Name: Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. I. Colección de ejemplos de virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Aprenda el método EPA 1615 para muestrear aguas ambientales y potables mediante filtros electropositivos estériles. Esta técnica estandarizada permite detectar enterovirus y norovirus con alta fiabilidad en laboratorio.

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Los autores agradecen a numeroso personal de la EPA cuyas contribuciones hicieron el seguimiento realizado durante el ICR y UCMR3 posible, los siguientes investigadores principales de otros estudios de la EPA reportados: Daniel Dahling, Alfred Dufour, Andrey Egorov, Susan Glassmeyer, Asja Korajkic, Richard Lieberman, Robert Safferman, y Tim Wade; y Shannon Griffin y Michael Ware por su revisión crítica de este manuscrito. Los autores agradecen a los trabajos de agua Indian Hill para el uso de una de sus casas de la bomba para demostrar la recogida de muestras. Aunque este trabajo fue revisado por la USEPA y aprobado para su publicación, es posible que no reflejan necesariamente la política oficial Agencia. La mención de nombres comerciales o productos comerciales no constituye un endoso o recomendación para su uso.

1. Procedimientos preliminares <ol><li> Montar un aparato de filtro estándar como se muestra en la Figura 1 que consta de un módulo de entrada, un módulo de alojamiento de cartucho, y un módulo de descarga como se describe en Materiales suplementarios. </li><li> Calibrar el flujo metros / totalizador con los caudales utilizados para el muestreo antes del primer uso. Compruebe la calibración después del primer uso y después de un mes de uso. Si la calibración de caudal ha cambiado después de que cualquiera de la primera utilización o después del primer mes de uso, determinar la frecuencia de los controles de calibración como se describe en Materiales Complementarios. <ol><li> Conecte un módulo de descarga a un módulo de admisión y luego conectar el módulo de admisión a un grifo. Ajuste el flujo metros / totalizador de leer el caudal. Abrir el grifo por completo y luego ajustar el caudal de 10 l / min con la válvula de globo de bronce. Una vez que la velocidad de flujo es estable a 10 L / min, restablecer el flujo metros / totalizador para leer el volumen total. </li><li> Coloque el cabosuelte el módulo de descarga en un 4 L o mayor cilindro graduado y restablezca simultáneamente el totalizador a cero. Medir la lectura totalizador en la marca de 4-L y el tiempo requerido para alcanzar la marca de 4 L en el cilindro. Cambie el flujo metros / totalizador retrasando al caudal. NOTA: Si el caudal había caído a menos de 9,95 L o aumentado a más de 10,05 L después de completar el paso 1.2.2, espere hasta que el caudal sea estable y repita el paso 1.2.2. Un medidor calibrado correctamente alcanzará la marca de 4 L en el cilindro graduado a 24 ± 1 seg con una lectura totalizador de 4,0 ± 0,04 L. </li><li> Si la lectura del totalizador es de menos de 3,96 o más de 4,04 L, calcular un factor de corrección necesaria para ajustar la diferencia observada. Por ejemplo, si el flujo metros / totalizador lee 3,9 L en la marca de 4 L en el cilindro graduado, el factor de corrección sería 1,026 (4 ÷ 3,9). Así, si el volumen deseado de una muestra de campo fueron 300 L, el volumen recogido según la reading en el flujo metros / totalizador debe ser de 300 ÷ 1.026 = 292,4 L. </li></ol></li><li> Esterilizar el aparato de filtro estándar y prepararlo para la recogida de muestras. <ol><li> Esterilizar los módulos de alojamiento de admisión y de cartucho con 0,525% de hipoclorito de sodio durante al menos 30 min antes de cada uso por inmersión, ya sea por completo los módulos en las soluciones o haciendo circular el hipoclorito de sodio, aunque los módulos usando una bomba. Enjuagar los módulos con dH 2 O estéril y luego eliminar el cloro en una solución que contiene 50 ml de 1 M de tiosulfato de sodio por litro de agua estéril de grado reactivo durante 5 min. Cubra el módulo de aparato de muestreo del filtro termina con papel de aluminio estéril. </li><li> Añadir un filtro de cartucho de electropositivo al módulo de alojamiento de cartucho asépticamente. NOTA: Tenga cuidado de asegurarse de que el filtro de cartucho está colocado correctamente en los alojamientos. Correctamente filtros sentados no se escapará y el filtro no se moverán dentro de la caja cuando se agita. Las juntas sobre aproperly filtro sentado tendrá hendiduras visibles que muestran que los contactos de filtro ellos. Las juntas siempre deben ser revisadas para hendiduras inmediatamente después del filtro se retira de la vivienda. </li><li> Graba un número de muestra única en una hoja de datos de muestra (ver Materiales Suplementarios para un ejemplo) y luego lleve o envíe el aparato de muestreo del filtro y la Muestra de Hoja de Datos de la persona que va a recoger la muestra de campo, junto con las instrucciones oportunas sobre la muestra colección (por ejemplo, volumen de la muestra, lugar de muestreo, etc.). </li></ol></li></ol> 2. Preparación para la recogida de muestras en el Sitio de Muestreo <ol><li> Lávese las manos a su llegada al lugar de recogida y ponerse guantes quirúrgicos para reducir al mínimo la posibilidad de contaminación de la muestra. No recoger muestras si experimenta síntomas intestinales o respiratorias. Cambiar los guantes con frecuencia, y especialmente después de tocar los grifos de agua y otros artículos que pueden ser contaminado. </li><li> Record muestra pertinente seguimiento de la información en una hoja de datos de la muestra. La información relevante incluye el sitio y la identificación de la muestra, el nombre del sampler, y modelos de equipos y números de serie. </li><li> Abrir el grifo de agua durante 2-3 min para eliminar cualquier residuo que se ha instalado en la línea. Si es necesario, utilice una manguera o tubería para llegar a un drenaje durante este paso. </li><li> Si se conectan los módulos de aparato de muestreo, desconectar y proteger los extremos abiertos del módulo de alojamiento del cartucho con papel de aluminio estéril. Conecte el módulo de descarga al módulo de admisión y luego conectar tanto al grifo de agua. Conectar una manguera de jardín en el extremo del módulo de descarga y colocar el extremo libre en el recipiente de polipropileno 1 L. </li><li> Abra el grifo y pasar al menos 75 litros de agua a muestrear a través del aparato. <ol><li> Medir y registrar los parámetros de calidad del agua durante el período de color en el agua que fluye en el polipropileno resid recipiente de cloroUAL, pH, temperatura y turbidez. </li><li> Después de apagar el agua en el grifo, desconecte el módulo de descarga del módulo de admisión y, a continuación, conecte el módulo de alojamiento del cartucho a la salida del módulo de admisión y el módulo de descarga a la salida del módulo de alojamiento del cartucho. Restablecer el totalizador lectura a cero. </li></ol></li></ol> 3. El campo de recogida de muestras <ol><li> Registre la lectura inicial totalizador junto con la fecha y la hora y luego abrir lentamente el grifo de agua. <ol><li> Asegúrese de que la carcasa del cartucho está en una posición vertical y que llena completamente con agua. Algunas viviendas tienen un botón de ventilación que puede ser presionado para expulsar el aire de la vivienda durante el proceso de llenado. </li><li> Abra completamente el grifo. Ajuste el caudal de 10 l / min con la válvula de globo de bronce y luego registrar el caudal inicial. </li></ol></li><li> Pase 300 L de agua superficial o 1500 a 1800 L de agua subterránea a través del aparato usandolas lecturas del totalizador (ajustado, si es necesario). Si los zuecos de filtro antes el volumen requerido se alcanza y más de la mitad del volumen se ha recogido, use un segundo módulo de la carcasa del filtro para recoger la muestra restante, si está disponible. </li><li> Observar el caudal como el volumen de la muestra se acerca al final del período de muestreo y luego apagar el flujo de agua en el grifo de la muestra. Registre el tipo final flujo, fecha, hora del día, la lectura totalizador final, y el volumen total de la muestra. </li><li> Desconecte el aparato de muestreo del filtro del grifo. Desconectar el módulo de alojamiento de cartucho de los otros módulos. <ol><li> Gire la caja (s) filtro boca abajo y deje que el exceso de agua salga hasta que no quede más agua se drene de los puertos de entrada y salida. </li><li> Gire la caja en posición vertical y cubrir las conexiones rápidas en cada extremo con papel de aluminio estéril. Coloque la carcasa en una o más bolsas de plástico sellables. </li><li> Escurrir el agua de la ingesta y dmódulos ischarge. Coloque los módulos en una o más bolsas de plástico herméticos. </li></ol></li></ol> 4. Envío de muestras de campo <ol><li> Coloque los módulos de aparatos de muestreo del filtro en un almacenaje y transporte refrigerador aislado. </li><li> Añadir bolsas de hielo congeladas o cubitos de hielo en doble bolsa para el almacenamiento y el transporte de más frío para asegurar que la muestra permanece entre 1-10 ° C durante el transporte. Dos grandes o 6-8 pequeñas bolsas de hielo deben ser suficientes. </li><li> Colocar un dispositivo para registrar la temperatura en el almacenamiento aislado y el pecho de transporte en una ubicación sin contacto para bolsas de hielo o bolsas de hielo. NOTA: El dispositivo de grabación de temperatura es opcional si el laboratorio de análisis se utiliza un termómetro de infrarrojos visual para medir la temperatura de la carcasa del cartucho inmediatamente a la llegada y la apertura del contenedor. </li><li> Rellene cualquier espacio vacío con el material de embalaje y luego colocar la hoja de datos de muestra, protegido en una bolsa de plástico con cierre, en top. Cierre el almacenamiento aislado y pecho transporte con cinta adhesiva para evitar cualquier fuga de agua. </li><li> Transportar o enviar la muestra al laboratorio de análisis. Asegúrese de que la muestra llega al laboratorio de análisis a más tardar 24 horas después del inicio de la recogida de muestras de campo (es decir, el tiempo registrado en el paso 3.1). </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Diferentes tipos de filtros para concentrar los virus de las aguas ambientales se han utilizado durante los años 26. Los métodos actuales emplean ultrafiltros 27, filtros electronegativos 13,28,29, filtros de lana de vidrio 23 y filtros electropositivos 30. Electronegativos filtros fueron ampliamente utilizados durante muchos años, pero un requisito para la adición de sal y el ajuste del pH del agua en el campo antes de o durante el muestreo limita su utilidad 13. La opción más práctica filtro para muestreo de campo son los filtros electropositivos. Estos filtros permiten el muestreo de grandes volúmenes de agua a altas velocidades de flujo y sin ningún tipo de acondicionamiento de agua. Filtros de lana de vidrio son la opción menos costosa, pero tienen tasas de flujo más lento que los filtros electropositivos y no están disponibles comercialmente. Ultrafiltros proporcionan las recuperaciones de virus más altos sobre una gran variedad de la calidad del agua, pero el equipo necesarios para sampling no es fácilmente portátil de campo y el tiempo requerido para recoger muestras es mucho más largo 27. Métodos se han desarrollado recientemente que el uso preacondicionado filtros electronegativos para evitar la necesidad de ajuste en el campo, pero éstos pueden no ser aplicables para la recogida de grandes volúmenes de muestra 28,29. Método EPA 1615 utiliza filtros de cartucho electropositivos que obtienen su carga positiva ya sea de nanofibras de óxido de aluminio o aminas cuaternarias. Las ventajas de la primera sobre la segunda es que es menos costoso y recoge eficientemente virus de las aguas a través de una gama más amplia de valores de pH natural 30,31; sin embargo, cada cartucho, así como los filtros de lana de vidrio utilizados por Borchardt y sus colegas dan las recuperaciones similares de enterovirus y norovirus de agua (23,31,32 Cashdollar, datos no publicados). Los filtros de cartucho se colocan en un aparato de muestreo simple que está diseñado para simplificar la toma de muestrasy reducir la contaminación durante el muestreo. Los métodos estándar tienen un valor incalculable cuando se llevan a cabo grandes estudios utilizando múltiples laboratorios analíticos. Método EPA 1615 proporciona procedimientos y orientaciones para minimizar los dos principales problemas de recogida de muestras que pueden afectar a los datos recogidos durante estos estándares estudios falsos resultados positivos que se derivan de la contaminación durante la recogida de muestras o de componentes del aparato inadecuadamente desinfectados, y la obstrucción de los poros del filtro por componentes en el agua que se muestrea. Al igual que los virus entéricos pueden propagarse de persona a persona debido a la falta de higiene, los virus pueden ser introducidos en las muestras de las manos o las manos mal lavadas con guantes contaminados 33. Es esencial que los samplers entienden las rutas potenciales de contaminación y el uso de una técnica aséptica durante el muestreo. Samplers deben entender que los guantes se usan principalmente para proteger la toma de muestras de la exposición y no proteja el aparato de la contaminación. Las manos deben lavarse antes hay que tener el inicio de muestreo y la atención durante la colocación de los guantes para evitar la mano de guante contaminación. Samplers con gastroenteritis o síntomas respiratorios no deben recoger muestras, como podrían ser el derramamiento de enterovirus o norovirus en niveles altos. En segundo lugar, se debe tener cuidado para evitar el arrastre de virus a partir de muestreos anteriores. Para minimizar esta fuente potencial de contaminación, el aparato de toma de muestras en el Método 1615 se modificó de la de la ICR al no incluir un regulador de presión y el medidor de presión entre la entrada y el módulo de alojamiento de cartucho. Estos componentes fueron retirados debido a las presiones observadas durante los eventos de muestreo fueron siempre por debajo de la máxima calificación de vivienda (por ejemplo, 125 psi para los contenedores de cartuchos de 5 pulgadas) y porque eran difíciles de desinfectar. Este último problema se demostró mediante el uso de equipos de controles en blanco en studies posterior a la ICR 6,20. El grado en que se ve afectada la ICR de datos es desconocida, pero probablemente pequeña; sólo había dos falsas muestras de evaluación del desempeño negativo positivo durante el estudio (datos no mostrados). Para reducir aún más la posibilidad de contaminación de arrastre, también se recomienda reemplazar los tubos módulo de entrada después de cada evento de muestreo. Es especialmente importante para asegurar una desinfección adecuada si el aparato se utiliza para un control de calidad o rendimiento que se sembró con virus. Antes de realizar la desinfección, la concentración de cloro libre debe medirse por cualquier pérdida durante el almacenamiento. Además de los cambios en la configuración del aparato descrito anteriormente, es esencial que blancos de equipo regulares pueden ejecutar para demostrar que la desinfección es eficaz. Método 1.615 mandatos que blancos de equipo se realizan utilizando aparatos que hayan sido desinfectados después de ser utilizado para el control de virus cabeza de serie, lo que simplificael procedimiento mediante la eliminación de la necesidad de pasar una solución de virus sin semillas a través del aparato antes de la desinfección. La concentración de desinfectante se aumentó a 0,525% de hipoclorito para el Método 1615, ya que se requiere esta concentración tanto para inactivar cualquier virus viables en el equipo y degradar los ácidos nucleicos. Por lo tanto, blancos de equipo deben ser analizados utilizando tanto el cultivo de células y ensayos de qPCR. Ambos tipos de filtros electropositivos estaban sujetos a la obstrucción durante los estudios reportados en la Tabla 1. Un número desconocido de muestras con volúmenes reducidos puede haber sido debido a errores de muestreo, tales como una mala interpretación del totalizador o una parada antes intencional de muestreo para conocer a otro plazo, especialmente para aguas con lecturas de turbidez de menos de 20 NTU. El grado de obstrucción depende tanto los parámetros de tipo de filtro y de calidad del agua. Prefiltros proporcionan alguna medida de mejora, pero si se utiliza, deben ser procesados ​​y analizadospor separado del filtro de electropositivo. La recomendación actual para el UCMR3 es que la muestra se recogerá sin prefiltros utilizando filtros basados ​​en nanofibras de óxido de aluminio de dos si por lo menos la mitad del volumen se pueden recoger mediante el primer filtro.

Virus entéricos humanos replican dentro del tracto gastrointestinal y se propagan a través de la vía fecal-oral. Estos virus se encuentran a menudo en las aguas residuales en altas concentraciones 1-3. Ellos pueden persistir en los efluentes de aguas residuales de 4,5 y en 6,7 superficie, suelo 10.8, y de consumo tratada 11 aguas. Cuando está presente, la concentración de virus en aguas ambientales en los EE.UU. normalmente es demasiado baja para la medición directa 12,13. Esto requiere que los virus se concentrarán a partir de grandes volúmenes de agua. Durante la colección de reglas de la Información (ICR) El monitoreo realizado por la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (USEPA) 14, las concentraciones de virus de muestras positivas en la fuente de agua de las grandes empresas de servicios públicos a nivel nacional a distancia ,009-19,7 número más probable de unidades infecciosas (MPN) / L. La concentración mediana y promedio de las muestras positivas fueron de 0,03 y 0,17 NMP / L para las fuentes de agua de los arroyos que fluyen, 0,01a 0,07 NMP / L para los de lagos y embalses, y 0,04-0,74 NMP / L para aquellos que utilizan las aguas subterráneas 11 (datos de la base de datos de acceso 18 meses ICR Aux1 de fecha 25/04/2000). Concentraciones de virus de muestras positivas de un estudio de las aguas subterráneas USEPA nacionales variaron desde 0,009 hasta 2,12 unidades infecciosas / L con la mediana y concentraciones medias de 0,13 y 0,29 unidades infecciosas / L 8. La concentración de virus en muestras de agua subterránea positivas fue mayor que las de corrientes de agua. La mayor parte de las instalaciones que utilizan agua subterránea en estos estudios obtienen agua de los acuíferos ubicados en las regiones cársticas. Estos, junto con los ubicados en la piedra caliza y cristalina (lecho rocoso fracturado) ajustes son propensos a tener concentraciones de virus más altos que en otros entornos 8,15,16. Métodos virus USEPA especifica los volúmenes de muestreo de 200 L (ICR) de 300 L (Método 1615) de las aguas superficiales y 1,000 L (ICR) para 1500 L (Método 1615) de las aguas subterráneas 17,18. Sin embargo, incluso con el uso degrandes volúmenes de muestra, la mayoría de las muestras de agua superficial y subterránea son negativos para el virus 8,11,19,20. Los virus presentes en las aguas superficiales representan un potencial riesgo para la salud de los consumidores de agua potable. La superficie Regla de Tratamiento de Aguas requiere todas las plantas de tratamiento que utilizan aguas superficiales para reducir las concentraciones de virus en al menos 4-log. Incluso con una reducción de 4-log, las concentraciones de virus infecciosos en las fuentes de agua tan pequeña como 0,0044 NMP / L podrían conducir a una infección por día suponiendo dicha exposición y tratamiento de condiciones medias y los parámetros de respuesta a la dosis de rotavirus 11,21. El riesgo de virus en las aguas subterráneas sin tratar podría ser incluso mayor debido a la falta de tratamiento y la aparición viral. Borchardt y sus colegas estiman que hasta un 22% de la gastroenteritis aguda en los adultos y el 63% en niños menores de cinco años podría ser debido al virus en el agua potable en las comunidades utilizando las aguas subterráneas no tratadas 19. USEPA Método 1615 fue desarrollado para detectar enterovirus y norovirus durante el ciclo tercero monitoreo de Seguimiento del Reglamento de Contaminantes No Regulados (UCMR3) 22 como un nacional de seguimiento a las conclusiones de Borchardt y colegas 19,23. El método USEPA fue diseñado principalmente para la medición de virus en sistemas que utilizan las aguas subterráneas no tratadas, pero fue escrito de manera más general para incluir otros tipos de matriz de agua. El nuevo método es un híbrido preservar muchos de los componentes del método de virus anterior utilizado durante el ICR 17, la adición de los procedimientos moleculares basa en el método de Borchardt et al. 19,23, y conjuntos de cebadores adicionales para norovirus 24. El propósito de este trabajo es describir el procedimiento de muestreo y los pasos necesarios para mantener la integridad de la muestra durante la recolección y envío. Una evaluación del método global se describe en Cashdollar et al. 25. Este protocolo cubre sencilla Collectio campon de las aguas superficiales y subterráneas, donde una bomba y prefiltro no son necesarios y donde no se requieren ajustes de pH o la presencia de un desinfectante en el agua a muestrear. Los requisitos de muestreo más complejos se describen en Fout et al. 17,18.

<table><tbody><tr><td>Botella de polipropileno de 1 L</td><td>Nalgene</td><td>2104-0032</td><td></td></tr><tr><td>Cuadrados de papel de aluminio</td><td>Cole-Parmer</td><td>06275-40</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab Series</td><td></td></tr><tr><td>Plástico</td><td>de burbujas U.S. Plastics</td><td>50776</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa cerrable</td><td>Uline</td><td>S-12283</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa cerrable</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>S31798C</tr><tr><td>Bolsas de hielo comerciales</td><td>Cole-Parmer</td><td>06345-20</td><td></td></tr><tr><td>Caja de seguridad</td><td>fría Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Esponja de gasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduado</td><td>Cole-Parmer</td><td>06135-90</td><td>4-L o más grande</td></tr><tr><td>Toallita Hype Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-412-56</td><td></td></tr><tr><td>Registrador de datos de temperatura iButtons</td><td>Maxim</td><td>DS1921G</td><td></td></tr><tr><td>Cofre de almacenamiento y transporte aislado</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-12</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de embalaje</td><td>U.S. Plastics</td><td>50083</td><td></td></tr><tr><td>Colorímetro de cloro portátil II kit de prueba</td><td>Hach</td><td>5870062</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de pH y temperatura</td><td>portátil Omega</td><td>PHH-830</td><td></td></tr><tr><td>Portátil medidor de turbidez</td><td>Omega</td><td>TRB-2020-E</td><td></td></tr><tr><td>cinta de rosca de PTFE</td><td>Cole-Parmer</td><td>08270-34</td><td>Úselo en todas las conexiones roscadas</td></tr><tr><td>Bomba, centrífuga de accionamiento magnético</td><td>Cole-Parmer</td><td>72010-20</td><td></td></tr><tr><td>Boquilla de reducción</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-87</td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito de sodio (NaClO)</td><td></td><td></td><td>Uso doméstico disponible localmente</td></tr><tr><td>Tiosulfato de sodio (Na2S2O3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217247</td><td></td></tr><tr><td>Guantes quirúrgicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Rotulador resistente al agua</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-290546</td><td></td></tr><tr>Composición de<td>los medios</td><td>Hipoclorito</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>sodio (NaClO)</td> <td>al 0,525%Prepare una solución de NaClO al 0,525% diluyendo lejía doméstica 1:10 en dH2O. Almacene soluciones de NaClO al 0,525 % durante un máximo de 1 semana a temperatura ambiente.</td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[cabecera]</td></tr><tr><td>1 M Tiosulfato de sodio (Na2S2O3) pentahidratado</td><td>Prepare una solución de 1 M disolviendo 248,2 g de Na2S2O3 en 1 L de dH2O.&nbsp; Almacene el tiosulfato de sodio hasta por 6 meses a temperatura ambiente.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

método epa 1615. la medición de enterovirus y norovirus ocurrencia en agua por cultura y rt-qpcr. i. colección de ejemplos de virus

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

El Método EPA 1615 se desarrolló con el objetivo de proporcionar un método estándar para medir enterovirus y norovirus en aguas ambientales y potables. El componente de muestreo estandarizado del método concentra los virus que pueden estar presentes en el agua mediante el paso de un volumen mínimo especificado de agua a través de un filtro de cartucho electropositivo. Los volúmenes mínimos especificados para aguas superficiales y terminadas/subterráneas son de 300 L y 1.500 L, respectivamente. Una limitación importante del método es la tendencia de los filtros a obstruirse antes de cumplir con el requisito de volumen de muestra. Los estudios que utilizaron dos opciones de filtro de cartucho diferentes, pero equivalentes, mostraron que la obstrucción del filtro era un problema con el 10% de las muestras con uno de los tipos de filtro en comparación con el 6% con el otro tipo de filtro. La obstrucción tiende a aumentar con la turbidez, pero no se puede predecir solo con las mediciones de turbidez. Desde el punto de vista del costo, una de las opciones de filtro es preferible a la otra, pero la calidad del agua y la experiencia con el sistema de agua que se va a muestrear deben tenerse en cuenta al hacer la selección del filtro.

La obstrucción del filtro es un problema potencial importante que se pueden encontrar con el Método de 1615. La obstrucción disminuye la velocidad de flujo de agua a través del filtro. En algunos casos esto se puede superar mediante la apertura de la válvula de globo para permitir un mayor flujo. En otros casos el filtro se vuelven completamente obstruido antes de que el volumen requerido ha pasado a través de él. La Tabla 1 muestra el porcentaje de muestras con volúmenes reducidos como una función del tipo de filtro, el tipo de agua, y la turbidez. La obstrucción se produjo con muestras tanto de aguas subterráneas y aguas superficiales, con el filtro basado en nanofibras-óxido de aluminio superando el filtro basado en amina cuaternaria de muestras de agua subterránea mientras que el revés fue el caso de las muestras de agua superficial. En general, el 6% de las muestras recogidas usando el filtro basado en amina cuaternaria tenían deficiencia de volumen mientras que el 10% de las muestras recogidas con los filtros basados ​​en nanofibras-óxido de aluminio no cumplió con el volumen mínimo requerido especificado debido a la obstrucción. En génerosl, la obstrucción se incrementó con la turbidez, pero un número de diferentes componentes contribuyen a la turbidez y algunos de ellos no conducen a la obstrucción. Por ejemplo, el 43% de todos los eventos que se producen obstrucción durante el estudio ICR se limita a dos sistemas fluviales (datos no mostrados). Durante el ICR el volumen objetivo mínimo para las aguas superficiales fue de 200 L. El volumen promedio obtenida durante el estudio fue de 217 ± 32 L con un volumen promedio de 208 L (datos de la base de datos de acceso 18 meses ICR Aux1 fechadas 04/25/2000) . Por lo tanto, el volumen completo puede ser recogido de muchas aguas incluso con altas turbiedades. El ICR requiere samplers utilizar un prefiltro cuando turbiedades eran más de 75 NTU, pero incluso con un prefiltro, el 34% de las muestras recogidas en aguas con turbidez más de 75 NTU obstruido. Método 1615 recomienda el uso de un prefiltro con aguas más de 50 NTU; Sin embargo, desde la publicación del Método 1615, varias opciones de prefiltro diferentes además de las enumeradas en el método han sidoprobado. Ninguno de estos resultado en una mejora significativa en el volumen de la muestra (datos no mostrados). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52067/52067fig1.jpg"> Figura 1. El aparato de filtro estándar. El aparato de filtro estándar consiste en la ingesta, la carcasa del filtro, y módulos de descarga (ver Materiales Suplementarios para una descripción de cada módulo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52067/52067fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Las muestras totales un </td><td> Número de muestras deficientes b </td><td> Porcentaje de muestras deficientes </td><td> Turbidez (NTU) </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> El agua subterránea utilizando NanoCeram Filtros c </td></tr><tr><td> 113 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> &lt;20 </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> Aguas Superficiales usando NanoCeram Filtros c </td></tr><tr><td> 83 </td><td> 12 </td><td> 14 </td><td> &lt;20 d </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 50 </td><td> 20 - &lt;50 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 83 </td><td> ≥ 50 d </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="230px" style="text-align:center"> NanoCeram total c </td></tr><tr><td> 210 </td><td> 22 </td><td> 10 </td><td> ≥ 0 </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="200px" style="text-align:center"> El agua subterránea utilizando 1MDS Filtros c </td></tr><tr><td> 374 </td><td> 75 </td><td> 20 </td><td> &lt;20 </td></tr><tr>ext-align: center "&gt; Aguas Superficiales usando 1MDS Filtros c </tr><tr><td> 2693 </td><td> 27 </td><td> 1 e </td><td> &lt;20 e </td></tr><tr><td> 505 </td><td> 36 </td><td> 7 f </td><td> 20 - &lt;50 f </td></tr><tr><td> 122 </td><td> 19 </td><td> 16 e </td><td> 50 - &lt;75 g </td></tr><tr><td> 175 </td><td> 60 </td><td> 34 e, f </td><td> ≥ 75 e, f, g </td></tr><tr><td colspan="4" fo:padding-left="240px" style="text-align:center"> 1MDS totales c </td></tr><tr><td> 3869 </td><td> 217 </td><td> 6 </td><td> ≥ 0 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Capacidad de filtrar un Las muestras proceden de los siguientes estudios de los que se dispone de datos de volumen y de turbidez:. 1) estudio ICR de la USEPA (datos de la base de datos de acceso 18 meses ICR Aux1 fecha 4/25/2000), 2) el estudio de las aguas subterráneas USEPA 8, 3) USEPA Lawrence y Lowell, MA estudio (datos no publicados), 4) estudio USEPA río Mississippi (datos no publicados), 5) Estudio de planta de tratamiento de agua potable de la USEPA (datos no publicados), 6) el método USEPA 1615 estudio de evaluación 25, y 7) los tres primeros meses del monitoreo UCMR3 (datos no publicados). b Muestras donde se recolectó el filtro obstruido antes de que el volumen mínimo de agua que se especifica para cada estudio. Esto fue de 200 L para las aguas superficiales y 1500 L para las aguas subterráneas, pero fue de 200 L para las fuentes de agua que estaban las aguas subterráneas en la USEPA ICR y 1893 L para el estudio de las aguas subterráneas de la USEPA. C La capacidad de recoger el mínimo completo volumen especificado es significativamente diferente para Las muestras recogidas usando NanoCeram y filtros 1MDS (P = 0,002) y entre las aguas superficiales y subterráneas tanto en general (P &lt;0,001) y para cada tipo de filtro (P &lt;0,001) mediante la prueba de Mann-Whitney suma de rangos. d &amp; #8211; g grupos con el mismo valor de superíndice son significativamente diferentes (P &lt;0.05) de acuerdo con la prueba de Kruskal-Wallis Un análisis de la varianza en la prueba de Rangos y por parejas procedimiento de comparación múltiple de Dunn. Para todas las pruebas estadísticas la variable dependiente es el volumen que pasa a través del filtro como una fracción del volumen mínimo especificado, pero con un valor máximo de 1,0.

El Método EPA 1615 utiliza un filtro electropositivo para concentrar enterovirus y norovirus en aguas ambientales y potables. Este manuscrito describe el procedimiento para recolectar muestras para los análisis del Método 1615.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. I. Colección de ejemplos de virus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un enfoque estandarizado para el muestreo de aguas ambientales y potables para detectar la aparición de virus entéricos basado en el método 1615 de la EPA. Esto se logra ensamblando primero un aparato de muestreo, esterilizando los módulos de entrada y carcasa de cartucho del aparato, y luego agregando asépticamente un filtro de cartucho electropositivo estéril. A continuación, se hace pasar un volumen definido de agua a través de un filtro electropositivo contenido en el aparato de muestreo.A continuación, el exceso de agua se drena del aparato y de la carcasa del filtro de cartucho, y el volumen muestreado se registra en una hoja de datos de muestra. Finalmente, los componentes del aparato de muestreo se empaquetan en un contenedor de envío más frío que se mantiene entre uno y 10 grados centígrados y se entregan a un laboratorio analítico. En última instancia, los enterovirus y norovirus en las aguas ambientales y potables se miden utilizando este procedimiento de muestreo como parte de un método general.Este procedimiento utiliza un filtro electropositivo para concentrar virus, algunas aguas potables ambientales. Hay varios otros tipos de filtros que se pueden utilizar para realizar este procedimiento. Uno es el filtro ultra y otro es un filtro cargado negativamente.La ventaja del filtro electro Posy sobre el filtro ultra es que el muestreo es aproximadamente dos veces y media más rápido. La recolección de virus mediante filtros cargados negativamente requiere un ajuste del pH mediante la adición de sales. La ventaja de cargar positivamente los filtros es que no se necesitan ajustes antes de la recolección de la muestra.Por lo general, las personas nuevas en este procedimiento tendrán dificultades para mantener la esterilidad y con condiciones inesperadas, como la ausencia de un grifo conveniente para la recolección de muestras. Dedemostrando el procedimiento hoy seremos yo, sha out, Jennifer Cash dollar y Eunice VER geese. Todos somos miembros del personal profesional del Laboratorio Nacional de Investigación de Exposición de la EPA en Cincinnati, Ohio.Para prepararse para la recolección de muestras, ensamble un aparato de filtro estándar como se muestra aquí que consta de un módulo de entrada, un módulo de carcasa de cartucho y un módulo de descarga como se describe en los materiales complementarios del protocolo de texto. Utilización de los caudales para el muestreo. Calibre el totalizador del medidor de flujo antes del primer uso conectando un módulo de descarga a un módulo de admisión y luego conectando el módulo de admisión a un grifo.Abra el grifo por completo y luego use la válvula de globo de bronce para ajustar el caudal a 10 litros por minuto. Una vez que el caudal se estabilice a 10 litros por minuto, reinicie el totalizador del medidor de flujo para leer el volumen total. A continuación, coloque la salida del módulo de descarga en un cilindro graduado de cuatro litros o más y, al mismo tiempo, reinicie el totalizador a cero.Mida la lectura del totalizador en la marca de cuatro litros y el temporizador requerido para alcanzar la marca de cuatro litros en el cilindro. Si la lectura del totalizador es inferior a 3,96 o superior a 4,04 litros, calcule un factor de corrección necesario para ajustar la diferencia observada. Por ejemplo, si el totalizador del medidor de flujo lee 3.9 litros en la marca de cuatro litros en el cilindro graduado, el factor de corrección sería 1.026 o cuatro dividido por 3.9 Para esterilizar el aparato de filtro estándar y prepararlo para la recolección de muestras, use hipoclorito de sodio al 0.525% para sumergir completamente los módulos de admisión y carcasa del cartucho y remojar durante al menos 30 minutos.Alternativamente, use una bomba para hacer circular la solución a través de los módulos. Use DH estéril dos O para enjuagar los módulos, y luego use una solución estéril de 50 mililitros de tiosulfato de sodio molar por litro de agua estéril de grado reactivo para declorar durante cinco minutos. Luego use papel de aluminio estéril para cubrir el aparato de muestreo del filtro.El módulo finaliza asépticamente. Agregue un filtro de cartucho electropositivo al módulo de la carcasa del cartucho, teniendo cuidado de que esté correctamente asentado. En las carcasas, registre un número de muestra único en una hoja de datos de muestra, y luego lleve o envíe el aparato de muestreo del filtro, la hoja de datos de la muestra y cualquier instrucción necesaria con respecto a la recolección de muestras a la persona que recolectará la muestra de campo Al llegar al sitio de recolección y después de lavarse las manos, use guantes quirúrgicos para minimizar la contaminación de la muestra.Cámbiese los guantes con frecuencia, especialmente después de tocar grifos de agua y otros artículos que puedan estar contaminados. Use una almohadilla que contenga hipoclorito de sodio para esterilizar el grifo del aparato de muestreo y las roscas internas de una manguera de jardín. Registre la información relevante de seguimiento de muestras en una hoja de datos de muestra, incluida la identificación del sitio y de la muestra, el nombre del muestreador, los modelos de equipos y los números de serie.Conecte la manguera de jardín al grifo. Coloque la salida de la manguera en un lugar donde el agua se pueda drenar de manera segura y luego abra el agua. Golpee durante dos o tres minutos para limpiar cualquier residuo que se haya depositado en la línea.Conecte el módulo de descarga al módulo de admisión y luego conecte ambos al grifo de agua. Conecte una manguera de jardín al extremo del módulo de descarga y coloque el extremo libre en el recipiente de propileno de un litro. A continuación, abra el grifo y pase al menos 75 litros del agua que se va a muestrear a través del aparato.Mida y registre los siguientes parámetros de calidad del agua durante el período de lavado en el agua que fluye hacia el recipiente de propileno, el pH residual del cloro, la temperatura y la turbidez. Después de cerrar el agua del grifo, desconecte el módulo de descarga del módulo de admisión y luego conecte el módulo de la carcasa del cartucho a la salida del módulo de admisión y el módulo de descarga a la salida del módulo de la carcasa del cartucho. A continuación, restablezca la lectura del totalizador a cero.Para comenzar la recolección de muestras de campo. Registre la lectura inicial del totalizador junto con la fecha y la hora, y luego abra lentamente el grifo de agua. Asegúrese de que la carcasa del cartucho esté en posición vertical y de que se llene completamente de agua.Ahora, abra el grifo por completo y use la válvula de globo de bronce para ajustar el caudal a 10 litros por minuto antes de registrar el caudal inicial. Usando las lecturas del totalizador, pase 300 litros de agua superficial o 1500 a 1800 litros de agua subterránea a través del aparato. Observe el caudal a medida que el volumen de la muestra se acerca al final del período de muestreo y, a continuación, cierre el flujo de agua en el grifo de muestreo, registre el caudal final, la fecha, la hora del día, la lectura final del totalizador y el volumen total de la muestra.Desconecte el aparato de muestreo del filtro del grifo. Desconecte el módulo de la carcasa del cartucho de los otros módulos. Dé la vuelta a las carcasas de los filtros y permita que el exceso de agua fluya hasta que no se drene más agua por los puertos de entrada y salida.Coloque la carcasa en posición vertical y use papel de aluminio estéril para cubrir las conexiones rápidas en cada extremo. Coloque la carcasa en una o más bolsas de plástico con cierre. Drene el agua de los módulos de entrada y descarga.Coloque los módulos en una o más bolsas de plástico herméticas para preparar las muestras para el envío. Coloque los módulos del aparato de muestreo de filtros en un refrigerador de almacenamiento y transporte aislado. Agregue bolsas de hielo congeladas o cubitos de hielo en bolsas dobles al refrigerador de almacenamiento y transporte para garantizar que la muestra permanezca entre uno y 10 grados centígrados.Durante el envío. Llene cualquier espacio vacío con material de empaque y luego coloque la hoja de datos de muestra en una bolsa de plástico hermética y colóquela encima del material de empaque. Cierre el almacenamiento aislado y el transporte del cofre, o envíe la muestra al laboratorio analítico.Si se va a enviar el cofre, séllelo con cinta adhesiva para evitar fugas. Asegúrese de que la muestra llegue al laboratorio analítico a más tardar 24 horas después del inicio de la recolección en el campo. La obstrucción del filtro es un problema potencial importante que se puede encontrar con el Método 1615, ya que disminuye el caudal de agua.Esta tabla muestra el porcentaje de muestras con volúmenes reducidos en función del tipo de filtro, el tipo de agua y la turbidez. Al filtrar muestras de agua subterránea, el filtro que contenía fibras de nano Illumina superó a un filtro basado en amina cuaternaria. El filtro a base de amina aria fue mejor para filtrar muestras de agua superficial.En general, el 6% de las muestras recogidas con el filtro basado en la media del cuaternario fueron deficientes en volumen. Mientras que el 10% de las muestras recolectadas con el óxido de aluminio, los filtros a base de nanofibras no lograron cumplir con el volumen mínimo especificado requerido debido a la obstrucción. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las condiciones estériles.Este es solo el primer procedimiento de un método general. A este procedimiento le seguirán la elución del filtro, la concentración secundaria y ensayos como el virus de cultivo total, el ensayo y los ensayos moleculares. Estos últimos ensayos son necesarios para medir realmente la ocurrencia y concentración del virus.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo recolectar muestras de virus de aguas ambientales y potables. No olvide que trabajar con patógenos virales puede ser peligroso y siempre debe tomar precauciones como el uso de guantes mientras realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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Entorno

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

Aquí presentamos un procedimiento para medir el total de virus cultivables utilizando la línea celular de riñón Buffalo Green Monkey. El procedimiento proporciona una herramienta estandarizada para medir la presencia de virus infecciosos en aguas ambientales y potables.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y la aparición norovirus en agua por cultura y RT-qPCR. II. Ensayo Virus Culturable total

Aquí presentamos un procedimiento para cuantificar enterovirus y norovirus en aguas ambientales y potables utilizando PCR cuantitativa con transcripción inversa. La recuperación media del virus de las aguas subterráneas con este procedimiento estandarizado del Método 1615 de la EPA fue del 20% para el poliovirus y del 30% para el norovirus murino.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. Parte III. Detección de virus por RT-qPCR

Se desarrolló y evaluó una metodología de muestreo basada en macroespuma para la detección y cuantificación de norovirus en superficies duras ambientales.

Método de muestreo hisopo para la Detección de norovirus humano en superficies

Se desarrolló un enfoque para identificar las condiciones óptimas de concentración viral para muestras de agua de pequeño volumen utilizando picos de adenovirus humano. Las técnicas descritas aquí se utilizan para identificar parámetros de concentración para otros objetivos virales y se aplican a la experimentación de concentración viral a gran escala.

Un procedimiento de volumen pequeño para la concentración viral del Agua

Este manuscrito describe un enfoque automatizado de selección del tamaño del gel para purificar fragmentos de ADN para la secuenciación de próxima generación. La tecnología Ranger proporciona una automatización completa de todo el proceso de carga de gel de agarosa, análisis electroforético y recuperación de fragmentos de ADN específicos, lo que permite bibliotecas de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento y alta calidad.

Automatizado Gel Tamaño Selección para mejorar la calidad de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación Preparado a partir de muestras de agua del medio ambiente

Se presenta un protocolo para la extracción y preconcentración de estradiol de muestras de agua mediante el uso de un sistema automatizado y miniaturizado.

Un método simple para la fase sólida automatizada Extracción de muestras de agua para análisis inmunológico de los pequeños contaminantes

Describimos un protocolo para la filtración de muestras de agua con un cartucho de filtro y la extracción de ADN ambiental (eDNA) sin tener que abrir la carcasa para quitar el filtro. Este protocolo está desarrollado para el metabarcoding del eDNA de los peces, pero también es aplicable al eDNA de otros organismos.

El uso de un cartucho de filtro para la filtración de agua Las muestras y extracción de ADN del Medio Ambiente

El artículo describe un método que incrementa el rendimiento mientras se equilibra el esfuerzo y precisión para la extracción de lípidos de las membranas celulares de los microorganismos para su uso en la caracterización tanto de los lípidos totales como de la abundancia relativa de los lípidos indicadores para determinar la estructura microbiana comunitaria en estudios con muchas muestras.

Un método de extracción y análisis de lípidos para caracterizar los microbios del suelo en experimentos con muchas muestras

Determinación de la diversidad fúngica dentro de un entorno es un método utilizado en los estudios de salud ocupacional para identificar riesgos para la salud. Este protocolo describe la extracción de ADN de muestras de aire ocupacional para la amplificación y secuenciación de regiones ITS hongos. Este método detecta muchas especies de hongos que pueden ser pasada por alto por los métodos de evaluación tradicionales.

Colección y extracción de muestras de aire profesional para análisis de ADN fúngico

Aprenda el método EPA 1615 para muestrear aguas ambientales y potables mediante filtros electropositivos estériles. Esta técnica estandarizada permite detectar enterovirus y norovirus con alta fiabilidad en laboratorio.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. I. Colección de ejemplos de virus (Video) | JoVE Journal

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. I. Colección de ejemplos de virus

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