Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti
30 de diciembre de 2014
El uso de dos métodos para estimar la expresión génica en las principales apéndices gustativas de Aedes aegypti, hemos identificado el conjunto de genes supuestamente subyacentes a las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivas, como se determina por examen electrofisiológico.
El objetivo general de este procedimiento es observar las respuestas de las neuronas gustativas en insectos y medir la expresión génica en los tejidos gustativos. Esto se logra registrando primero las respuestas de pelos gustativos específicos a varios sabores a diferentes concentraciones. El segundo paso es diseccionar cuidadosamente los tejidos gustativos.
A continuación, separe las muestras por sexo y apéndice. A continuación, aísle el ARN total de cada muestra de tejido y cree preparaciones de CD NA para la secuenciación de próxima generación y QPCR. El paso final es analizar los datos de expresión génica y formular hipótesis, como por ejemplo cómo los genes sensoriales chemos expresados median las respuestas fisiológicas a los sabores de los insectos.
En última instancia, los registros electrofisiológicos se utilizan para mostrar el rango receptivo del sistema gustativo del insecto y la secuenciación de ARN del tejido gustativo se utiliza para resaltar los componentes genéticos más importantes de la recepción gustativa. Por lo general, las personas nuevas en estos métodos tendrán dificultades debido al pequeño tamaño de la quimioterapia de insectos. Apéndices sensoriales.
Ya sea la disección o el registro de pequeños órganos de insectos, la práctica en pacientes es la clave para dominar estas técnicas. Para comenzar este procedimiento, extraiga un electrodo registrador de punta delgada en un extractor de pipeta con un capilar de vidrio debajo del microscopio de disección. Rompa con cuidado la punta del electrodo para que su abertura sea lo suficientemente ancha como para envolver el centro objetivo, pero lo suficientemente pequeña como para evitar el contacto con las estructuras vecinas.
A continuación, anestesia de dos a cuatro insectos adultos en el congelador a menos 20 grados centígrados durante 20 segundos. Después de eso, inmovilice uno de los insectos con un cubreobjetos con pequeñas tiras de cinta de celofán. Bajo el microscopio.
Identifique el sensor objetivo por su morfología y posición y oriente al animal para permitir el libre acceso a él desde el ángulo de entrada del electrodo. A continuación, inserte un alambre de tungsteno en su tórax dorsal. Para que sirva como electrodo de tierra, llene el electrodo de vidrio desde la punta con una solución estimulante de interés.
Saca las burbujas de aire mientras sostienes la punta hacia abajo. Inserte un alambre plateado en el electrodo para que sirva como electrodo de registro y estimulación. Después de eso, conecte los electrodos a un preamplificador, lo que permite la reducción del tiempo de estabilización para capturar la actividad neuronal.
El preamplificador está conectado a una computadora equipada con un software de grabación de picos para recopilar, almacenar y analizar señales eléctricas. Ahora estimule el centum con una solución de control para garantizar su funcionalidad. Cuente los picos a partir de 200 milisegundos después del artefacto de estímulo.
Para obtener los resultados de la respuesta a la dosis. Exponga el centro a concentraciones crecientes de la sustancia química experimental y permita un mínimo de intervalos de tres minutos entre estimulaciones para asegurar una recuperación adecuada. En este procedimiento, prepare una hielera poco profunda con hielo seco.
Para los tubos de recolección de tejido, etiquete los tubos de tapa a presión sin ARN de 1,5 mililitros para la recolección de diferentes tipos de tejido. Mantenga los tubos cerrados para evitar el exceso de condensación. A continuación, anestesia de 30 a 40 mosquitos en el congelador a menos 20 grados centígrados durante 15 a 30 segundos.
A continuación, transfiera los mosquitos anestesiados a una etapa fría y clasifíquelos por sexo. Voltee los insectos con el lado dorsal hacia abajo agarrando sus alas, teniendo cuidado de no dañar los apéndices gustativos. Bajo un microscopio de disección, diseccione la etiqueta pareada Bella o los tarsos de machos o hembras agarrando suavemente el mosquito pro Bois justo proximal a la etiqueta.
Bella con un par de pinzas para exponer el lápiz interior y quitar la etiqueta con el otro par de pinzas. A continuación, coloque el tejido en el tubo de recogida fría de tejido tarsiano. Agarre suavemente la pata del mosquito en la unión de la tibia y el primer segmento tarsiano y retire los tarsos.
A continuación, coloque el pañuelo en el tubo etiquetado en frío. Haga girar los tubos de recolección durante un minuto en una centrífuga de cero grados centígrados a 9.000 veces la gravedad para mantener el tejido en el fondo del tubo. Si se acumula humedad en los tubos de recolección durante la disección, agregue 50 microlitros de reactivo de triol frío para cubrir y proteger el tejido recolectado.
Congele los tubos en la rejilla de tubos de 1,5 mililitros que contiene nitrógeno líquido. Después de eso, prepare los morteros libres de ARN bien ajustados enfriándolos en hielo seco antes de la ruptura del tejido. Luego muele el pañuelo hasta convertirlo en polvo fino y repite una vez más.
Lleve el volumen total de triol a un mililitro y resuel. Suspenda el tejido molido por vórtice. Después de eso, agregue 200 microlitros de cloroformo al tejido molido y mezcle bien.
Después de cinco minutos a temperatura ambiente, gírelo en la centrífuga a cuatro grados centígrados a 11.000 veces la gravedad durante 15 minutos. Agregue con cuidado la capa acuosa directamente a una columna de filtro de ADN genómico. A continuación, gíralo a 11.000 veces la gravedad durante cinco minutos.
Agregue un volumen igual de ARN libres al 70% de etanol al flujo y mezcle mediante pipeteo. Transfiera el líquido a una columna de recolección de ARN y continúe con la extracción de ARN. Después de eso, cuantifique y evalúe la pureza del ARN total en un espectrofotómetro de precisión y proceda con cualquier método estándar de secuenciación de ARN.
Los registros de trazas de los potenciales de acción de la illa gustativa E GTI del asistente demuestran la eficacia de la estimulación directa con la gama de productos químicos. Esta técnica se puede utilizar para cuantificar las respuestas a cualquier sustancia química estimulante contando los picos de una amplitud y duración determinadas en un rango de tiempo razonable de menos de 500 milisegundos. Estos tres picos corresponden a tres subtipos de neuronas sensoriales con diferentes sensibilidades.
Las réplicas biológicas para los conjuntos de datos de RNA-Seq pueden estar limitadas por el costo o la dificultad de la recolección de tejidos. Q-R-T-P-C-R ofrece la capacidad de validar pequeños subconjuntos de la expresión génica total a menor costo y requiere menos fuente. El ARN que se muestra en el panel izquierdo, uno al lado del otro, es una comparación entre la expresión relativa determinada por RN Aeq y la expresión relativa determinada por Q-R-T-P-C-R.
Estos dos métodos se basan en diferentes químicas para la estimación de la abundancia de genes. Las funciones de equivalencia estadística que se muestran gráficamente en el panel derecho demuestran los límites de la certeza en cada caso. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar tejido de insectos para el aislamiento de ARN y registrar señales neuronales de los pelos gustativos de insectos vivos.
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Descripción general
Este estudio investiga las respuestas de las neuronas gustativas en Aedes aegypti frente a diversos sabores y mide la expresión génica en tejidos gustativos. Mediante el uso de técnicas electrofisiológicas, la investigación identifica genes asociados con las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Entomología
- Expresión génica
Antecedentes
- El sistema gustativo en los insectos desempeña un papel crucial en la percepción del sabor.
- Aedes aegypti sirve como organismo modelo para estudiar las respuestas sensoriales.
- Comprender la expresión génica puede revelar los mecanismos de la percepción del sabor.
- Los métodos electrofisiológicos son esenciales para medir la actividad neuronal.
Objetivo del estudio
- Observar las respuestas de las neuronas gustativas a diferentes compuestos del sabor.
- Medir la expresión génica en tejidos gustativos de Aedes aegypti.
- Formular hipótesis sobre cómo los genes quimiosensoriales influyen en las respuestas fisiológicas a los sabores.
Métodos Utilizados
- Registrar las respuestas de los pelos gustativos a diversos sabores en diferentes concentraciones.
- Disecar los tejidos gustativos y separar las muestras por sexo y apéndice.
- Aislar ARN total de cada muestra de tejido.
- Elaborar preparaciones de ADNc para secuenciación de nueva generación y QPCR.
Resultados principales
- Identificación de genes relacionados con las respuestas neuronales a compuestos amargos.
- Información sobre la base genética de la percepción del sabor en Aedes aegypti.
- El análisis de datos respalda hipótesis sobre las funciones de los genes quimiosensoriales.
- Los resultados electrofisiológicos se correlacionan con los hallazgos de expresión génica.
Conclusiones
- El estudio mejora la comprensión de la función de las neuronas gustativas en los insectos.
- Los hallazgos contribuyen al conocimiento más amplio de la biología sensorial.
- La investigación futura podría explorar aplicaciones en estrategias de control de plagas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la base molecular de la percepción quimiosensorial en vectores de enfermedades como Aedes aegypti permite la validación de dianas para el desarrollo de nuevos repelentes. El perfilado electrofisiológico y transcriptómico de los tejidos gustativos proporciona una reducción mecanicista de riesgos al vincular la expresión génica con resultados conductuales, como la interrupción de la búsqueda de huéspedes. Este enfoque integrado respalda la confianza predictiva en el cribado de compuestos que interfieren con las vías sensoriales del mosquito, orientando estrategias tempranas de control de vectores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Identifica neuronas receptoras gustativas que responden al DEET y a la quinina, lo que permite investigar las vías de detección del sabor amargo en vectores de enfermedades.
- Valor operativo: Proporciona una lectura fisiológica validada para la selección de compuestos que modulan las neuronas quimiosensoriales del mosquito.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: La secuenciación de ARN de tejidos labelares y tarsos revela perfiles de expresión génica relacionados con la quimiorrecepción, lo que apoya el desarrollo de ensayos alineados con biomarcadores.
- Valor operativo: La validación mediante qRT-PCR garantiza la reproducibilidad y la precisión cuantitativa para comparaciones de expresión génica entre plataformas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la expresión de genes quimiosensoriales con la percepción de repelentes, permitiendo la selección basada en objetivos para la interrupción del comportamiento de búsqueda de hospedador.
- Valor operativo: El muestreo específico por tejido (tarsos protorácicos, mesotorácicos y metatorácicos) respalda modelos de cribado escalables y estratificados por sexo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método conecta el descubrimiento temprano de dianas mediante cribado fenotípico con la validación preclínica, vinculando la actividad neuronal con dianas moleculares en tejidos quimiosensoriales.
- Biología del Descubrimiento: Los registros electrofisiológicos permiten probar hipótesis sobre los efectos de compuestos en las tasas de disparo y la sensibilidad de las neuronas gustativas.
- Selección: Los resultados de RNA-seq y qRT-PCR proporcionan lecturas cuantitativas normalizadas de la expresión génica para evaluar la interacción con el blanco.
- Análisis: El conteo de potenciales de acción y las pruebas estadísticas de equivalencia permiten comparar las respuestas neuronales y la expresión génica entre diferentes condiciones y métodos.
- Investigación Traducional: La validación de genes quimiosensoriales apoya el alineamiento de biomarcadores para predecir la eficacia repelente in vivo.
- Reutilización Empresarial: El flujo de trabajo combinado de electrofisiología y transcriptómica es reutilizable en distintas especies de insectos y bibliotecas químicas para reducir riesgos en blancos de control vectorial.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reducción mecanicista de riesgos en dianas repelentes mediante la correlación directa entre actividad neuronal y expresión génica.
- Valor operativo: Protocolos estandarizados de disección de tejidos, aislamiento de ARN y electrofisiología garantizan la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones tempranas de avance o descarte de candidatos repelentes mediante la validación del compromiso de la diana en tejidos quimiosensoriales relevantes.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos que modulan vías específicas de receptores del gusto asociadas al comportamiento de búsqueda del huésped.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en electrofisiología de insectos y disección de tejidos bajo microscopía para obtener grabaciones confiables de pelos gustativos.
- Es necesario tener acceso a equipos libres de RNAsa, centrífugas y espectrofotometría para lograr un aislamiento de ARN de alta calidad a partir de muestras pequeñas de tejido.
- La estandarización entre equipos requiere una determinación sexual del tejido, separación de apéndices y manejo en cadena fría consistentes para prevenir la degradación del ARN.
- La adaptación a otras especies de mosquitos o tejidos puede requerir la optimización de la colocación de electrodos y de las técnicas de disección debido a la variación morfológica.
- Los límites en réplicas biológicas en ARN-seq debido a la escasez de tejido pueden mitigarse mediante la validación por qRT-PCR de dianas clave, como se demostró en el estudio.
