Name: La visualización no lítico exocitosis de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando microscopía de luz digital (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprende a visualizar la exocitosis no lítica de Cryptococcus neoformans desde macrófagos usando microscopía de luz digital. Este método permite observar interacciones célula-hongo durante 24 horas.

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Esta investigación fue financiada en parte por los premios NIH 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.

Todo el trabajo de los animales se realizó de conformidad con los reglamentos y directrices del Instituto de Estudios en animales en el Albert Einstein College of Medicine. 1. Crecimiento Condiciones de C. neoformans H99 (serotipo A) <ol><li> Crecer individuo C. neoformans (CN) colonias sobre placas de agar Sabouraud. </li><li> Un día antes del experimento, seleccione una colonia e inocular 10 ml de caldo de Sabouraud. </li><li> Permitir que la cultura de crecer durante la noche a 37 ° C con agitación a una velocidad de 250 rpm. </li></ol> 2 Aislamiento y preparación de Primaria hueso macrófagos de C57 / Bl6 Ratones <ol><li> La eutanasia a los ratones mediante la colocación de los animales en una cámara de CO 2 hasta que no la respiración por más tiempo. Como segunda medida, cervical dislocar el cuello antes de comenzar la disección. Esterilizar todo el cuerpo con un 70% de alcohol etílico. </li><li> Retire ambos fémures y los huesos de tibia y colocar en DMEM estéril. </li><li> Retire el exceso de tejido y músculo de usolicate limpia hasta que los huesos están completamente limpias. </li><li> Coloque los huesos intactos sólo en una placa de Petri que contiene 70% de alcohol etílico y se incuba durante 3 min para matar los microorganismos asociados. Quitar los huesos y el lugar en el plato de Petri con DMEM estéril. </li><li> Corte cuidadosamente los extremos de los huesos. Mantenga el hueso largo de un tubo cónico de 50 ml vacías colocado en hielo y enjuague cuidadosamente 10 ml de DMEM frío utilizando una aguja de 25 G a través de cada hueso. NOTA: Cada ratón producirá 4 huesos (2 fémures, tibias 2). Por lo tanto un ratón debe producir aproximadamente 40 ml de suspensión celular. </li><li> Centrifugar la suspensión celular a temperatura ambiente durante 10 min a 650 x g. </li><li> Durante esta centrifugación, preparar y esterilizar por filtración macrófagos de médula ósea alimentación de los medios de comunicación que consiste en DMEM suplementado con 20% L929, 10% de suero de ternera fetal, 10% NCTC-109, 1% de Pen-Strep, 1% HEPES, 1% de L-glutamina , 1% de aminoácidos no esenciales, 0,1% de 2-mercaptoetanol. </li><li> Resuspender el sedimento resultante con 10 ml de la alimentación de los medios de comunicación. Pase suspens celularesiones a través de un colador de 70 micras de células para alterar grupos de células y eliminar los residuos de gran tamaño. </li><li> Placa 1 ml de la suspensión celular en 10 ml de medio de alimentación en placas de Petri que se especifican para el uso de cultivo de tejidos (para un total de 10 placas). </li><li> Permitir que las células se adhieran a 37 ° C con 10% de CO 2. Añadir 5 ml de medio de alimentación fresca en el día 3 En el día 7, reemplazar por completo los medios de alimentación y los macrófagos están listos para ser utilizados. </li><li> El día antes del experimento, separar los macrófagos de la placa mediante la eliminación de los medios de alimentación y añadir 5 ml de una célula suave extracción de reactivos a la placa. </li><li> Incubar durante 5-10 minutos a 37 ° C y retirar los macrófagos con pipeteo suave. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 650 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender pellet en 1 ml de la alimentación de los medios de comunicación. Uso de una dilución 1:20, calcular la concentración de los macrófagos pipeteando 10 l de suspensión de células en un hemocitómetro. </li><li> El uso de 14 mm con fondo de cristal cajas de Petri, plato unconcentración de 1 x 10 5 macrófagos directamente sobre el pozo interior que tiene una capacidad máxima de 200 l, así que tome precauciones para no exceder este volumen, como se muestra en la Figura 4. </li><li> Permitir que las células se adhieren a la placa de Petri de vidrio mediante la colocación de los platos en un 37 ° C incubadora durante 1 hr. </li><li> Añadir 1-2 ml de la alimentación de medio suplementado con LPS a 1 mg / ml y IFNg en 500 u / ml y permiten a las células se incuban durante la noche. </li></ol> 3. Co-incubación de primaria murino macrófagos y C. neoformans <ol><li> En el día del experimento, eliminar 1 ml de células de cultivo de levadura y pellet inoculados durante la noche por centrifugación durante 5 min a 420 x g. </li><li> Lavar las células 3 veces con PBS estéril para eliminar los medios de comunicación y productos criptocócicas extracelulares como el glucuronoxylomanan polisacárido (GXM) a la velocidad y el tiempo mencionado anteriormente. </li><li> Resuspender sedimento celular en 1 ml de PBS estéril y crea una dilución 1: 100. Pipeta de 10 l de tél dilución en un hemocitómetro y contar las células. Añadir células de levadura a una MOI de 1: 5. Por ejemplo, si hay 1 x 10 5 macrófagos / bien, hacer una suspensión de células de 5 x 10 6 / ml de Cn y añadir 100 ml de esta solución por un importe total de 5 x 10 5 Cn. </li><li> Añadir el volumen calculado de suspensión de células criptocócica a 1 ml de medio de alimentación con el anticuerpo mAb 18B7 a una concentración de 10 mg / ml. Incubar suspensión de células a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Retire el medio de alimentación de fondo de cristal placa de Petri y se lavan con PBS 1x estéril. Añadir 100 l de opsonizado Cn directamente al bien. </li><li> Permitir que las células se incuban durante 2 horas a 37 ° C con 10% de CO 2. </li><li> Después de co-incubación, comprobar al microscopio que los macrófagos han interiorizado Cn. Para ser considerado interiorizado, células criptocócicas claramente deben ser vistos dentro de los confines de los macrófagos. </li><li> Lave 3x plato de Petri con PBS estéril para eliminar cualquier y toda extracellular Cn. </li><li> Añadir 1-2 ml de la alimentación de los medios de comunicación sin la adición de mAb 18B7, y establecer microscopio. </li></ol> 4. Visualizing no lítico exocitosis en Utilizando microscopía de luz digital en tiempo real NOTA: Para realizar estos experimentos, un microscopio que viene con una cámara de incubación adjunto que incluye CO 2 y la entrega se requiere una unidad de calentamiento. <ol><li> Antes del experimento, pre-calentar la cámara de incubación durante al menos 30 min a 37 ° C. Asegúrese de que la unidad de CO 2 lee 5% al inicio del experimento. </li><li> Lugar con fondo de cristal placa de Petri en la plataforma del microscopio, cubrir con CO 2 tapa y cierre todas las puertas para asegurar que no escapa el calor. </li><li> Usando el objetivo de 10X con el microscopio de contraste de fase en, se centran en un claro campo de macrófagos infectados. Basado en el experimento, determinar el objetivo utilizado por el número de macrófagos que ser estudiados. </li><li> Configure el software de microscopio para take una imagen cada 4 minutos durante un período de 24 horas. </li><li> Después de 24 horas, el experimento habrá llegado a su conclusión y se habrá recogido un total de 361 imágenes. Exportación de estas imágenes como .jpegs a una compresión del 5%. El uso de la imagen J software, ver las imágenes como una pila Visual a los 5 fotogramas por segundo. Si la película tiene que ser vista para su publicación o una presentación, guardarla como tampoco un avi o mov archivo dependiendo del formato funciona mejor para el espectador. </li></ol>

<ol><li>Voelz, K., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcal+Interactions+With+the+Host+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+cell%22%5BJournal%5D)">Cryptococcal Interactions With the Host Immune System.</a> Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).</li>
<li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcus+interactions+with+macrophages%3A+evasion+and+manipulation+of+the+phagosome+by+a+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen.</a> Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).</li>
<li>Sabiiti, W., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+infection+by+the+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Future+microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans.</a> Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).</li>
<li>Bliska, J. B., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pathogenic+bacteria+and+fungi+%E2%80%94+a+case+of+convergent+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).</li>
<li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+spread+and+massive+vacuole+formation+after+Cryptococcus+neoformans+infection+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+immunology%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages.</a> BMC immunology. 8 (1), 16(2007).</li>
<li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell-to-cell+spread+of+a+pathogenic+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+immunology%22%5BJournal%5D)">Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast.</a> BMC immunology. 8, 15(2007).</li>
<li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcus+neoformans+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).</li>
<li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).</li>
<li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans+escapes+macrophages+by+a+phagosome+emptying+mechanism+that+is+inhibited+by+Arp2%2F3+complex-mediated+actin+polymerisation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation.</a> PLoS pathogens. 6 (8), (2010).</li>
<li>Carnell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+driven+by+WASH+causes+V-ATPase+retrieval+and+vesicle+neutralization+before+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis.</a> The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).</li>
<li>Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+regulates+the+outcome+of+intracellular+macrophage+parasitism+by+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans.</a> Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).</li>
<li>Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lytic+expulsion%2Fexocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+genetics+and+biology%22%5BJournal%5D)">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tenemos que compiten intereses financieros u otros conflictos de intereses.

Aquí hemos descrito un método por el cual las interacciones fúngicas macrófagos pueden ser registradas y analizadas en tiempo real durante un período de 24 h. Nuestro laboratorio ha utilizado este protocolo para estudiar muchos de los aspectos temporales de la exocitosis no lítico y seguirá utilizando microscopía en tiempo real para determinar los componentes morfológicos que rodean este proceso. Para esta técnica para producir resultados ideales, especial atención se debe dar a ciertos paso...

Las fases de una infección por hongos entre las células criptocócica y macrófagos están bien documentados 1-3. Después de células de levadura son ingeridos por macrófagos, una variedad de interacciones pueden ocurrir: el macrófago puede lisar liberando su carga fúngica en el espacio extracelular, o podría controlar la infección por el mantenimiento de las células de levadura dentro de los confines de su membrana celular 4. Sin embargo, hace varios años un nuevo resultado fue descrita independientemente por dos grupos: exocitosis no lítico, un proceso en el que un macrófago borrado algunas o todas de las células criptocócica en el ambiente circundante o una célula vecina y ambos huésped y patógeno se mantienen viables 5 -8. Varios estudios han tratado de comprender los mecanismos moleculares detrás de esta interacción, pero todavía no tienen una comprensión completa de lo que impulsa a este fenómeno. La capacidad para capturar imágenes en tiempo real y luego analizar posteriormente múltiples Infected macrófagos permite responder a muchas preguntas sobre las propiedades físicas que rodean la exocitosis no lítico en cuanto a tiempo, la capacidad espacial, el cambio en la morfología e incluso el estrés de los macrófagos durante una infección por hongos. Al permitir que las células que se encuentran en un entorno que sea comparable a la de una incubadora, podemos vislumbrar la naturaleza dinámica de las interacciones de células de tipo macrófago por hongos. Los investigadores han utilizado esta técnica para estudiar diversos componentes de este proceso. El papel del fagosoma en este proceso se hizo evidente mediante la tinción de actina fluorescente y agentes de bloqueo 9, mientras que otro grupo utilizó este método para mostrar que la exocitosis no lítico fue bloqueada en las células que han tenido la nucleación WASH dominios de la proteína suprime 10. El efecto de la señalización de citoquinas también ha sido comprobada mediante microscopía en tiempo real 11. Este proceso no se limita a C. neoformans como también se ha observado con Candida albicans, another patógeno fúngico que tiene la capacidad de infectar a los macrófagos 12. Estos hallazgos son ejemplos de cómo este método puede proporcionar una gran cantidad de información a un área que sabemos tan poco.

<table><tbody><tr><td>Sabouraud Agar Dextrosa</td><td>BD</td><td>DF0109-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Caldo de Dextrosa</td><td>BD</td><td>DF0382-17-9</td><td></td></tr><tr><td>Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Berf Serum (FCS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td></td></tr><tr><td>NCTC 109</td><td>Invitrogen</td><td>21340-039</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HEPES</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>3003 Placas de Petri de cultivo de tejidos&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-056-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Mat-tek Placas de cultivo con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L3137</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IFN-g</td><td>Roche</td><td>NC 9222016</td><td></td></tr><tr><td>mAb 18B7</td><td>Anticuerpo no comercial producido en nuestro laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M Microscopio con cámara de incubación</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la visualización no lítico exocitosis de cryptococcus neoformans de macrófagos usando microscopía de luz digital

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Muchos aspectos de la infección de macrófagos por Cryptococcus neoformans han sido ampliamente estudiados y bien definido. Sin embargo, una interacción particular que no se entiende claramente es la exocitosis no lítico. En este proceso, las células de levadura se liberan en el espacio extracelular mediante un mecanismo mal entendido que deja tanto el macrófago y Cn viable. Aquí se describe cómo seguir un gran número de macrófagos infectados individualmente para un período de infección 24 h por microscopía de tiempo transcurrido. Macrófagos infectados se encuentran en una cámara de calentamiento con una atmósfera de CO 2 unido a un microscopio que ofrece las mismas condiciones que una incubadora de cultivo celular. Microscopía digital de vivo puede proporcionar información acerca de las interacciones dinámicas entre un huésped y patógeno que no está disponible a partir de imágenes estáticas. Ser capaz de visualizar cada célula infectada puede proporcionar pistas sobre cómo los macrófagos manejan las infecciones por hongos, y viceversa. Esta técnica isa poderosa herramienta en el estudio de las dinámicas que están detrás de un fenómeno complejo.

Las imágenes que esta técnica produce pueden ser analizados en una variedad de maneras de recoger información en torno a lo que sucede después de las células han fagocitado C. neoformans. Como se ve en la Figura 1, hay aproximadamente 100 macrófagos que están infectados o no infectados. Cada uno de estos macrófagos da al espectador la oportunidad de estudiar las interacciones huésped-patógeno en un nivel muy microscópico. Como muestran las figuras 2 y 3 muestra...

Se describe cómo visualizar macrófagos C. neoformans (Cn) interacciones en tiempo real, con especial énfasis en el proceso de exocitosis no lítico usando microscopía de luz digital. Usando esta técnica de forma individual los macrófagos infectados se puede estudiar para determinar varios aspectos de este fenómeno.

La visualización no lítico exocitosis de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando microscopía de luz digital

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la exocitosis no lítica de Cryptococcus neoformans a partir de macrófagos neuronales primarios de la médula ósea. Esto se logra primero colocando placas e infectando neuromacrófagos activados con células fúngicas para permitir la fagocitosis y la internalización de Xeomin. El segundo paso es eliminar las células fúngicas extracelulares para garantizar una monocapa clara de macrófagos infectados y no infectados.A continuación, los macrófagos se incuban en una cámara de dióxido de carbono a temperatura controlada y se registran durante 24 horas para capturar casos de exocitosis no lítica y otras interacciones. El paso final es crear una película comprimiendo todos los fotogramas realizados en un período de 24 horas. En última instancia, la visualización de macrófagos con microscopía óptica digital se utiliza para observar la variedad de tipos de exocitosis no lítica que sufren los macrófagos a lo largo de una infección de 24 horas.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción huésped-patógeno, como el tiempo y la cuantificación de eventos celulares. El día anterior al experimento, seleccione una colonia individual de capataz mayor que se cultivó en una placa de agar sbarro e inocule. 10 mililitros de caldo sbarro. Deje que el cultivo crezca durante la noche a 37 grados centígrados, agitando a una velocidad de 250 RPM después de la eutanasia de ratones como se describe en el protocolo escrito.Esterilizar todo el cuerpo con alcohol etílico al 70%. Retire ambos fémures y tibia y coloque los huesos en dúos estériles, medio de águila modificado o DMEM. A continuación, retire el exceso de tejido y músculo con toallitas delicadas hasta que los huesos estén completamente limpios.Coloque solo los huesos intactos en una placa de Petri que contenga alcohol etílico al 70% e incube durante tres minutos para matar los microorganismos asociados. Retire los huesos y colóquelos en una placa de Petri con DMEM estéril. A continuación, corta con cuidado los extremos de los huesos.Sostenga el hueso sobre un tubo cónico MT de 50 mililitros colocado sobre hielo y use una aguja de calibre 25 para enjuagar cuidadosamente 10 mililitros de DMEM frío a través de cada hueso. A continuación, centrifugar la suspensión celular recogida a temperatura ambiente durante 10 minutos a 650 veces G. Durante esta centrifugación, prepare y filtre los medios de alimentación de macrófagos de médula ósea como se describe en el protocolo de texto. A continuación, vuelva a suspender la paleta resultante con 10 mililitros de medio de alimentación.Pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micrómetros para interrumpir los grupos celulares y eliminar los desechos grandes. A continuación, coloque un mililitro de la suspensión de la célula de deformación en 10 mililitros de medios de alimentación, placas de Petri especificadas para su uso en cultivos de tejidos. Permita que las células se adhieran a 37 grados centígrados con un 10% de dióxido de carbono durante siete días.Cambiar los medios de alimentación como se describe en el protocolo de texto el día anterior al experimento. Separe los macrófagos de la placa retirando el medio de alimentación y agregue cinco mililitros de un reactivo de extracción celular suave a la placa después de la incubación de las células durante cinco a 10 minutos. A 37 grados centígrados, retire los macrófagos con un pipeteo suave.Granular las células por centrifugación a 650 veces G durante 10 minutos antes de reutilizar, doblando el pellet en un mililitro de medio de alimentación. Usando una dilución de uno a 20, calcule la concentración de macrófagos pipeteando 10 microlitros de la suspensión celular en un hemocímetro usando un fondo de vidrio de 14 milímetros. Las placas de Petri colocan una concentración de uno por 10 a la quinta macrófaga directamente en el pocillo interior, que contiene un máximo de 200 microlitros.Tenga cuidado de no exceder este volumen. Permita que las células se adhieran a la placa de Petri de vidrio colocando las placas en una incubadora a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, añada uno o dos mililitros de medio de alimentación suplementado con lipopolisacárido a un miligramo por mililitro e interferón gamma.A 500 unidades por mililitro, deje que las células se incuben durante la noche el día del experimento. Extraer un mililitro de un cultivo de células G inoculado durante la noche y triturar las células de levadura mediante centrifugación durante cinco minutos de 420 veces G.To eliminar los medios y los productos criptocócicos extracelulares, lavar las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato o PBS seguido de una centrifugación como antes. Después de resus, suspender el pellet de células de levadura en un mililitro de PBS estéril y hacer una pipeta de dilución de uno a 100, 10 microlitros de la dilución en un hemocitómetro y contar las células.Calcule la concentración de células de levadura necesarias para una multiplicidad de infección de una a cinco. Agregue el volumen calculado de suspensión de células criptocócicas a un mililitro de medio de alimentación con el anticuerpo monoclonal, 18 B siete a una concentración de 10 microgramos por mililitro. Incubar la suspensión celular a temperatura ambiente durante cinco minutos.A continuación, retire los medios de alimentación de la placa de Petri de vidrio y lave los macrófagos una vez con PBS estéril. A continuación, añada 100 microlitros de opsonize cmin directamente al pocillo, seguido de la incubación con la levadura durante dos horas a 37 grados centígrados y con un 10% de dióxido de carbono. Después de la coincubación, se ha comprobado al microscopio que los macrófagos han internalizado c eFormas para ser consideradas células criptocócicas internalizadas deben verse claramente dentro de los confines del macrófago, como lo indica la gran punta de flecha.La punta de flecha más pequeña indica un macrófago no infectado sin células fúngicas. Lave la placa de Petri tres veces con PBS estéril para eliminar todos y cada uno de los neoformanos c. A continuación, añada uno o dos mililitros de medio de alimentación sin el anticuerpo monoclonal para realizar estos experimentos.Antes del experimento, se requiere un microscopio equipado con una cámara de incubación adjunta que incluya suministro de dióxido de carbono y una unidad de calentamiento. Precaliente la cámara de incubación durante al menos 30 minutos a 37 grados centígrados. Asegúrese de que la unidad de dióxido de carbono lea 5% al comienzo del experimento.Coloque la placa de Petri con fondo de vidrio en la cubierta de la plataforma del microscopio con un dióxido de carbono encendido y cierre todas las puertas para asegurarse de que no se escape el calor usando el objetivo de 10x con el microscopio en contraste de fase, concéntrese en un campo claro de macrófagos infectados, configure el software del microscopio para tomar una imagen cada cuatro minutos durante un período de 24 horas. Después de 24 horas, el experimento habrá finalizado y se habrán recogido un total de 361 imágenes. Exporte estas imágenes como JPEG con una compresión del 5%.Con el software image J, vea las imágenes como una pila visual a cinco fotogramas por segundo. El fotograma inicial de la película muestra muchos macrófagos en todo el campo, algunos que no están infectados y otros que tienen cantidades variables de células criptocócicas. A medida que avanza la película, las células son todas mo y se pueden ver moviéndose por el campo en esta película, está claro que las células criptocócicas están dentro de los confines de un macrófago infectado.El macrófago se agita y se puede ver una célula de levadura, pero dentro de la zona FGA, las células criptocócicas se expurgan rápidamente en el entorno circundante. Un segundo macrófago infectado sufre exocitosis no lítica y se liberan más células de levadura en el espacio extracelular. Las células huésped permanecen viables después de la exocitosis criptocócica, como lo indica su capacidad para continuar moviéndose.En ocasiones, los macrófagos interactúan de tal manera que facilitan la transferencia de células criptocócicas entre células huésped. Las células de levadura no se exponen al entorno extracelular y las células huésped siguen siendo viables. En esta película, dos macrófagos infectados crean puentes de célula a célula en dos ocasiones distintas para transportar células criptocócicas de un macrófago a otro.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la microscopía óptica digital para visualizar macrófagos que experimentan exocitosis no lítica y otras interacciones entre patógenos del huésped.

visualizing-non-lytic-exocytosis-cryptococcus-neoformans-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

En este video, demostramos un ensayo de citotoxicidad para evaluar la infección por Cryptococcus neoformans, un hongo patógeno, en macrófagos. La citotoxicidad está determinada por la liberación de la enzima lactato deshidrogenasa citoplasmática debido a la lisis de macrófagos causada por la infección por Cryptococcus neoformans.

Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa para detectar la infección por Cryptococcus neoformans en macrófagos

Este video muestra un ensayo para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos derivados de la médula ósea (BMM). Las células macrófagas están infectadas con los estadios invasivos móviles y no móviles de Leishmania, promastigotes metacíclicos y amastigotes, respectivamente. Los parásitos invaden los macrófagos, se internalizan en una vacuola parasitófora y se multiplican en su interior. El crecimiento intracelular del parásito se cuantifica utilizando un microscopio tras...

Un ensayo in vitro para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos

Se describen métodos para la microscopia de vídeo en vivo de células...

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Aquí, demostramos cómo citometría de imagen se puede utilizar para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con células huésped en cultivo. Esta técnica se puede utilizar como una alternativa a la CFU enumeración.

El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped

Un método para evaluar la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratón para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados por microscopía confocal.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

En este artículo, se describe un protocolo para la infección de macrófagos con Cryptococcus neoformans. Además, se explica un método para la depleción de esteroles de los macrófagos. Estos protocolos proporcionan una guía para estudiar las infecciones fúngicas in vitro y examinar el papel de los esteroles en dichas infecciones.

El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Aquí describimos una técnica basada en microscopio para visualizar y cuantificar las cascadas tempranas de eventos durante la fagocitosis de patógenos como los hongos Candida albicans y partículas que miden más de 0,5 μm, incluyendo zymosan y perlas recubiertas de IgG.

La visualización de las primeras etapas de la fagocitosis

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Este artículo detalla un protocolo para preparar un cocultivo de células criptocócicas y amebas que se estudia utilizando imágenes fijas fluorescentes e imágenes de microscopio electrónico de transmisión de alta resolución. Aquí se ilustra cómo los datos cuantitativos pueden complementar esa información cualitativa.

Uso complementario de técnicas microscópicas y lectura de fluorescencia en el estudio de las interacciones Cryptococcus-Amoeba

Aprende a visualizar la exocitosis no lítica de Cryptococcus neoformans desde macrófagos usando microscopía de luz digital. Este método permite observar interacciones célula-hongo durante 24 horas.

La visualización no lítico exocitosis de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando microscopía de luz digital

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