Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

El objetivo general de este procedimiento es aislar las mitocondrias que respiran a partir de células cultivadas o tejido de ratón, y luego evaluar la fuerza de su potencial de membrana como medida del estado celular. En el caso de las células cultivadas, esto se logra primero colocando placas y luego tratando las células. A continuación, las células se homogeneizan y el homogeneizado se pasa a través de una aguja para liberar aún más las mitocondrias de las células.

En el caso del tejido de ratón, el hígado se extirpa del ratón y luego se homogeneiza en hielo con ambos tipos de material de partida. A continuación, se utiliza la centrifugación diferencial para aislar las mitocondrias del resto del contenido celular. Después de que las mitocondrias se someten a algún procesamiento, incluida la adición del tinte fluorescente sensible al potencial de membrana, se realizan mediciones de fluorescencia TMRE para calcular la fuerza del potencial de membrana.

En última instancia, la función mitocondrial y las perturbaciones en el potencial de membrana mitocondrial se pueden evaluar utilizando un colorante fluorescente sensible al potencial de membrana junto con un lector de placas fluorescentes Cuando se trata con acopladores e inhibidores mitocondriales comunes, aunque este método puede proporcionar información sobre la apoptosis inducida por citocinas y la disfunción de las mitocondrias en un LS.It también se puede aplicar a cualquier otro sistema donde la comparación entre dos o más muestras diferentes de sano frente a una enfermedad o dos especies diferentes de un animal con diferentes tasas metabólicas. La demostración visual de este método es fundamental. Como las mitocondrias, los pasos de aislamiento son difíciles de aprender.

Esto se debe a que hay muchos matices a la hora de realizar la técnica que pueden pasarse por alto en las secciones de método tradicionales. Comience este procedimiento con el crecimiento de células embrionarias de riñón humano como se describe en el protocolo de texto 48 horas antes de la placa de tratamiento con citocinas, 160, 000 células en un matraz T 1 75 para producir aproximadamente un 70% de densidad en el momento del tratamiento. Luego, el suero priva a las células 24 horas después aspirando el medio y reemplazándolo con el mismo volumen de medio libre de suero.

Por último, se tratan las células privativas de suero mediante la adición de citocinas solubilizadas directamente sobre los medios de cultivo celular para realizar el aislamiento de las mitocondrias. En primer lugar, aspire el medio y lave las células de adherencia dos veces con 15 mililitros de una solución salina tamponada con fosfato o PBS. Cada vez que siga el lavado, aspire el tampón y raspe el matraz para eliminar las células adheridas del fondo.

A continuación, añada 15 mililitros de un XPBS a cada matraz, agite y transfiera a tubos cónicos individuales de 15 mililitros en hielo. Una vez realizado el raspado, centrifugar los tubos durante cinco minutos a 700 veces G cuatro grados centígrados, utilizando una centrífuga de sobremesa con un rotor de cangilón oscilante después de la centrifugación, aspirar sobrenadantes y resus. Suspenda cada pellet en un mililitro de tampón de aislamiento mitocondrial.

A continuación, combine ambas suspensiones y transfiéralas a un pequeño recipiente de vidrio para su homogeneización en las mitocondrias resuspendidas y el tampón de aislamiento mitocondrial al recipiente de vidrio hasta que la solución llegue a la primera línea Con el mortero unido a un taladro, proceda a homogeneizar las células en hielo a velocidad media durante tres pasadas. Se debe tener cuidado de eliminar las burbujas de aire al colocar el mortero en la solución, no quitar el mortero por encima del líquido y usar una velocidad constante con pasadas continuas. Transfiera la solución homogeneizada a un tubo cónico de 50 mililitros.

A continuación, extraiga la solución en una jeringa de tres mililitros con una aguja de calibre 18, una en una pulgada y media, y expúsquela de nuevo en el tubo cónico sobre hielo con una aguja de media pulgada de calibre 27. Tenga cuidado de expulsar la solución contra la pared interior del tubo para utilizar esa fuerza para la ruptura de la membrana celular. Repita los pasos de la jeringa un total de cinco veces, luego transfiera la solución a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a 600 veces G cuatro grados Celsius en una centrífuga de mesa utilizando un rotor de cubo oscilante.

Las mitocondrias se encuentran en el sobrenadante después de este primer giro a baja velocidad, mientras que algunas membranas y células intactas se granulan, se retira cuidadosamente el sobrenadante y se distribuye entre tres tubos de 1,5 mililitros. A continuación, centrifugar los tres tubos en un rotor de ángulo fijo a 10.000 veces G cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Las mitocondrias de las células cultivadas tienen un color blanquecino.

Extraiga el hígado de cada animal y coloque un XPBS helado sin calcio ni magnesio para enjuagar la sangre. Transfiera el tejido hepático a un plato con hielo y córtelo en trozos finos con una hoja de afeitar nueva durante un minuto. A continuación, añada tejido y el tampón adecuado al recipiente hasta que el tampón llegue a la primera línea.

Proceda a homogeneizar el tejido en hielo con el mortero a mano durante cinco pasadas. Se debe tener cuidado de eliminar las burbujas de aire al colocar el mortero en la solución, no quitar el mortero por encima del líquido y usar una velocidad constante con pasadas continuas. Continúe procesando las muestras con centrifugación y homogeneización como se solicita en el protocolo de texto.

Después de combinar los nuevos sobrenadantes con el primer sobrenadante de cada muestra, centrifugar los tubos en un rotor de ángulo fijo a 10.000 veces G cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Aspire con cuidado la capa superior blanca y esponjosa con la punta de una pipeta y/o empujándola hacia los lados del tubo. A continuación, vierta suavemente el resto del sobrenadante y resus.

Suspender los pellets de mitocondrias hepáticas en 500 microlitros de aislamiento mitocondrial. Las mitocondrias tampón del hígado son de color marrón. Coloque rápidamente las muestras en hielo inmediatamente antes de que se establezcan las reacciones.

Diluye las mitocondrias a 0,5 miligramos por mililitro. Concentración de trabajo con tampón experimental. Agregue los tratamientos apropiados como se indica en el protocolo de texto para separar los tubos a una décima parte del volumen total de mitocondrias diluidas.

A continuación, coloque las mitocondrias diluidas en cada tubo de reacción y agite suavemente cada tubo para garantizar una mezcla adecuada. Incuba las reacciones en la mesa de trabajo durante siete minutos. A continuación, añada un volumen igual de dos tetraetilo micromolar, rod domine, éster etílico, TMRE abreviado al volumen de reacción mitocondrial.

Nuevamente, agite suavemente cada tubo para asegurar una mezcla adecuada. Después de incubar las reacciones en la mesa de trabajo durante siete minutos adicionales, granule las mitocondrias por centrifugación en un rotor de ángulo fijo a 10.000 veces G cuatro grados Celsius durante cinco minutos. A continuación, cargue la mitad del volumen sobrenadante de cada muestra en un 3 84.

La placa de pocillos, proceda a leer la fluorescencia de las muestras y luego calcule la diferencia de pliegue en la fluorescencia entre el control y cada tratamiento, como se describe en el protocolo de texto, el tratamiento de las células T HEK 2 93 con TNF, alfa IL, un beta, e IFN gamma durante 24 a 48 horas conduce a cantidades progresivas de muerte celular. La viabilidad celular se evaluó mediante ensayos de MTT que demuestran consistentemente que hay una disminución aproximada del 10% en la viabilidad celular con el tratamiento de 24 horas y una disminución aproximada del 20%. Con un tratamiento de 48 horas, las células tratadas con concentraciones similares producen resultados similares de muerte celular a las 48 horas.

Y el tratamiento con citocinas individuales revela que la disminución de la viabilidad se debe a efectos combinatorios. Los datos de viabilidad representan la desviación estándar media de tres experimentos separados. Cada ejecución por triplicado y la estanqueidad de las barras de error demuestran la reproducibilidad de los datos.

La disminución porcentual del potencial de membrana en las mitocondrias aisladas de las células tratadas con citocinas significa que la salud mitocondrial se vio afectada por los tratamientos con citocinas, lo que corrobora los datos de viabilidad posteriores a este procedimiento. Se pueden formar otros métodos, como la evaluación de una generación total de TP, un TP o el consumo de oxígeno, con el fin de evaluar preguntas adicionales como qué diferencias de energía y respiración entre las diferentes muestras. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar mitocondrias funcionales intactas y evaluar la fuerza de su potencial de membrana como reflejo del estado celular.