Un manual de la pantalla pequeña molécula Acercarse De Alto Rendimiento Utilizando embriones de pez cebra

El objetivo general del siguiente experimento es realizar un cribado químico en embriones de pez cebra mediante el procesamiento manual de muestras. Esto se logra colocando primero a los peces cebra adultos en cámaras de apareamiento con un divisor durante la noche, y luego retirando el divisor a la mañana siguiente para recolectar embriones. A continuación, los grupos de embriones de pez cebra se colocan en placas de 96 pocillos y luego se tratan con un fármaco en la etapa de desarrollo deseada.

A continuación, se permite que los embriones se desarrollen fijados con un 4% de paraldehído y se realizan ensayos para medir los efectos de las moléculas pequeñas en el proceso de desarrollo de interés. Los resultados muestran cambios en el desarrollo, como la ganancia o pérdida de dominios de expresión génica que pueden indicar alteraciones en el sulfato o la morfogénesis de los tejidos causados por las pequeñas moléculas que fueron interrogadas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento clínico de una variedad de enfermedades debido a la capacidad de identificar compuestos potencialmente terapéuticos.

Por lo general, las personas nuevas en esta técnica pueden tener dificultades porque necesitan adquirir la destreza necesaria para trabajar con embriones, como transferirlos entre placas de pocillos múltiples sin dañarlos. Eric Donahue, un investigador de pregrado en el laboratorio To set up zebra apareings, demostramos el procedimiento. Use cámaras de apareamiento con divisores, coloque el pez cebra macho adulto en un lado del divisor y el pez cebra hembra adulto en el otro lado.

Por cada placa de 96 pocillos de moléculas pequeñas que se van a analizar. Instala 25 tanques de acoplamiento y déjalos toda la noche. Al día siguiente, retire la cámara que separa cada pareja de peces y, después de una hora, use un colador de malla fina para recolectar los embriones antes de colocarlos en placas de Petri que contengan medio E tres con una pipeta de transferencia.

Retire los residuos de las placas y debajo de un estereoscopio. Observe cada nidada de embriones y retire los óvulos no fertilizados. Decantar el E tres medio y reemplazarlo por E tres fresco.

A continuación, coloque cada plato de embriones en una incubadora a 28,5 grados centígrados durante dos horas. Revise las placas nuevamente y deseche cualquier óvulo adicional sin fertilizar. Continúe incubando los embriones hasta la etapa del 40%.

Retire la placa de la biblioteca química a menos 80 grados centígrados. Use papel de aluminio para cubrirlo y deje que se descongele a temperatura ambiente con una pipeta de ocho canales. Agregue 99 microlitros de E tres a las columnas dos a 12 de una placa de 96 pocillos.

Luego agregue un microlitro de los compuestos apropiados a los pocillos en las columnas dos a 11 aquí, designados como las muestras experimentales Pipetee un microlitro de DMSO en la columna de control aquí diseñada para ser la columna 12. Use papel de aluminio para cubrir la placa de dilución y devuelva la biblioteca de productos químicos al congelador. A continuación, después de seleccionar una placa de Petri que contenga embriones en la etapa epi del 40%, use una pipeta de transferencia para colocar cuidadosamente alrededor de 10 embriones por pocillo en las columnas dos a 12 de un 96.

Plato de pozo. Utilice una pipeta de transferencia de vidrio para eliminar el exceso de E tres de cada pocillo y expulsarlo a un contenedor de residuos líquidos. Para tratar químicamente los embriones, transfiera 100 microlitros de cada dilución química de la placa de 96 pocillos al pocillo respectivo de los embriones para crear una cámara húmeda con una toalla de papel y colóquela en un recipiente sensible a la luz.

Lo suficientemente grande como para contener una placa de 96 pocillos. A continuación, utilice una alfombrilla de techo para sellar la placa. Colóquelo en el recipiente sensible a la luz e incube a 28,5 grados centígrados durante el tiempo deseado.

Para eliminar los productos químicos, agregue 300 microlitros de E tres a cada fila de pocillos tratados con medicamentos. A continuación, retire el medio antes de utilizar E tres para lavar los embriones tres veces para fijar los embriones, transfiéralos a cuatro placas de 24 pocillos marcadas colocando la pipeta delante de un fondo oscuro. Después de cada transferencia de pocillos, para identificar los embriones que quedan en la pipeta y evitar el cruzamiento, extraiga los embriones muertos.

Extrae el E tres de modo que los embriones queden apenas sumergidos en líquido. A continuación, utilice una pipeta de vidrio para añadir dos gotas de 50 miligramos por mililitro de pronasa a cada uno. Incubar los embriones durante cinco minutos antes de agitar los pocillos para que el Corian se rompa.

Después de usar E tres para lavar los embriones dos veces, retire y deseche los E tres restantes. Agregue 4% P-F-A-P-B-S a cada pocillo e incube los embriones durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, realice una prueba de detección de interés, como la hibridación in situ de montaje en agujero, o desee, como se describe en el protocolo de texto, puntuar los embriones a partir de la prueba química.

Transfiéralos a placas de 12 pocillos etiquetadas antes de usar un microscopio estereoscópico para observarlos como se describe en este diagrama. Es práctico que una sola persona realice un cribado genético químico en aproximadamente 600 compuestos en el transcurso de nueve semanas de esfuerzo dedicado, y ese tiempo puede reducirse a tres semanas si lo realizan tres personas. Por lo tanto, el tiempo de trabajo de una o unas pocas personas puede evitar la necesidad de equipos que requieren muchos recursos, como los sistemas automatizados.

Como se muestra aquí, los embriones de pez cebra se sometieron a compuestos individuales de una biblioteca bioactiva de 50% de personas a 24 HPF, y luego se analizaron por deseo, utilizando un cóctel de tres sondas ribogénicas para detectar segmentos de nefrona. Por ejemplo, en el sistema de clasificación, un compuesto que dio lugar a un túbulo contorneado proximal o PCT drásticamente agrandado se clasificará como clase uno, que representa la clase asociada con el defecto más grave y el nivel más alto de confianza en el fenotipo observado. A continuación, el compuesto se anotará como PCT de primera clase.

Además, esta clasificación proporciona una forma sencilla y rápida de describir una pequeña molécula de interés, incluida la gravedad de su efecto en el organismo, la región afectada por el fármaco y la forma en que se ve afectada la región. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los embriones deben clasificarse en el momento de desarrollo correcto. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una prueba química manual con embriones de pez cebra.