias etapas de la vida de los mosquitos de la malaria. Esto se logra disolviendo el medicamento en el hábitat de mosquitos inmaduros para determinar sus efectos sobre las larvas, la supervivencia y el tamaño corporal. El fármaco también se añade a la sangre de los mamíferos y se alimenta a los mosquitos hembra adultos, que probarán el efecto del fármaco en la reproducción.Finalmente, se lleva a cabo un ensayo enzimático para probar la inhibición de la enzima del mosquito por el medicamento. Los resultados muestran los efectos de los cambios epigenéticos en la supervivencia del mosquito de la malaria y para Conti, en base al análisis de bioensayos, primero tuvimos la idea de este protocolo. Cuando nos enteramos de que se está desarrollando como un prometedor fármaco epigenético contra el cáncer, este fármaco induce la muerte apoptótica en las células cancerosas humanas como un mecanismo para la modificación de la histo son animales hormonales conservados, probamos como una aplicación de efecto en el mosquito de la malaria.Para comenzar, seleccione las larvas de mosquito Novelis Gambi en segundo lugar en estrella y colóquelas sobre una toalla de papel durante dos o tres segundos para eliminar el exceso de agua. Luego agregue suavemente 15 larvas por pocillo de una placa de cultivo celular libre de nucleasa de seis pocillos que contenga 10 litros de agua destilada por pozo. Etiquete los pocillos con cintas codificadas por colores para aleatorizar el experimento.A continuación, etiquete dos pocillos por concentración de prueba en cada placa. A continuación, prepare una solución madre de clorhidrato de NEP deasy de un milimolar disolviendo 0,3 miligramos de deasy nep. En un mililitro de agua destilada, agregue la solución madre de clorhidrato Z NEP a los pocillos marcados para lograr una concentración final de 0,5 micromolares y 5,0 micromolares.La adición de la solución madre para las concentraciones antes mencionadas no cambiará significativamente el volumen del agua en el pozo. Sin embargo, en caso de concentraciones mucho más altas, es aconsejable disolver el compuesto en el medio de la larva para evitar cualquier dilución innecesaria del compuesto. Después de la adición del compuesto, alimente e incube las larvas durante 24 horas a 28 grados centígrados.A continuación, registre la mortalidad de las larvas de mosquitos DZ NEP tratadas y no tratadas. Repitiendo esta grabación todos los días hasta que todas las larvas mueran o pupan y emerjan. Cuando sean adultos, retire y deseche las larvas muertas todos los días.Además, registre el tamaño de las larvas cada dos días hasta que se paten, para realizar el ensayo de fecundidad. Primero, ensamble el sistema de alimentación artificial conectando los alimentadores y el elemento calefactor por los tubos. Una vez completado, encienda el sistema y seleccione SP uno.Pulse Intro para iniciar el sistema. Controle la temperatura del agua usando un termómetro digital en el sistema de calefacción. Los conectores y tubos ayudan a mantener una circulación constante de agua a través del sistema, por lo que la temperatura de la sangre se mantiene.A 37 grados centígrados. Llene una bandeja de fondo plano con una solución de lejía al 10% que se utilizará para descontaminar cualquier derrame de sangre. A continuación, añada dos mililitros de sangre de oveja desfibrilada a un tubo de microcentrífuga y etiquételo como control.Repita el proceso para el tubo experimental marcado como cinco micromolares DZ nep. A continuación, añada seis microlitros de solución madre DZ NEP al tubo experimental marcado con cinco micromolares DZ nep. Mezcle suavemente la sangre y el medicamento invirtiéndolo varias veces antes de incubar el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente.Con una pipeta, agregue dos mililitros de control y analice la sangre en la parte superior de los comederos etiquetados correspondientemente. Desechar la pipeta en la solución de lejía. Respire aire en la jaula periódicamente para alentar a las hembras a alimentarse.Cubre la jaula con una bolsa oscura. Deje que los mosquitos se alimenten durante aproximadamente 30 minutos. Una vez finalizada la alimentación, apague el elemento calefactor.Saque los comederos y retire la película para después de remojar el alimentador y la solución de lejía durante cinco minutos. Enjuague bien con agua desionizada. A continuación, coloque bolas de algodón con agua azucarada en las jaulas durante 48 horas.Coloque en las jaulas durante la noche platos de huevos etiquetados con la respectiva concentración de prueba o control que contengan agua y papel de filtro. Para facilitar la puesta de huevos, retire el plato de huevos al día siguiente y examine el número y la estructura de los huevos bajo un microscopio estereoscópico. Obtención de imágenes, contar el número de huevos y analizar la diferencia en el número de huevos obtenidos de las jaulas de prueba y control.Esta parte del video muestra un ensayo de actividad enzimática utilizando DTNB como indicador para determinar el efecto de dz NEP en la inhibición de SAH Hydro Lace en mosquitos adultos. Para medir la inhibición de SAH Hydro Lace por DZ nep, prepare extracto enzimático acumulado de mosquitos homogeneizados 10 mosquitos adultos no alimentados con sangre en un mililitro de fosfato de sodio mono básico 0.1 molar helado que contiene 0.3% tritton X 100. Con un homogeneizador de tejido de vidrio, transfiera el homogeneizado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Después de centrifugar el homogeneizado durante cinco minutos a 10.000 g y cuatro grados centígrados, transfiera el supinato a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros. Utilice el supinato como fuente de enzimas para el ensayo bioquímico de SAH. Para el blanco, agregue 50 microlitros de SAH, 50 microlitros de DTNB y 100 microlitros de fosfato de sodio diba para hacer una mezcla maestra y agregar a los pocillos individuales de una microplaca de fondo plano de 96 pocillos.A continuación, para el control, agregue 50 microlitros de SAH, 50 microlitros de DTNB, 50 microlitros de fosfato de sodio diba y 50 microlitros de enzima de encaje hidráulico SAH a los pozos individuales. Finalmente, para los tratamientos DZ NEP, agregue 50 microlitros de ATH, 50 microlitros de DTNB, 50 microlitros de enzima y 50 microlitros de la concentración seleccionada de DZ NEP a los pocillos individuales. Prepárese para las réplicas por tratamiento y control.Lea la densidad óptica o OD de las muestras de enzima SAH a 405 nanómetros durante cinco minutos a intervalos de 22 utilizando un lector de microplacas de 96 pocillos. Finalmente, se resta la DO en blanco del control y tratamiento obtenido de cada pozo y se calcula el porcentaje de actividad hidro de encaje de SAH remanente. Utilizando la ecuación encontrada en el protocolo de texto, estos resultados demuestran que el fármaco epigenético DZ NEP suprime el crecimiento y el desarrollo e induce la mortalidad en mosquitos inmaduros. La mayoría de los mosquitos expuestos a 0,5 micromolares murieron al día 10 del experimento, mientras que un gran número de mosquitos expuestos a cinco micromolares murieron al octavo día.Por el contrario, la mortalidad de los mosquitos en el tratamiento de control no se vio afectada y varios emergieron como adultos en el octavo día del experimento. Aquí se ilustra el efecto de DZ NEP sobre la fecundidad de los mosquitos. Los mosquitos hembra adultos alimentados con sangre que contenía DZ NEP mostraron una reducción significativa en el número de huevos viables en comparación con el control.Un gran número de huevos obtenidos de la jaula de prueba eran de color más oscuro y carecían de flotadores y conjuntos en forma de roseta en comparación con los huevos obtenidos de mosquitos hembra alimentados con sangre normal. La ausencia de flotadores junto con huevos de color más oscuro indica el papel potencial de la epigenética en la formación de exo coriones. Aquí se demuestra el efecto de DZ NEP sobre la actividad de SAH hydro lace en mosquitos adultos machos y hembra de malaria.Se observa una disminución de la OD dependiente de DZ NEP para cada tratamiento farmacológico en comparación con el tratamiento control, lo que indica que la DZ NP inhibe la actividad hidro del encaje SAH después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de vectores exploraran los efectos de los medicamentos epigenéticos en el mosquito de la malaria.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En esta entrevista, George Dimopoulos se centra en los mecanismos fisiológicos utilizados por los mosquitos para combatir el Plasmodium falciparum y las infecciones del virus del dengue. Se da una explicación de cómo los genes resistentes clave, los genes que confieren resistencia a los patógenos de vectores, se identifican en el mosquito y cómo este conocimiento puede ser usado para generar los mosquitos transgénicos que no son capaces de llevar el parásito de la malaria o el virus del dengue.

La construcción de un mosquito mejor: La identificación de los genes que permiten resistencia a la malaria y el dengue en A. gambiae y A. aegypti

En este video, demostramos el ensayo de prueba tópica para determinar la toxicidad de un insecticida potencial en mosquitos hembra adultos. Utilizando un antagonista del receptor de dopamina que causa la inhibición letal de la neurotransmisión en los mosquitos, este método describe una forma de evaluar los efectos tóxicos de los insecticidas tras la aplicación tópica.

Ensayo de prueba tópica: una técnica para evaluar el potencial insecticida de los antagonistas de los receptores de dopamina en mosquitos hembra adultos mediante aplicación tópica

Este video muestra un ensayo de alimentación sanguínea para evaluar la mortalidad y la fecundidad de compuestos de prueba con nuevos modos de acción sobre mosquitos hembra. Esta técnica ayuda a detectar nuevas clases de insecticidas para matar la población resistente de mosquitos y controlar la propagación de enfermedades.

Ensayo de alimentación de mosquitos: un método para evaluar los efectos de los compuestos de prueba sobre la mortalidad y la fecundidad de mosquitos hembra adultos

Debido a las sorprendentes similitudes del ciclo de vida y la biología de los parásitos del paludismo de roedores con los parásitos del paludismo humano, los modelos de malaria de roedores se han vuelto indispensables para la investigación del paludismo. En este documento, estandarizamos algunas de las técnicas más importantes utilizadas en el análisis fenotípico de especies de malaria de roedores de tipo salvaje y transgénico.

Análisis fenotípico de las etapas de la sangre asexual y sexual del parásito de la malaria de los roedores y las etapas de los mosquitos

Se describen los protocolos para la evaluación de la toxicidad de los químicos a los mosquitos inmaduros y adultos para el desarrollo como nuevas clases de larvicidas, adulticidas y endectocidas. Los protocolos permiten pruebas de alto rendimiento de múltiples químicos en dosis de un solo punto y posterior evaluación por análisis de respuesta de dosis para determinar toxicidad en contacto o por ingestión.

Protocolos para las pruebas de la toxicidad de la novela química insecticida para mosquitos

Descrito es un método de ahorro de tiempo y espacio para contar los huevos y determinar las tasas de eclosión de mosquitos individuales utilizando 24 placas de cultivo de tejido de pozos, lo que puede aumentar sustancialmente la escala y la velocidad de los ensayos de fecundidad y fertilidad.

Ensayo mejorado de fecundidad y fertilidad para Aedes aegypti utilizando 24 placas de cultivo de tejidos de pozos (placas EAgaL)

Describimos la metodología e importancia del bioensayo de aplicación tópica para medir la susceptibilidad a insecticidas en mosquitos y moscas de la fruta. El ensayo presentado es de alto rendimiento, utiliza masa de insectos, lo que permite calcular una dosis letal relativizada en masa en lugar de concentración, y probablemente tiene una variabilidad más baja que otros métodos similares.

Bioensayo de aplicación tópica para cuantificar la toxicidad de insecticidas para mosquitos y moscas de la fruta

El ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA) se considera el estándar de oro para la evaluación e identificación de posibles compuestos antipalúdicos. Este sistema de alimentación artificial se utiliza para infectar mosquitos para evaluar más a fondo los efectos de tales compuestos sobre la intensidad y prevalencia del parásito Plasmodium falciparum .

Ensayo estándar de alimentación por membrana para la detección de la infección por Plasmodium falciparum en mosquitos vectores Anopheles

Dada su anatomía simple, los testículos de Anopheles ofrecen un buen modelo citológico para estudiar la espermatogénesis. Este protocolo describe la hibridación in situ de fluorescencia de montaje completo, una técnica utilizada para investigar este proceso biológico, así como el fenotipo de cepas transgénicas que albergan mutaciones en los genes implicados en la producción de espermatozoides.

Hibridación in situ de fluorescencia de montaje completo para estudiar la espermatogénesis en el mosquito Anopheles

La genética química implica la sustitución de un residuo guardián por un aminoácido que contiene una cadena lateral diferente en el locus objetivo. Aquí, hemos generado un parásito mutante que contiene un alelo hipomórfico de cdpk1 e identificado las vías compensatorias adoptadas por el parásito en el fondo mutante.

Comprender el desarrollo de vías compensatorias en un parásito mutante de la malaria que alberga un alelo hipomórfico de quinasas similares a las plantas

El desarrollo sexual del Plasmodium ocurre en el intestino medio del mosquito. Dirigirse a las etapas sexuales del parásito es una estrategia prometedora para bloquear la transmisión. Desarrollamos Ookluc, un P. berghei transgénico que expresa nanoluciferasa después de la formación del cigoto, lo que permite el cribado de alto rendimiento de compuestos que bloquean la transmisión. En este artículo se detallan los métodos de cribado con Ookluc.

Ookluc: Una línea de Plasmodium berghei para la identificación de compuestos que bloquean la transmisión

Aprende a evaluar los efectos del fármaco epigenético DZNep en el desarrollo, la fecundidad y la supervivencia de los mosquitos de malaria. Este método utiliza ensayos toxicológicos para el control de vectores.

Los ensayos toxicológicos para efectos de prueba de un epigenética de Drogas sobre el Desarrollo, Fecundidad y Sobrevivencia de los mosquitos de malaria (Video) | JoVE Journal

Los ensayos toxicológicos para efectos de prueba de un epigenética de Drogas sobre el Desarrollo, Fecundidad y Sobrevivencia de los mosquitos de malaria

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