La cuantificación de fenotipos en Orofacial Xenopus

El objetivo general del siguiente procedimiento es describir los fenotipos faciales orales de los embriones xap Levis de una manera estadística cuantitativa. Esto se logra montando primero cabezas de embriones xip separadas en un molde de arcilla para la documentación fotográfica utilizando las imágenes. Las dimensiones faciales se miden para proporcionar información sobre el tamaño de la región facial oral.

Los siguientes puntos de referencia se aplican a través de morfometría geométrica para evaluar la forma de la región facial oral. Los resultados muestran cambios significativos de tamaño y forma en la región facial oral Opus basados en análisis estadísticos de las dimensiones faciales y la posición relativa del punto de referencia. Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo del opus o del rostro, también se puede aplicar a otros estudios de morfología de vertebrados, como las comparaciones de especies estrechamente relacionadas con fines evolutivos o ecológicos.

Esta sección describe cómo hacer platos de arcilla para sostener cabezas de embriones para su documentación fotográfica. Primero, aplana un poco de arcilla para modelar en un plato de cualquier tamaño y alísalo para cubrir todo el plato. A continuación, presione ligeramente una aguja recta en la arcilla en un ángulo de 45 grados.

Sostenga la aguja firmemente y mueva lentamente el plato para crear una línea deprimida. A continuación, utilice una pipeta de vidrio para hacer depresiones circulares poco profundas a lo largo de cada línea. En cada depresión, se puede colocar una cabeza de embrión antes de la carga.

Las cabezas llenaron el plato con PBT. Los detalles sobre el cultivo de orina zap se describen en el protocolo de texto, así como los detalles sobre la fijación de embriones. Para este protocolo, fije los embriones entre las etapas 42 y 45.

Primero, coloque los embriones fijados en una placa de Petri de 150 milímetros que contenga aproximadamente 100 mililitros de PBT. Ahora, córtales la cabeza. Primero, sostenga un embrión con un par de pinzas y use un bisturí para hacer una incisión en el lado posterior del intestino.

En segundo lugar, haga una incisión en la parte anterior del intestino cerca del corazón para extirpar completamente la cabeza. Con una pipeta, transfiera las cabezas al plato de arcilla. Es fundamental que las cabezas de los embriones se coloquen en la arcilla exactamente en la misma orientación para la fotografía.

Para asegurar el éxito, use las filas dibujadas en la arcilla como guías. También es beneficioso si la misma persona captura todas las imágenes en el mismo día. Para la vista frontal, las fotografías colocan las cabezas con el lado posterior hacia abajo en las depresiones.

Use pinzas para manipular las cabezas y la arcilla circundante de modo que las cabezas queden fijas frente a la cámara y no estén inclinadas para la vista lateral. Las fotografías colocan las cabezas de modo que sus lados miren en la misma dirección. Manipula las cabezas y la arcilla circundante, de modo que las glándulas de cemento apunten hacia abajo en el mismo ángulo.

Ahora, utilizando cualquier microscopio de disección con capacidad de captura de imágenes, recoja imágenes de las cabezas de los renacuajos. Utilice varias luces para evitar sombras excesivas y utilice el mayor aumento posible. Fotografía cada cabeza de la misma manera.

A continuación, guarde las imágenes sin comprimir y con la resolución más alta posible. A partir de las imágenes, mida las dimensiones faciales orales. Primero, determine el ancho de la cara.

Identifique los puntos en los que la parte ventral de cada ojo se encuentra con las periferias de la cara y mida la distancia entre estos puntos. Los detalles sobre la medición de la altura de la cara y el área facial oral se pueden encontrar en el protocolo de texto. Preste especial atención a la determinación de la longitud del hocico En las imágenes laterales, haga una línea vertical que marque la parte anterior del ojo.

A continuación, mida la distancia horizontal desde el punto más anterior donde la cara se encuentra con el borde dorsal de la glándula de cemento hasta la línea vertical que marca la parte anterior del ojo. Otras dimensiones como el ancho de la boca y la redondez se explican en el protocolo de texto para este análisis, las coordenadas de los puntos de referencia faciales deben estandarizarse y guardarse en un archivo. Los puntos de referencia deben capturar la forma de la imagen y ser utilizables en todas las imágenes.

Por lo tanto, no utilice estructuras que no existan en todas las muestras. Ahora abra el primer archivo de imagen. Para evaluar, seleccione la pestaña plugins en la barra de herramientas principal y elija selector de puntos.

En el menú desplegable, seleccione la pestaña Agregar puntos y coloque los puntos de referencia en la imagen. Aparecen como multicolores. Las cruces cambian entre puntos de referencia con la herramienta Mover cruces.

Una vez que todos estén colocados, seleccione la pestaña de resultados de visualización en la barra de herramientas principal y elija la opción mostrar. Esto muestra las coordenadas del punto de referencia. A continuación, copie las coordenadas en un programa de hoja de cálculo en una fila vacía encima del tipo de datos pegado igual a LM seguido del número de puntos de referencia en la muestra en la fila siguiente.

El ID de tipo de datos pegado es igual seguido del nombre que identifica la muestra. Cada muestra debe tener un identificador único. Repita este proceso hasta que todas las imágenes de muestra se hayan mapeado e ingresado en la hoja de cálculo.

A continuación, copie las columnas con una identificación de muestra y las coordenadas de cada punto de referencia y guárdelo en un documento de texto. A continuación, abra el programa de software morfométrico. En este software, seleccione crear nuevo conjunto de datos en el menú principal.

Asigne un nombre al archivo y al conjunto de datos en la pantalla emergente e importe el archivo como TPS. Ahora seleccione un archivo de texto de coordenadas para crear el conjunto de datos. A continuación, realice un ajuste y alineación de procusto.

En primer lugar, resalte el conjunto de datos en la pestaña del árbol del proyecto. A continuación, elija preliminares en la barra de herramientas principal y nuevo ajuste de procusto en el menú desplegable. De las selecciones disponibles, elija alineado por eje principal.

A continuación, seleccione la opción para realizar el ajuste de Crusty en el menú desplegable de preliminares, seleccione generar matriz de Covance y seleccione Ejecutar. Ahora, desde la pestaña de resultados, vea las correlaciones de la matriz de Covance. Para distinguir las muestras experimentales de las del grupo de control, cree un archivo clasificador asignando cada muestra del conjunto de datos a la variable clasificadora adecuada.

En una hoja de cálculo, cree una columna con la etiqueta ID y una columna con la etiqueta tratamiento. A continuación, enumere cada muestra en la columna ID y asígnela a un grupo. En la columna de tratamiento, guárdelo como un archivo de texto y, en el programa de software morfométrico, impórtelo a través de la opción elegir coincidencia por identificador.

Ahora, en la pestaña de comparación, cree una transformación de análisis de función discriminante en el menú emergente. En esta función, asegúrese de que se selecciona el conjunto de datos adecuado y que el tipo de datos son las coordenadas de ajuste de Procusto. Resalte los pares de grupos que se van a comparar y, a continuación, ejecute una prueba de 1000 permutaciones.

Para ver el mapa vectorial de las coordenadas, vaya al menú de gráficos y seleccione la pestaña de diferencia de forma. Si la imagen está invertida, abra el menú emergente en el espacio de trazado para voltear el diagrama a la orientación correcta. Además, en el menú emergente, cambie el gráfico a una cuadrícula de transformación para superponer los vectores a los detalles de una cuadrícula al crear un análisis de componentes principal.

Análisis de componentes principales de diagrama de dispersión. Cuadrículas de transformación CVA, diagrama de dispersión y cuadrículas de transformación CVA se proporcionan en el protocolo de texto. Los embriones fueron tratados con un receptor micromolar de ácido retinoico o un inhibidor de RAR desde la etapa de desarrollo 24 hasta la etapa 30, y luego se fijaron en la etapa 42 y se fotografiaron los embriones de control tratados con DMSO desarrollados.

Normalmente, el tratamiento con inhibidores de RAR resultó en un estrechamiento de la cara, anomalías oculares y una boca de forma triangular malformada. Después de realizar un análisis morfométrico geométrico, se evaluó la varianza mediante el análisis de componentes principales. Los embriones tratados se distinguieron claramente de los controles.

A lo largo del eje PC uno, las flechas identifican valores estadísticos atípicos dentro de un grupo. A continuación, se evaluaron las diferencias morfológicas mediante un análisis de funciones discriminantes. Los cambios drásticos en la posición de los puntos de referencia laterales indican un estrechamiento de la forma de la cara.

Las flechas notan un ligero desplazamiento hacia afuera en la posición de las fosas nasales. También hay una deformación notable en la región de la cara media. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar una combinación de medidas de tamaño tradicionales y morfometría geométrica para evaluar el tamaño y la forma de la cara embrionaria de Theus.