Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

El procedimiento presentado aquí muestra un método sencillo de preparación de lípidos soportados por MICA mediante capas adecuadas para la obtención de imágenes de alta resolución, como los estudios de seguimiento de una sola molécula. La superficie de MICA se prepara dividiendo un sándwich de una sola hoja de MICA pegada entre el portaobjetos de microscopio de vidrio y el cubreobjetos con adhesivo óptico que expone una superficie plana y extremadamente delgada de mica fresca. Al montar una pequeña cámara de plástico hecha de un vaso de vial de un mililitro y medio, el volumen de vesículas lipídicas necesarias para la formación de bicapas puede ser tan bajo como 30 microlitros.

Como primer paso, tome la lámina multicapa de MICA tal como viene del proveedor y córtela con unas tijeras en trozos más pequeños. Al folíolo en dos o tres folíolos más delgados con una hoja de cuchillo nueva. Ahora limpie bien la cubierta para dormir.

Esto implica colocar una tapa de 0,17 milímetros. Duerme en un frasco de entrenamiento de vidrio cada tapa. Duerma en una ranura separada y sonique el detergente durante 30 minutos a 60 grados centígrados.

Lave la funda. Duerme de 10 a 20 veces con agua mini key y se seca con un chorro de aire o nitrógeno. Tome un portaobjetos de vidrio de microscopio y límpielo con su lugar.

Una pequeña gota de unos 15 microlitros de ahe óptico de baja viscosidad en el microscopio y el globo previamente. Corte el folleto en una caja de luz ultravioleta durante unos minutos. Use cinta adhesiva para despegar algunas capas de mica.

Las primeras capas se fragmentarán, así que hazlo hasta que veas que las capas se adhieren al whisky. Las cintas son uniformes y completas. Cubre la cinta.

Coloque una gota de adhesivo óptico de alta viscosidad en la superficie Micah. Asegúrate de que no haya burbujas de aire allí. Coloque suavemente el reposo de cubierta limpia sobre la gota ofensiva.

Use pinzas para golpear suavemente el vaso y esparcir el ahe. Nuevamente, cure el adhesivo con luz ultravioleta durante unos minutos. Use un cuchillo para partir el sándwich que consiste en vidrio.

Deslice MICA y cubra el sueño. En la mayoría de los casos, solo una capa muy delgada de MICA permanecerá pegada a la funda de dormir. Use un microscopio de disección para inspeccionar la superficie de su MICA haciendo un pequeño rasguño con la punta de una aguja o pinzas.

Se puede decir fácilmente si la superficie es en realidad mica, donde la superficie está uniformemente rayada, como aquí, o en el adhesivo óptico, como aquí, donde la superficie es brillante. Tome una taza de un frasco de vidrio de mililitro y medio, retire el peralte de gasolina y pegue la tapa a la superficie de MICA con esmalte de uñas. Déjalo secar durante unos minutos.

Ahora puede preparar un lípido bicapa de reparación lipídico por capa utilizando un protocolo estándar aquí. Se coloca una gota de 30 microlitros de vesículas lipídicas en la cámara del tapón del vial y se incubará durante 60 minutos antes de lavar el tampón. Después del lavado, la muestra está lista para la obtención de imágenes.

En este caso, se monta en un portamuestras hecho a medida. Las moléculas individuales se pueden observar fácilmente en dicha superficie de MICA preparada. Aquí comparamos el A-D-O-P-C por capa apoyada en vidrio y mica.

Tenga en cuenta que el tipo de movimiento difiere sustancialmente entre estas dos superficies. La trayectoria de las moléculas individuales trazadas en colores en los paneles de la derecha muestra claramente que el comportamiento de difusión en MICA difiere del del vidrio. Sin embargo, no hay diferencias significativas en la calidad de las imágenes.

El tejido medio de la función recta a la mitad de la intensidad máxima para 20 puntos es casi el mismo para ambos sustratos, lo que indica que la superficie de MICA es totalmente penetrable por la luz sin introducir aberraciones ópticas notables. En general, la MSDS muestra una diferencia obvia en el comportamiento de difusión. Sin embargo, para cada caso, se pueden observar dos poblaciones de partículas que se difunden a diferentes velocidades.

Se extrajeron dos coeficientes de difusión diferentes, rápido y lento, a partir de la alimentación exponencial doble a la probabilidad acumulativa de desplazamiento cuadrado. Para esta bicapa DOPC, ambos componentes de difusión son más rápidos en la superficie de MICA, las partículas de movimiento lento en MICA son aproximadamente de 10 a 20 veces más lentas que la rápida. La población lenta en vidrio, sin embargo, está cerca de ser inmóvil por aquí.

Demostramos que el tipo de superficie podría marcar una diferencia en el comportamiento de difusión de las bicapas lipídicas. Por lo tanto, hay que tener cuidado al comparar los resultados entre los estudios sobre bicapas soportadas en diferentes sustratos, como MICA y las bicapas de imagen de vidrio en MICA, suele ser bastante difícil debido a la complicada preparación que mostramos, sin embargo, una forma simple pero efectiva de preparar superficies de tan alta calidad.