Expresión de proteínas fluorescentes en Lanceolatum Branchiostoma Por mRNA La inyección en ovocitos no fecundados

El objetivo general de este procedimiento es introducir ARNm, que codifica una proteína fluorescente en los ovocitos de bronchos stoma lancia latam para permitir la obtención de imágenes fluorescentes in vivo de embriones en desarrollo. Esto se logra induciendo primero el desove de amfi ais maduros, machos y hembras por un choque de temperatura de 24 horas. Después del choque de temperatura, las hembras y los machos se colocan en copas de desove individuales, lo que permite la recolección de ovocitos y espermatozoides respectivamente.

Una vez que los citos están alineados en una placa recubierta de polilisina, se utiliza una aguja de microinyección especialmente preparada para inyectar la solución dentro del núcleo del cito. El paso final es la fecundación del cito con una a cinco gotas de espermatozoides. En última instancia, escaneo láser de dos fotones.

microscopía se utiliza para mostrar la expresión ubicua de las proteínas fluorescentes producidas a partir del ARNm microinyectado. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de la microinyección son difíciles de aprender debido a las habilidades técnicas requeridas que son imposibles de detallar y cubrir en la impresión. Para empezar, prepare las placas recubiertas de polilisina que se utilizan para inmovilizar los citos durante la inyección.

Por cada placa de Petri de cultivo celular de 35 milímetros, cubra el fondo con una solución de polilisina e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, transfiera la solución de polilisina a otro plato y, nuevamente, incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Deseche la solución y deje que las placas de Petri se sequen boca abajo a temperatura ambiente durante dos horas.

Cuando estén secos, guarde los platos recubiertos envueltos en una envoltura de plástico a cuatro grados centígrados hasta por una semana. Para preparar los aros se utilizan platos recubiertos para cultivar embriones inyectados, hacer agua de mar artificial y agua de ósmosis inversa. A continuación, disuelva los aros a una concentración del 1% en un SW filtrado, vierta rápidamente la solución tibia de aros de una placa de Petri a otra para asegurar una capa muy delgada de aros de la placa.

Envuelva los platos rebozados en una envoltura de Saran y guárdelos a cuatro grados centígrados hasta por una semana. Primero, prepare la mezcla de inyección en ARN y fenol de agua libre de ADN. El rojo colorea la solución y permite la identificación de embriones inyectados con éxito.

A continuación, centrifuga la mezcla para granular los cristales y manténgala en hielo hasta que esté lista para usar. Cuando esté listo, cargue una pipeta de 10 microlitros con 0,5 microlitros de la mezcla de inyección, evitando el fondo del tubo donde se han granulado los cristales. Rellene la aguja de inyección pipeteando la gota de 0,5 microlitros de inyección.

Mezcle en la abertura grande de la aguja. Prepare dos agujas en caso de que una se rompa durante la inyección. Guarde las agujas en un frasco con agua en el fondo para evitar la evaporación de la inyección.

Mezclar y colocar a cuatro grados centígrados. Deje que la mezcla de inyección se desplace lentamente hasta la punta de la aguja de inyección durante al menos una hora para minimizar la creación de burbujas. Para comenzar la recolección de ovocitos y espermatozoides, los machos y las hembras se electrocutan en un SW durante 24 horas y luego se transfieren a copas individuales una o dos horas antes del desove.

Al desovar, recoja inmediatamente el esperma y los citos. Tenga cuidado de no asustar a los adultos durante la recolección. El movimiento adicional puede disipar y, por lo tanto, diluir tanto los espermatozoides como los citos después de la recolección.

Mantenga los espermatozoides en hielo en un tubo de 1,5 mililitros y transfiera los citos en un SW filtrado a placas de Petri previamente enjuagadas. Transfiera de 100 a 500 citos a otra placa de Petri de 35 milímetros para realizar las inyecciones. Por último, fertilice el resto de la nidada de citos como control de la calidad de los espermatozoides y los cititos o para otros experimentos.

Para comenzar el procedimiento de inyección, instale la aguja en el micromanipulador en un ángulo de 50 grados con respecto al plano horizontal debajo de un osciloscopio de disección fluorescente con 25 ex oculares, transfiera 30 citos a un plato recubierto de polilisina y filtre un SW para ayudar a realizar un seguimiento de los citos inyectados. Deposítalos a lo largo de una línea de forma ordenada. Inyecte siempre números pequeños para minimizar la exposición.

Tiempo de polilisina, que tiende a deformar los embriones en desarrollo. Utilice la iluminación de campo oscuro para hacer que los citos sean lo más translúcidos posible. Luego, con la perilla de movimiento grueso, acerque la aguja de inyección a un citto con pinzas finas. Cortar.

Abra la aguja al nivel donde la punta comienza a curvarse pulsando con el inyector. Verifique que la mezcla de inyección roja salga de la aguja con un aumento de 200x. Y con la perilla de movimiento fino, mueva suavemente la aguja de inyección dentro del núcleo del cito.

Si se inserta dos superficialmente, la solución inyectada no permanecerá dentro del sitio de UO. Si se inserta demasiado lejos, el sitio de UO se destruirá. Inyecte de uno a tres pulsos.

Si la aguja es lo suficientemente fina, inyecte con flujo continuo a presión constante. Asegúrese de que el volumen de la inyección corresponda a un quinto a un tercio del volumen de un solo ovocito después de la inyección. Tire de la aguja rápidamente para evitar fugas.

Verifique que la solución inyectada permanezca dentro del cite y que, pasados unos segundos, la solución inyectada se extienda por todo el cito. Pasa a la siguiente cita de la fila. Mantenga algunos embriones no inyectados de cada serie como controles negativos para estimar la fluorescencia de fondo cuando se escanean los embriones inyectados y fecunde los ovocitos tan pronto como se haya inyectado la serie.

Debido a que la calidad de los ovocitos disminuye con el tiempo, inyecte y fertilice los citos dentro de una hora. Después del desove. Dependiendo de la concentración de espermatozoides, agregue de una a cinco gotas de esperma al UY y agite el plato.

La envoltura de la fecundación debe ser evidente en los embriones. Después de aproximadamente un minuto, permita que los embriones se desprendan de la placa recubierta de polilisina mientras inyecta otra serie de ovocitos. Una vez separados, transfiera los embriones a una placa de Petri recubierta de aros.

Retire los embriones de la placa recubierta de polilisina si es posible. Antes de la etapa de dos células. En la etapa de dos a cuatro células, seleccione los embriones inyectados con éxito con la ayuda de un endoscopio de disección fluorescente.

Con un filtro DSR, una inyección exitosa está indicada por una morfología normal que exhibe una señal fluorescente roja derivada del rojo fenol. Mantener los embriones y filtrar un SW en placas de Petri recubiertas de agros a 19 grados centígrados hasta la etapa deseada para la obtención de imágenes in vivo, estas imágenes representativas de los embriones de broncos stoma lancia lato se tomaron después de la microinyección de ARNm y el recubrimiento de proteínas fluorescentes. Esta primera imagen muestra que la expresión de EGFP nuclear obtenida por microinyección de un constructo H dos B-E-G-F-P puede detectarse en embriones ya en la etapa de 16 células.

Este embrión en etapa gastroscópica es un ejemplo de co-expresión ubicua de cereza nuclear y EGFP dirigido a la membrana. La señal nuclear es el resultado de la microinyección de una construcción de cereza H dos BM, mientras que la fluorescencia en las membranas celulares se obtiene mediante la microinyección de una construcción de caja EEG FP CAAX. Una sección óptica de este embrión en etapa gastroscópica muestra cómo los núcleos y los contornos celulares se resaltan respectivamente por el mCherry dirigido a la membrana nuclear y el EGFP asociado a la membrana.

La demostración visual de esta técnica de microinyección ayudará a los investigadores en el desarrollo evolutivo de la comunidad biológica a mejorar la existente y desarrollar nuevos enfoques para la obtención de imágenes individuales, la manipulación específica de genes y el establo en afi, un modelo importante para comprender la evolución animal.