Cirugía estereotáxica en roedores

Cirugía estereotáctica es una técnica poderosa para manipular el cerebro de animales vivos. Dirigidos a regiones profundas en el cerebro intacto plantea un problema único en que generalmente el objetivo quirúrgico no puede ser localizado visualmente. Cirugía estereotáctica o estereotaxia fue ideada para apuntar regiones discretas del cerebro conociendo sus relaciones espaciales a lugares accesibles. Mediante un sistema de coordenadas tridimensional, herramientas pueden ser dirigidas a lugares específicos para medir la actividad cerebral, tomar una lesión o realizar manipulaciones genéticas. Este video cubre los principios de la cirugía estereotáctica, demostrar pasos esenciales del procedimiento y discutir diversas aplicaciones de la técnica.

Antes de discutir los detalles de procedimiento, vamos a repasar los principios básicos y herramientas de la técnica. Para empezar, estereotaxia depende de la localización de la región específica del cerebro en tres ejes dimensionales. Para ello, se utiliza un atlas estereotáctico. Este documento es una reconstrucción 3D del cerebro de las secciones seriales del cerebro manchada.

En este marco de referencia, las relaciones espaciales se expresan mediante un conjunto de 3 ejes: antero-posterior, lateral medial y dorsal-ventral. Para determinar la ubicación de una región de interés, encontrar la región del cerebro correspondiente en el atlas y utilizar la cuadrícula para calcular la correspondiente mediolateral y coordenadas dorsoventral. La coordenada anteroposterior se obtiene en la parte inferior o superior de la página. Esta coordenada se mide de hitos en el cráneo formado por las intersecciones de las placas del hueso, que se conocen como suturas. El hito más destacado, bregma, se define como el punto de intersección de la sutura sagital con la sutura coronal. El punto conocido como lambda es más posterior; donde la sutura sagital se cruza con la sutura del lambdoid.

Para preciso apuntar a la ubicación calculada durante la cirugía, se utiliza un dispositivo conocido como el marco estereotáxicas. El marco consiste en el bastidor principal, el instrumental quirúrgico y el soporte de la sonda, que se une a la abrazadera de montaje. Incisivo y oído las barras hacen contacto con el animal para sostener la cabeza en una posición fija. El instrumental quirúrgico se utiliza para el movimiento exacto de sondas quirúrgicas coordenadas predeterminadas dentro del cerebro y está equipado de resbalar escalas Vernier para la medición de la distancia exacta en las tres dimensiones.

Para leer una escala Vernier, en primer lugar identificar la ubicación de la línea 0 en relación con las marcas de paso en el lado derecho de la escala. Este lado de la balanza está marcada en incrementos de 10 milímetros, por lo que 1 es 10 y 2 es 20. La ubicación del 0 Marque aquí muestra que la lectura es entre 10 y 11 mm. Para determinar el primer número a la derecha del punto decimal, busque la línea en la escala de la izquierda que se alinea mejor con una marca en el lado derecho. Utilice la escala izquierda para identificar el valor de esta marca, que en este caso es 9, haciendo el final leyendo 10,9 milímetros.

Ahora está familiarizado con los principios básicos de estereotaxia, así que vamos a revisar cómo se realiza el procedimiento quirúrgico. Antes de la cirugía, el cuero cabelludo de un animal anestesiado se afeitó y desinfectado. Para mantener el animal en su lugar en el marco de estereotáctica, las barras de la oreja se colocan suavemente en los oídos y los dientes delanteros se colocan en las barras de la incisivo. Ungüento oftálmico se aplica para prevenir la desecación corneal durante la cirugía.

Para exponer el cráneo, haga una pequeña incisión con un bisturí. Separar suavemente el tejido fino del músculo y limpiar la superficie del cráneo. A continuación, utilice el instrumental quirúrgico para bajar una sonda a bregma y tomar nota de sus coordenadas dorsoventral. Luego levante la punta de prueba y repita este procedimiento en lambda. Si la medición lambda es inferior a 0,1 mm de la coordenada dorsoventral en bregma, el cráneo se considera nivel y está listo para proceder. Si no, subir o bajar la barra incisivo y repita las mediciones.

Ahora que el cerebro está a nivel, volver al bregma y grabar las coordenadas mediolateral y anteroposterior. En base a las coordenadas de destino de lo atlas del cerebro, calcular los movimientos necesarios para llegar a ese sitio y cambio de la sonda en la posición de destino. Marque esta posición en el cráneo y utilizar un taladro con cuidado hacer un agujero en el hueso.

Justo debajo del cráneo se encuentra la duramadre, una membrana gruesa y resistente que puede seccionarse suavemente con la punta de una aguja pequeña.

A continuación, el brazo de amalgamas dentales se coloca en posición para bajar la sonda a la coordenada dorsoventral dirigida, momento en el que se puede realizar la manipulación deseada.

Ahora que entiendes los pasos básicos del procedimiento, vamos a echar un vistazo a algunos de la cirugía de estereotáctica muchas maneras neurocientíficos uso para responder a preguntas en el laboratorio.

Para empezar, estereotaxia es extremadamente útil para entregar agentes experimentales en regiones precisas del cerebro. Estos agentes pueden incluir tracer tintes utilizados para visualizar las proyecciones neuronales y conectividad, compuestos químicos o reactivos para la manipulación genética de las neuronas. Por ejemplo, la inyección de virus modificados genéticamente hará entrega de un gen de interés a las células infectadas. Aquí, un virus fue inyectado en el hipocampo, dando por resultado la expresión de GFP en una población pequeña de neuronas.

Por otro lado, entrega viral de ARN interferente pequeño puede evitar la expresión de proteínas deseadas. En este ejemplo, la expresión de la proteína SOD1 fue suprimida en regiones diferentes del cerebro después de la inyección estereotáctica en el ventrículo lateral.

Como alternativa, cirugía estereotáctica puede utilizarse para colocar los electrodos en el cerebro para la grabación de las señales eléctricas que acompañan la actividad de los nervios. Después de que el animal se recupera de la intervención quirúrgica, los electrodos pueden conectarse a sistemas de grabación electrofisiológica para observar el disparo neuronal, mientras que el ratón se comporta libremente.

Además de medir la actividad neuronal, la cirugía estereotáctica es instrumental para microdiálisis. Esta técnica permite un monitoreo continuo de las concentraciones de drogas, neurotransmisores o metabolitos en el tejido cerebral de animales despiertos. Para ello, se implanta una sonda pequeña, llena de líquido con una membrana semipermeable en la punta en una región específica del cerebro. Pequeños solutos como neurotransmisores, hormonas y drogas se difunden en la sonda, donde pueden ser recogidas para el análisis. En este experimento, se midió la concentración de glucosa en el hipocampo como una lectura para la actividad de los nervios local mientras que las ratas completó una tarea que requiere el uso de memoria de trabajo espacial.

Sólo has visto video de Zeus en cirugía estereotáctica. En este video, hemos cubierto los principios y métodos de procedimiento así como sus múltiples aplicaciones en los laboratorios de Neurociencia.

¡Gracias por ver!