Fluorescente Rápida In Situ Protocolo de hibridación para Xist ARN combinado con inmunofluorescencia de histona Modificación de inactivación del cromosoma X.

El objetivo general de este procedimiento es investigar la dinámica de la existencia de ARN no codificante largo y su modificación epigenética asociada durante la inactivación del cromosoma X mediante el uso de una hibridación fluorescente in situ rápida combinada con inmunofluorescencia. Este protocolo requiere la preparación de citosina de portaobjetos con células del cuerpo embrionario en diferenciación, que se impregnan y luego se fijan para la tinción. A continuación, el marcador fluorescente localizado por un anticuerpo contra la histona H tres trimetillisina 27 se acumula en el cromosoma X inactivo.

El paso final utiliza sondas de oligonucleótidos que contienen una modificación de cinco aminoácidos principales y están marcadas con un fluoróforo reactivo medio de AM para que exista. Peces ARN. En última instancia, la microscopía de fluorescencia se utiliza para mostrar la localización de la nube de ARN existente y la modificación de histonas durante la diferenciación de las células E ES.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que utilizamos múltiples oligonucleótidos únicos, que están marcados con un solo fluoro-cuatro. Esto nos proporciona una detección trans específica, que reduce el fondo, y esto también aumenta la penetración al núcleo y aumenta o potencia la intensidad de las señales. Además, cuando aumentamos la concentración de las sondas, podemos reducir significativamente el tiempo necesario para completar este experimento de inmunopeces peces.

Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la localización de la AR existente en el cromosoma ex inactivo y su modificación cromosómica asociada. También se puede aplicar a otros sistemas biológicos para la detección de AR y su modificación epigenética, localización nuclear y regulación transgeneracional asociada. Para preparar primero las sondas, obtenga múltiples oligonucleótidos de 20 a 30 nucleótidos de longitud con una temperatura de fusión de 63 a 65 grados Celsius, y que contienen una secuencia antisentido única a un ARN existente y una modificación de cinco aminoácidos primos.

Suspenda estos oligonucleótidos en agua pura en cantidades equimolares de los distintos oligonucleótidos para un total de 4,5 microgramos de ADN. Luego, siguiendo las instrucciones del fabricante, etiquete los oligonucleótidos con un tinte fluorescente reactivo medio am después de la etiqueta de los oligonucleóticos. Pásalos a través de una columna G 25.

Luego, usando etanol y acetato de sodio, precipite los oligos. Esto requiere un período de media hora a menos 80 grados Celsius antes de un giro de 21.000 G a cuatro grados Celsius. A continuación, lave el pellet una vez con etanol al 70% después del lavado.

Resus suspende los oligonucleótidos en 50 microlitros de agua libre de nucleasa o tris EDTA hasta una concentración final de 10 micromolares de ADN. Esto hace que la solución madre de la sonda para usar la sonda se reconcentre a 250 nano molares en tampón de hibridación. Para empezar, haga que las células diferenciadoras ES o EB crezcan en placas de seis pocillos, aspire el medio de cultivo de los pocillos y luego lave las células a temperatura ambiente.

PBS aspira completamente el PBS. A continuación, agregue 0,5 mililitros de solución de tripsina a cada pocillo e incube la placa durante cinco a 10 minutos. Detenga la reacción de tripin agregando cinco mililitros de medio a cada pocillo y pipeteándolos suavemente.

Luego transfiera las células a un tubo de 15 mililitros. Ahora gire las celdas durante cinco minutos a 200 Gs a temperatura ambiente, retire todo el sobrenadante y vuelva a suspender la paleta de celdas en dos mililitros de PBS. Luego cuente las células y diluya la suspensión a 400, 000 células por mililitro en PBS.

Ahora, ensamble cada portaobjetos con una tarjeta de filtro, una cámara y un clip. Haga tantos como sea necesario y colóquelos en el rotor de un centrifugador. Agregue 250 microlitros de suspensión celular a cada portaobjetos y haga girar los portaobjetos a 1500 RPM durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, perme y arregle. En primer lugar, transfiera rápidamente los portaobjetos a PBS helado durante cinco minutos como paso de enjuague. En segundo lugar, transfiera los portaobjetos al tampón CSK helado durante un minuto para hinchar el tercero, mueva los portaobjetos al tampón CSKT durante cinco minutos para permanenteizar las celdas.

En cuarto lugar, lave las células en tampón CSK helado durante un minuto. Y, por último, fíjelos a temperatura ambiente con aldehído paraformado al 4% en PBS durante 10 minutos. Primero, retire los portaobjetos de la solución de PFA.

Luego, transfiéralos a un frasco de coplan con PBST durante varios segundos, seguido de colocarlos inclinados para escurrir. A continuación, cargue una caja de puntas de pipeta vacía con agua debajo del inserto del soporte de puntas. A continuación, limpie la parte trasera de las diapositivas y transfiéralas a esta caja.

Ahora superponga cada portaobjetos con 40 microlitros de solución de bloqueo y cubra suavemente los portaobjetos con cubreobjetos. Déjalos incubar en la caja durante 10 minutos en el banco. A continuación, retire los cubreobjetos y coloque las correderas en forma inclinada.

Ahora agregue 40 microlitros de la solución de anticuerpo primario. Vuelva a colocar los cubreobjetos y deje que los portaobjetos se incuben en el banco durante 30 minutos después de media hora. Retire los anticuerpos no unidos lavando los portaobjetos dos veces en PBST en frascos de coplan.

Agite suavemente y deje que cada lavado actúe durante cinco minutos. A continuación, vuelva a colocar las diapositivas en una posición inclinada y deje que el PBST se drene. A continuación, limpie el exceso de solución de la parte trasera de los portaobjetos y luego devuelva los portaobjetos a la caja.

Ahora aplique 40 microlitros de una solución de anticuerpo secundario a 500 en cada portaobjetos. Cubra los portaobjetos con cubreobjetos y déjelos incubar en el banco durante 15 minutos protegidos de la luz en el futuro. Los toboganes siempre deben estar protegidos de la luz.

Retire los anticuerpos usando PBST como antes, y luego coloque los portaobjetos en una inclinación para drenar. Al realizar la inmunofluorescencia, precaliente una caja que contenga agua a 37 grados centígrados. Después de limpiar el tampón de lavado de la parte posterior de los portaobjetos, colóquelos en una caja de puntas de pipeta con agua a temperatura y aplique 500 microlitros de tampón de lavado de pescado a cada portaobjetos.

Déjalos incubar durante cinco minutos. Después de cinco minutos, aspire la solución de los portaobjetos junto a cada portaobjetos a ocho microlitros de la sonda de trabajo a temperatura ambiente y aplique un cubreobjetos. Ahora transfiera los portaobjetos a la caja de portaobjetos precalentada e incube durante una o dos horas a 37 grados centígrados.

Después de la incubación, bañe los portaobjetos en tampón de lavado de pescado en un frasco de coplan a 37 grados centígrados. Cuando los portaobjetos se caigan, lo que suele tardar unos minutos, retire los cubreobjetos y deje que los portaobjetos se incuben durante cinco minutos. A continuación, transfiera los portaobjetos a un frasco que contenga tampón de lavado de pescado con 0,5 nanogramos de tinte por mililitro, también a 37 grados centígrados.

Deje que los portaobjetos se incuben en esta solución durante cinco minutos. Ahora lave el portaobjetos en dos XSSC cinco minutos a 37 grados centígrados. Para terminar, coloque las correderas en un drenaje inclinado exceso de dos XSSC.

Límpialos y móntalos con cuatro microlitros de solución Antifa que contenga ppp. Se utilizó Quick immuno fish para observar la localización del ARN existente y la modificación de las histonas. En la diferenciación de las células EB femeninas, el ARN se ve como una nube verde que cubre toda la longitud del cromosoma X inactivado En estas células, la modificación de la histona H tres trimetil lisina 27 se visualiza en rojo y los núcleos se contratiñen mediante DPI en azul.

Las células EB de ratón hembra diferenciadas se procesaron en el día 12 de la diferenciación. En este momento, más del 90% de las células mostraron una nube existente en las células Los núcleos de las sondas de oligonucleótidos cortos pudieron penetrar de manera eficiente, lo que resultó en la tinción de casi todas las señales de histona H tres trimetillisina 27 Con nubes de ARN existentes en 150 núcleos, se encontró que el 97% de las señales de ARN existentes se colocalizaban con estas histonas metiladas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de cinco horas para completar una ligera preparación previa.

La inmunofluorescencia de él es de tres trimestres en 27 y existe AR. Si lo hacemos correctamente, este protocolo de immuno fish se puede aplicar a otras modificaciones epigenéticas de ARN y proteínas de interés. Para aplicar este protocolo a un sistema biológico diferente, es posible que necesite alguna optimización. Buena suerte con tus experimentos.