La visualización no lítico exocitosis de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando microscopía de luz digital

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la exocitosis no lítica de Cryptococcus neoformans a partir de macrófagos neuronales primarios de la médula ósea. Esto se logra primero colocando placas e infectando neuromacrófagos activados con células fúngicas para permitir la fagocitosis y la internalización de Xeomin. El segundo paso es eliminar las células fúngicas extracelulares para garantizar una monocapa clara de macrófagos infectados y no infectados.

A continuación, los macrófagos se incuban en una cámara de dióxido de carbono a temperatura controlada y se registran durante 24 horas para capturar casos de exocitosis no lítica y otras interacciones. El paso final es crear una película comprimiendo todos los fotogramas realizados en un período de 24 horas. En última instancia, la visualización de macrófagos con microscopía óptica digital se utiliza para observar la variedad de tipos de exocitosis no lítica que sufren los macrófagos a lo largo de una infección de 24 horas.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción huésped-patógeno, como el tiempo y la cuantificación de eventos celulares. El día anterior al experimento, seleccione una colonia individual de capataz mayor que se cultivó en una placa de agar sbarro e inocule. 10 mililitros de caldo sbarro. Deje que el cultivo crezca durante la noche a 37 grados centígrados, agitando a una velocidad de 250 RPM después de la eutanasia de ratones como se describe en el protocolo escrito.

Esterilizar todo el cuerpo con alcohol etílico al 70%. Retire ambos fémures y tibia y coloque los huesos en dúos estériles, medio de águila modificado o DMEM. A continuación, retire el exceso de tejido y músculo con toallitas delicadas hasta que los huesos estén completamente limpios.

Coloque solo los huesos intactos en una placa de Petri que contenga alcohol etílico al 70% e incube durante tres minutos para matar los microorganismos asociados. Retire los huesos y colóquelos en una placa de Petri con DMEM estéril. A continuación, corta con cuidado los extremos de los huesos.

Sostenga el hueso sobre un tubo cónico MT de 50 mililitros colocado sobre hielo y use una aguja de calibre 25 para enjuagar cuidadosamente 10 mililitros de DMEM frío a través de cada hueso. A continuación, centrifugar la suspensión celular recogida a temperatura ambiente durante 10 minutos a 650 veces G. Durante esta centrifugación, prepare y filtre los medios de alimentación de macrófagos de médula ósea como se describe en el protocolo de texto. A continuación, vuelva a suspender la paleta resultante con 10 mililitros de medio de alimentación.

Pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micrómetros para interrumpir los grupos celulares y eliminar los desechos grandes. A continuación, coloque un mililitro de la suspensión de la célula de deformación en 10 mililitros de medios de alimentación, placas de Petri especificadas para su uso en cultivos de tejidos. Permita que las células se adhieran a 37 grados centígrados con un 10% de dióxido de carbono durante siete días.

Cambiar los medios de alimentación como se describe en el protocolo de texto el día anterior al experimento. Separe los macrófagos de la placa retirando el medio de alimentación y agregue cinco mililitros de un reactivo de extracción celular suave a la placa después de la incubación de las células durante cinco a 10 minutos. A 37 grados centígrados, retire los macrófagos con un pipeteo suave.

Granular las células por centrifugación a 650 veces G durante 10 minutos antes de reutilizar, doblando el pellet en un mililitro de medio de alimentación. Usando una dilución de uno a 20, calcule la concentración de macrófagos pipeteando 10 microlitros de la suspensión celular en un hemocímetro usando un fondo de vidrio de 14 milímetros. Las placas de Petri colocan una concentración de uno por 10 a la quinta macrófaga directamente en el pocillo interior, que contiene un máximo de 200 microlitros.

Tenga cuidado de no exceder este volumen. Permita que las células se adhieran a la placa de Petri de vidrio colocando las placas en una incubadora a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, añada uno o dos mililitros de medio de alimentación suplementado con lipopolisacárido a un miligramo por mililitro e interferón gamma.

A 500 unidades por mililitro, deje que las células se incuben durante la noche el día del experimento. Extraer un mililitro de un cultivo de células G inoculado durante la noche y triturar las células de levadura mediante centrifugación durante cinco minutos de 420 veces G.To eliminar los medios y los productos criptocócicos extracelulares, lavar las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato o PBS seguido de una centrifugación como antes. Después de resus, suspender el pellet de células de levadura en un mililitro de PBS estéril y hacer una pipeta de dilución de uno a 100, 10 microlitros de la dilución en un hemocitómetro y contar las células.

Calcule la concentración de células de levadura necesarias para una multiplicidad de infección de una a cinco. Agregue el volumen calculado de suspensión de células criptocócicas a un mililitro de medio de alimentación con el anticuerpo monoclonal, 18 B siete a una concentración de 10 microgramos por mililitro. Incubar la suspensión celular a temperatura ambiente durante cinco minutos.

A continuación, retire los medios de alimentación de la placa de Petri de vidrio y lave los macrófagos una vez con PBS estéril. A continuación, añada 100 microlitros de opsonize cmin directamente al pocillo, seguido de la incubación con la levadura durante dos horas a 37 grados centígrados y con un 10% de dióxido de carbono. Después de la coincubación, se ha comprobado al microscopio que los macrófagos han internalizado c eFormas para ser consideradas células criptocócicas internalizadas deben verse claramente dentro de los confines del macrófago, como lo indica la gran punta de flecha.

La punta de flecha más pequeña indica un macrófago no infectado sin células fúngicas. Lave la placa de Petri tres veces con PBS estéril para eliminar todos y cada uno de los neoformanos c. A continuación, añada uno o dos mililitros de medio de alimentación sin el anticuerpo monoclonal para realizar estos experimentos.

Antes del experimento, se requiere un microscopio equipado con una cámara de incubación adjunta que incluya suministro de dióxido de carbono y una unidad de calentamiento. Precaliente la cámara de incubación durante al menos 30 minutos a 37 grados centígrados. Asegúrese de que la unidad de dióxido de carbono lea 5% al comienzo del experimento.

Coloque la placa de Petri con fondo de vidrio en la cubierta de la plataforma del microscopio con un dióxido de carbono encendido y cierre todas las puertas para asegurarse de que no se escape el calor usando el objetivo de 10x con el microscopio en contraste de fase, concéntrese en un campo claro de macrófagos infectados, configure el software del microscopio para tomar una imagen cada cuatro minutos durante un período de 24 horas. Después de 24 horas, el experimento habrá finalizado y se habrán recogido un total de 361 imágenes. Exporte estas imágenes como JPEG con una compresión del 5%.

Con el software image J, vea las imágenes como una pila visual a cinco fotogramas por segundo. El fotograma inicial de la película muestra muchos macrófagos en todo el campo, algunos que no están infectados y otros que tienen cantidades variables de células criptocócicas. A medida que avanza la película, las células son todas mo y se pueden ver moviéndose por el campo en esta película, está claro que las células criptocócicas están dentro de los confines de un macrófago infectado.

El macrófago se agita y se puede ver una célula de levadura, pero dentro de la zona FGA, las células criptocócicas se expurgan rápidamente en el entorno circundante. Un segundo macrófago infectado sufre exocitosis no lítica y se liberan más células de levadura en el espacio extracelular. Las células huésped permanecen viables después de la exocitosis criptocócica, como lo indica su capacidad para continuar moviéndose.

En ocasiones, los macrófagos interactúan de tal manera que facilitan la transferencia de células criptocócicas entre células huésped. Las células de levadura no se exponen al entorno extracelular y las células huésped siguen siendo viables. En esta película, dos macrófagos infectados crean puentes de célula a célula en dos ocasiones distintas para transportar células criptocócicas de un macrófago a otro.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la microscopía óptica digital para visualizar macrófagos que experimentan exocitosis no lítica y otras interacciones entre patógenos del huésped.