Name: Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende a registrar respuestas neuronales gustativas y secuenciar ARN en Aedes aegypti. Este método electrofisiológico identifica genes asociados a compuestos amargos y revela mecanismos de percepción del sabor en insectos.

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Los autores agradecen a Bryan T. Vinyard del USDA, Servicio de Investigación Agrícola, Henry A. Wallace Centro de Investigación Agrícola de Beltsville, Servicio de Consultoría Biométrica, Beltsville, MD por los análisis estadísticos. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención a J.C.D. del Programa de Investigación de Protección de Combatientes de Guerra Desplegados (DWFP) financiado por el Departamento de Defensa a través de la Junta de Manejo de Plagas de las Fuerzas Armadas (AFPMB).

1. Crianza Ae. adultos aegypti <ol><li> Los huevos eclosionan en aproximadamente ¾ de pulgada de agua en la bandeja poco profunda. El hacinamiento reducirá el tamaño de los adultos. </li><li> Larvas posterior a 25 ° C (12 hL: 12-HD) y alimentarlos con comida para peces suelo. NOTA: La sobrealimentación puede reducir las tasas de supervivencia. </li><li> Retire pupas individualmente por pipeta Pasteur diario y transferir a los platos de plástico (9 cm x 5,5 cm) dentro de pequeños cubos de contención con tapas de malla fina, estableciendo así 24 grupos de edad hr. </li><li> Alimentación mosquitos adultos 10% de solución de sacarosa por bola de algodón colocado en las paredes de pantalla de una carcasa de la jaula de los mosquitos en una cámara ambiental a 27 ° C y humedad relativa del 70% bajo el mismo fotoperiodo como larvas. </li><li> Para electrofisiología, utilice 5-10 días los animales viejos. En general, los animales más grandes producirán mejores resultados. Para el aislamiento de ARN, utilizar animales que están dentro de un mismo grupo de edad de 24 horas en el rango de edad 5-10 días. </li></ol><ol><li> Determinar una concentración adecuada de electrolito (por ejemplo, 1-10 mM) que provoca una mínima actividad de las neuronas sensoriales seleccionados. NaCl 10 mM o 1 mM KCl son electrolitos razonables para poner a prueba la actividad basal al comenzar un experimento. </li><li> Disolver cada producto químico experimental en un disolvente apropiado (si no el agua, utilizar etanol o DMSO) que tiene poco o ningún efecto sobre la actividad de pico en comparación con electrolito solo. Las concentraciones finales de etanol al 10% o 1% de DMSO son concentraciones de partida razonables. </li><li> Seleccionar apropiado (por ejemplo la quinina por amargo o sacarosa para dulces) productos químicos de control que están bien descritos disuasorias de la alimentación o estimulantes en los insectos. </li></ol> 3. Electrofisiología (grabación punta 8. La figura 1) <ol><li> Electrodos de vidrio Forma tirando mecánicamente capilares de vidrio. Optimizar calor y tire ajustes para tirar de vidrio para formar recordi forma apropiadaelectrodos NG. Romper con cuidado extremo del electrodo de vidrio usando pinzas bajo un microscopio de disección para crear electrodo de punta abertura que es lo suficientemente amplia como para envolver sensillum objetivo, pero lo suficientemente pequeño para evitar el contacto con las estructuras vecinas. </li><li> Bajo el microscopio, identificar visualmente por la morfología y la posición del objetivo sensilla / sensillum para asegurar la repetibilidad de grabación punta. Animales de preparación para permitir el libre acceso a sensilla de ángulo de entrada del electrodo. </li><li> Insectos anestesiar adultos fríos en el congelador a -20 ° C. Evitar daños a las neuronas periféricas por la sobreexposición a las bajas temperaturas. Cortar tiras angostas de cinta de celofán con hoja de afeitar en portaobjetos de vidrio. Inmovilizar todo insecto en un portaobjetos de vidrio utilizando tiras estrechas. </li><li> Insertar un alambre de tungsteno afilado químicamente en el tórax dorsal o el ojo para servir como el electrodo (tierra) indiferente. </li><li> Rellene electrodo de vidrio realizada en el paso 3.1 con una solución estimulante de interés. Usando una jeringa insertada, la tapa de llenadoIllary desde finales tirado al extremo romo. Flick a cabo todas las burbujas de aire, la celebración de fin derribado. Inserte un alambre de plata (cloruración opcional) en el electrodo de vidrio realizada en el paso 3.1 para servir como registro y electrodo de estimulación. </li><li> Conectar los electrodos a un preamplificador que está diseñado para grabaciones de contacto quimiorreceptora sensilla en los insectos. Este preamplificador (300 Hz-3 filtro de banda kHz) reducirá el tiempo de establecimiento para capturar la actividad neuronal tan cerca a los estímulos introducción posible. Recoger, almacenar y analizar las señales eléctricas utilizando un microordenador equipado con software de grabación de espiga. NOTA: Conexión a tierra del sistema de grabación correctamente puede mejorar drásticamente la relación señal-ruido. </li><li> Estimular sensilla con una solución de control (sólo electrolito) para asegurar la funcionalidad. Cuente picos a partir de 200 ms siguientes el artefacto de estímulo para todas las preparaciones. </li><li> Selección aleatoria de la orden de sustancias químicas de prueba para todos los experimentos, excepto los estudios de dosis-respuesta,para eliminar los prejuicios. Para los estudios de dosis-respuesta, exponer sensilla a concentraciones crecientes de la sustancia química experimental. Permita un mínimo de 3 minutos entre estímulos para asegurar una adecuada recuperación. NOTA: Este requisito puede variar dependiendo de los insectos y sensilla. Umbral se define como la concentración para la cual el error estándar no se superponga con el error estándar para la concentración más baja ensayada. </li></ol> 4. Aislamiento de ARN y secuenciación (Figura 2) <ol><li> Preparar las majas RNasa libre herméticamente cerradas al enfriarlos en hielo seco antes de tejido disruption.Prepare acompañan majas sin RNasa para aerosol que se ajusten a los tubos de tapa a presión con fuerza. Mantenga los tubos de recogida cerrados a menos que la disección de forma activa para evitar el exceso de condensación. </li><li> Utilizando aspirador filtrada, colocar 30 a 40 mosquitos en frío anestesiados (15 seg en congelador a -20ºC) en el escenario frío y ordenar por sexo. Coloque los animales dorsal lado de abajo, agarrando las alas para no dañar apéndices gustativas.</li><li> El uso de dos pares de pinzas finas, diseccionar labella emparejado o tarsos de los machos o hembras con un microscopio de disección y limitar la inclusión de los tejidos adyacentes. NOTA: 500 labella emparejado rinde aproximadamente 800-1,000 nanogramos de mRNA total. 400 tarsos individual (5 segmentos cada uno) producen 1,200-1,800 nanogramos de mRNA total. </li><li> Con un par de fórceps-jadeantes, ligeramente captar proboscis de mosquitos justo proximal a labella exponer estiletes interiores. Uso de otro par de collection-forceps, quitar y agregar labella tejido a lado del tubo de recogida de frío. </li><li> Con un par de fórceps, ligeramente captar la pierna mosquito en la salida de la tibia y el primer segmento tarsal. Uso de otro par de pinzas, retire tarsos y añadir tejido a lado del tubo de recogida de frío. NOTA: Tener en cuenta los tipos de células en la superficie del tejido deseado y no deseado. Si bien es importante para limitar la inclusión de los tejidos vecinos, es igualmente importante no omitir porciones de tejido deseado. El fimuestra final debe representar con precisión todo el órgano de interés. Crear un límite preciso con las pinzas de agarre de tal manera que el fórceps de recogida pueden liberar precisamente por raspado o agarrar sólo el tejido deseado. </li><li> Periódicamente, de girar el tubo de recogida brevemente en 0 ° C centrifugar a 9000 xg para mantener el tejido en la parte inferior del tubo. Si la humedad se acumula en tubos de recogida durante la disección, añadir 50uL de reactivo Trizol fría para cubrir el tejido recogido. </li><li> El uso de marcadores de laboratorio anti-manchas, identificándolas claramente uno-RNasa libre de 1,5 ml encajen tubo con tapa para cada tipo de tejido para su recogida. El uso de 1,5 ml Gradilla para tubos y nitrógeno líquido, por congelación luego moler tejido en polvo fino (finas piezas si en Trizol). Repetir una vez. Aumentar el volumen total de Trizol a 1 ml y resuspender tejido fundamental por agitación. </li><li> Añadir 200 ul de cloroformo y mezclar bien. Después de 5 min a temperatura ambiente, de girar en centrífuga a 4 ° C y 11.000 xg durante 15 min. Cuidadosamenteañadir capa acuosa directamente a una columna de filtro de ADN genómico. Centrifugar a 11.000 x g durante 5 min. Añadir un volumen igual de RNasa libre de 70% de etanol a fluir a través y mezclar pipeta. Traslado líquido a una columna colección ARN y continuar la extracción de RNA según las instrucciones proporcionadas. </li><li> Cuantificar y evaluar la pureza del ARN total en un espectrofotómetro precisión y proceder con cualquier método de secuenciación de ARN estándar. </li></ol> 5. RT-PCR cuantitativa Validación de RNA Sequencing (Figura 3) <ol><li> Seleccione tantos genes como posible comparar relativos niveles de expresión génica en un rango dinámico, tanto en abundancia predicho secuencia y función de los genes quimiosensorial presunta. </li><li> Pares de cebadores de diseño para cada gen diana para amplificar un 100 a 180 pares de bases producto de PCR específico. Excluir amplificación gDNA no específica asegurando al menos un cebador por juego abarca un límite de intrón. También puede utilizar el tratamiento DNasa para reducir la contaminación genómica. </li><li> Recogertejido de insectos como se describe en la sección anterior. Calcular la cantidad de tejido que se requiere para proporcionar suficiente ARN para completar todas las reacciones QRT-PCR. NOTA: triplicado Biológica y reacciones por triplicado técnicos proporcionarán máxima confianza en los resultados. </li><li> Calcula la cuantificación relativa de genes como objetivo X - (Ct [target] -Ct [referencia]) para cada gen diana y medio para cada replicar, tanto biológica como técnico. Utilice gen (s) de limpieza para normalizar los valores de Ct entre las réplicas biológicas y erradicar la escala del eje Y en las comparaciones de expresión relativa. </li><li> Evaluar la similitud de RNA-seq y conjuntos de datos qRT-PCR utilizando el, procedimiento de equivalencia de arranque basado en la regresión 9, iterativa aplicado, a los datos de cada tejido. NOTA: Este procedimiento identifica la &quot;región de similitud&quot; más pequeño que puede ser construido en torno a los datos de RNA-seq y QRT-PCR observado, y permitir la expresión génica relativa medido por QRT-PCR para ser considerado estadísticamente equivalente a la medición de la expresión génica relativa por RNA-seq. </li></ol>

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<li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+based+criterion+for+gene+expression+calls+using+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+Biosci%22%5BJournal%5D)">A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data.</a> Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).</li>
<li>Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+active+genes+in+deep+RNA-seq+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies.</a> BMC Genomics. 14 (778), (2013).</li>
<li>Isono, K., Morita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+designs+of+insect+taste+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cellu.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular designs of insect taste receptor system.</a> Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El aspecto más difícil de potenciales de acción de grabación de sensilla gustativa es decidir qué respuestas son &quot;normales&quot;. Cuando se emplea un solo punta sensillum gustativa grabar la primera vez que una especie de insectos dado, el número total y sensibilidades de las neuronas receptoras gustativas (GRNs) son probablemente desconocido. Muchas grabaciones preliminares primera obligados a decidir el alcance y las concentraciones de los productos químicos para probar. En este caso, empezamos con la observación...

Compuestos como DEET, Picaridin, citronelal y IR3535 se ha demostrado eficaz para repeler mosquitos, incluyendo las importantes vectores de enfermedades Aedes aegypti 1,2. Registramos los potenciales de acción de las neuronas sensoriales asociadas con sensilla gustativo específico para determinar las células involucradas con la repelencia de mosquitos. Junto con la secuenciación de aguas abajo de los genes expresados ​​en estos tejidos, podemos identificar los genes más probable que median las respuestas de estas células con el fin de cribar nuevos compuestos para la mejora de las capacidades de repelencia. RNA-seq es una herramienta poderosa, convirtiéndose rápidamente en estándar para el seguimiento de los cambios temporales y espaciales en la expresión génica. Análisis de RNA-seq de apéndices quimiosensoriales de insectos y los órganos se han utilizado para descubrir receptores moleculares en varias especies de insectos 3-5, mejorando en gran medida de gen convencional búsquedas basado en la PCR-6 por el gen. Los insectos representan la clase de animales más diverso, presenta muchas oportunidades para estudiar la relación entre los genes y fenotipos únicos. Tecnología de RNA-seq se puede emplear en cualquier tejido de insectos que viven. Asimismo, el registro electrofisiológico de las células sensoriales dentro de sensilla gustativa uniporous se puede lograr en muchas especies de insectos diferentes. El emparejamiento de estas dos técnicas permite a los investigadores Para limitar los genes que participan en conjunto un fenotipo observado quimiosensorial. Las diferentes especies presentarán desafíos específicos, pero pueden informar a la conexión entre los genes de los receptores quimiosensoriales y una adaptación quimiosensorial. El tamaño y la morfología de sensilla quimiosensorial es variable y pueden requerir extensa resolución de problemas durante la grabación de los potenciales de acción para reducir el ruido e identificar señales repetibles. Las disecciones de los órganos quimiosensoriales pueden ser triviales o delicada y requiere mucho tiempo, dependiendo de la morfología y el tamaño del insecto. La recuperación de ARN de alta calidad puede requerir alguna solución de problemas, así como evitar ciertos pigmentos durantela recogida de tejidos. Al tiempo que demuestran los efectos de los compuestos repelentes a través de ensayos de comportamiento es directa e informativo, este enfoque es intensiva en tiempo y amplia con respecto a mecanismo de acción. Electrofisiología junto con RNA-seq permite análisis más específicos de lo que impulsa a comportamientos de evitación en los insectos. Una vez que el &quot;kit de herramientas&quot; de la discriminación químico ha sido identificado en una especie de insecto, los intentos más específicas para mejorar en los repelentes conocidos son posibles. Los receptores y proteínas asociadas en las células sensoriales responsables de estos comportamientos pueden ser expresados ​​de forma heteróloga para la detección química directa. Además, el modelado molecular puede predecir que los productos químicos se provocar respuestas fuertes de estos receptores 7. La instantánea de todos los genes activos en un conjunto limitado de tejidos quimiosensoriales también puede ser útil en la identificación de genes similares en otras especies. Usando homología de secuencia y si la expresiónmilarities, los investigadores pueden formar conjuntos de receptores moleculares más probable que median las respuestas a los repelentes que son ampliamente eficaces en insectos. Presentamos el siguiente protocolo para ayudar a los investigadores en la deconstrucción de las vías chemosensory insectos y persuadir más que ahondar en la neuroetología de la no-modelo y los insectos de importancia económica.

<table><tbody><tr><td>Capilar de vidrio</td><td>A-M Systems</td><td>628000</td><td>Estándar, 1,5 mm X 0,86 mm, 4"</td></tr> <tr><td>Alambre de plata</td><td>A-M Systems</td><td>7875.015</td><td>" Alambre</td></tr> de <tr><td>tungsteno</td> desnudo <td>Alfa Products</td><td>369</td><td>0,127 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252</td><td>#5SF Etapa refrigerada de acero inoxidable</td></tr><tr><td></td><td>Productos BioQuip</td><td>1429</td><td>Enfriamiento Preamplificador de mesa</td></tr><tr><td></td><td>Syntech</td><td>Taste Probe</td><td>preamplificador</td></tr><tr><td>Software para electrofisiología</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td>software para electrofisiología</td></tr><tr><td>TetraMin alimento para peces</td><td>Tetra</td><td>Tropical alimento para peces granulado alimento</td> para <td>peces molido hasta polvo fino</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>reactivo de aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>RNeasy Plus El Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>incluye eliminador de ADNg y columnas de espín RNeasy</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Nanodrop</td><td>Productos Nano Drop</td><td>Espectrómetro de sobremesa</td><td>ND-1000</td></tr><tr><td>R statistics</td><td>freeware (creado por Robert Gentleman y Ross Ihaka)</td><td>www.r-project.org</td><td>Utilice la función lm del paquete stats y la función equiv.boot del paquete de equivalencia en el entorno informático R.</td></tr><tr><td>Gradilla para tubos de 1,5 ml</td><td>Evergreen</td><td>240-6388-030</td><td>Vierta nitrógeno líquido en unos pocos pocillos vacíos para congelar y triturar el tejido.</td></tr><tr><td>Tubos de recolección de 1,5 ml con mortero</td><td>Centrífuga sin</td><td>ARNasa</td>Grainger <td>6HAX6</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific 11178160</td><td></td><td>Gire el tejido congelado para mantenerlo en el fondo del tubo de 1,5 ml.</td></tr><tr><td>Primer-BLAST Primer Herramienta de diseño</td><td>NCBI</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

fisiológicos grabaciones y rna secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

El registro electrofisiológico de los potenciales de acción de las neuronas sensoriales de los mosquitos proporciona a los investigadores una visión de la percepción química de estos vectores de enfermedades. Recientemente hemos identificado una neurona sensible amarga en el labelo de la hembra de Aedes aegypti que responde al DEET y otros repelentes, así como a la quinina amarga, a través de una investigación electrofisiológica directa. Estas respuestas de las neuronas receptoras gustativas impulsaron nuestra secuenciación del ARNm total de muestras de labella y tarsos masculinos y femeninos para dilucidar los genes de quimiorrecepción putativos expresados en estos tejidos de quimiorrecepción de contacto. Las muestras de tarsos se dividieron en subtipos pro, meso y metatorácicos para ambos sexos. A continuación, validamos nuestro conjunto de datos mediante la realización de qRT-PCR en las mismas muestras de tejido y utilizamos métodos estadísticos para comparar los resultados entre los dos métodos. Los estudios que abordan la función molecular ahora pueden dirigirse a genes específicos para determinar aquellos involucrados en la percepción del repelente por parte de los mosquitos. Estas vías receptoras se pueden utilizar para detectar nuevos repelentes que interrumpan el comportamiento de búsqueda de huéspedes para frenar la propagación de virus dañinos.

Los registros de Trace de potenciales de acción de Ae. aegypti sensilla gustativa (Figura 1) demuestran la eficacia de la estimulación directa con una gama de productos químicos. Esta técnica se puede utilizar para cuantificar las respuestas a la estimulación de cualquier producto químico contando los picos de una amplitud y duración dada durante un intervalo de tiempo razonable (generalmente menos de 500 ms). Grabaciones de rastreo deben ser fácilmente reproducible bajo un conjunto dado de con...

El uso de dos métodos para estimar la expresión génica en las principales apéndices gustativas de Aedes aegypti, hemos identificado el conjunto de genes supuestamente subyacentes a las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivas, como se determina por examen electrofisiológico.

Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

El objetivo general de este procedimiento es observar las respuestas de las neuronas gustativas en insectos y medir la expresión génica en los tejidos gustativos. Esto se logra registrando primero las respuestas de pelos gustativos específicos a varios sabores a diferentes concentraciones. El segundo paso es diseccionar cuidadosamente los tejidos gustativos.A continuación, separe las muestras por sexo y apéndice. A continuación, aísle el ARN total de cada muestra de tejido y cree preparaciones de CD NA para la secuenciación de próxima generación y QPCR. El paso final es analizar los datos de expresión génica y formular hipótesis, como por ejemplo cómo los genes sensoriales chemos expresados median las respuestas fisiológicas a los sabores de los insectos.En última instancia, los registros electrofisiológicos se utilizan para mostrar el rango receptivo del sistema gustativo del insecto y la secuenciación de ARN del tejido gustativo se utiliza para resaltar los componentes genéticos más importantes de la recepción gustativa. Por lo general, las personas nuevas en estos métodos tendrán dificultades debido al pequeño tamaño de la quimioterapia de insectos. Apéndices sensoriales.Ya sea la disección o el registro de pequeños órganos de insectos, la práctica en pacientes es la clave para dominar estas técnicas. Para comenzar este procedimiento, extraiga un electrodo registrador de punta delgada en un extractor de pipeta con un capilar de vidrio debajo del microscopio de disección. Rompa con cuidado la punta del electrodo para que su abertura sea lo suficientemente ancha como para envolver el centro objetivo, pero lo suficientemente pequeña como para evitar el contacto con las estructuras vecinas.A continuación, anestesia de dos a cuatro insectos adultos en el congelador a menos 20 grados centígrados durante 20 segundos. Después de eso, inmovilice uno de los insectos con un cubreobjetos con pequeñas tiras de cinta de celofán. Bajo el microscopio.Identifique el sensor objetivo por su morfología y posición y oriente al animal para permitir el libre acceso a él desde el ángulo de entrada del electrodo. A continuación, inserte un alambre de tungsteno en su tórax dorsal. Para que sirva como electrodo de tierra, llene el electrodo de vidrio desde la punta con una solución estimulante de interés.Saca las burbujas de aire mientras sostienes la punta hacia abajo. Inserte un alambre plateado en el electrodo para que sirva como electrodo de registro y estimulación. Después de eso, conecte los electrodos a un preamplificador, lo que permite la reducción del tiempo de estabilización para capturar la actividad neuronal.El preamplificador está conectado a una computadora equipada con un software de grabación de picos para recopilar, almacenar y analizar señales eléctricas. Ahora estimule el centum con una solución de control para garantizar su funcionalidad. Cuente los picos a partir de 200 milisegundos después del artefacto de estímulo.Para obtener los resultados de la respuesta a la dosis. Exponga el centro a concentraciones crecientes de la sustancia química experimental y permita un mínimo de intervalos de tres minutos entre estimulaciones para asegurar una recuperación adecuada. En este procedimiento, prepare una hielera poco profunda con hielo seco.Para los tubos de recolección de tejido, etiquete los tubos de tapa a presión sin ARN de 1,5 mililitros para la recolección de diferentes tipos de tejido. Mantenga los tubos cerrados para evitar el exceso de condensación. A continuación, anestesia de 30 a 40 mosquitos en el congelador a menos 20 grados centígrados durante 15 a 30 segundos.A continuación, transfiera los mosquitos anestesiados a una etapa fría y clasifíquelos por sexo. Voltee los insectos con el lado dorsal hacia abajo agarrando sus alas, teniendo cuidado de no dañar los apéndices gustativos. Bajo un microscopio de disección, diseccione la etiqueta pareada Bella o los tarsos de machos o hembras agarrando suavemente el mosquito pro Bois justo proximal a la etiqueta.Bella con un par de pinzas para exponer el lápiz interior y quitar la etiqueta con el otro par de pinzas. A continuación, coloque el tejido en el tubo de recogida fría de tejido tarsiano. Agarre suavemente la pata del mosquito en la unión de la tibia y el primer segmento tarsiano y retire los tarsos.A continuación, coloque el pañuelo en el tubo etiquetado en frío. Haga girar los tubos de recolección durante un minuto en una centrífuga de cero grados centígrados a 9.000 veces la gravedad para mantener el tejido en el fondo del tubo. Si se acumula humedad en los tubos de recolección durante la disección, agregue 50 microlitros de reactivo de triol frío para cubrir y proteger el tejido recolectado.Congele los tubos en la rejilla de tubos de 1,5 mililitros que contiene nitrógeno líquido. Después de eso, prepare los morteros libres de ARN bien ajustados enfriándolos en hielo seco antes de la ruptura del tejido. Luego muele el pañuelo hasta convertirlo en polvo fino y repite una vez más.Lleve el volumen total de triol a un mililitro y resuel. Suspenda el tejido molido por vórtice. Después de eso, agregue 200 microlitros de cloroformo al tejido molido y mezcle bien.Después de cinco minutos a temperatura ambiente, gírelo en la centrífuga a cuatro grados centígrados a 11.000 veces la gravedad durante 15 minutos. Agregue con cuidado la capa acuosa directamente a una columna de filtro de ADN genómico. A continuación, gíralo a 11.000 veces la gravedad durante cinco minutos.Agregue un volumen igual de ARN libres al 70% de etanol al flujo y mezcle mediante pipeteo. Transfiera el líquido a una columna de recolección de ARN y continúe con la extracción de ARN. Después de eso, cuantifique y evalúe la pureza del ARN total en un espectrofotómetro de precisión y proceda con cualquier método estándar de secuenciación de ARN.Los registros de trazas de los potenciales de acción de la illa gustativa E GTI del asistente demuestran la eficacia de la estimulación directa con la gama de productos químicos. Esta técnica se puede utilizar para cuantificar las respuestas a cualquier sustancia química estimulante contando los picos de una amplitud y duración determinadas en un rango de tiempo razonable de menos de 500 milisegundos. Estos tres picos corresponden a tres subtipos de neuronas sensoriales con diferentes sensibilidades.Las réplicas biológicas para los conjuntos de datos de RNA-Seq pueden estar limitadas por el costo o la dificultad de la recolección de tejidos. Q-R-T-P-C-R ofrece la capacidad de validar pequeños subconjuntos de la expresión génica total a menor costo y requiere menos fuente. El ARN que se muestra en el panel izquierdo, uno al lado del otro, es una comparación entre la expresión relativa determinada por RN Aeq y la expresión relativa determinada por Q-R-T-P-C-R.Estos dos métodos se basan en diferentes químicas para la estimación de la abundancia de genes. Las funciones de equivalencia estadística que se muestran gráficamente en el panel derecho demuestran los límites de la certeza en cada caso. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar tejido de insectos para el aislamiento de ARN y registrar señales neuronales de los pelos gustativos de insectos vivos.

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