Aislar Potenciada Hsp104 Variantes Usando levadura Modelos proteinopatía

El objetivo del siguiente experimento es examinar las bibliotecas de HS P 1 0 4 para la selección de variantes que supriman la toxicidad de las proteínas asociadas con los trastornos de mal plegamiento de proteínas. Esto se logra mediante la cotransformación de bibliotecas de variantes de HSP 1 0 4 con un sustrato asociado a la enfermedad en levadura y coex que expresa las dos proteínas como segundo paso. Las levaduras seleccionadas se tratan con cinco ácidos fluoruticos o cinco FOA para contraseleccionar el plásmido HSP 1 0 4.

A continuación, se secuencian los aciertos amplificando la región mutágena mediante PCR de colonias o identificando las mutaciones en el gen HSP 1 0 4. En última instancia, se puede evaluar la supresión de la toxicidad del sustrato asociado a la enfermedad para identificar las variantes de HS P 1 0 4 que son más prometedoras para una caracterización posterior. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las selecciones basadas en unión, es que esta técnica permite la selección de variantes que suprimen la toxicidad del sustrato asociado a la enfermedad.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del plegamiento de proteínas mediante la identificación de las proteínas que pueden revertir el mal plegamiento de proteínas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la potenciación de HS P 1 0 4, también se puede aplicar a las bibliotecas de cribado de cualquier proteína para la supresión de la toxicidad de cualquier sustrato que sea tóxico en la levadura. Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades porque es posible que muchas colonias deban ser examinadas para encontrar resultados válidos. Para detectar la supresión de la toxicidad de la protea, comience lavando las colonias HSP 1 0 4 de las placas con medios de caída suplementados con rafinosa, una pipeta serológica y madera estéril y los aplicadores transfieren los lavados líquidos a un tubo cónico de 50 mililitros y vórtices las colonias a fondo para separar los grupos de células.

A continuación, diluya la suspensión celular hasta obtener un cultivo ligeramente turbio y cultive las células durante la noche en medios de caída de rafinosa agitando a 30 grados centígrados. Aumente los controles de tipo salvaje y vectorial HSP 1 0 4 en paralelo en este momento también. A la mañana siguiente, un rango de concentraciones celulares en placas individuales de galactosa para generar al menos una placa por grupo con colonias individuales.

Normalice el vector y los cultivos de tipo mundial HSP 1 0 4 al OD 600 de la biblioteca y la placa. Volúmenes iguales de estas células a las concentraciones de cepa experimental para comparar el crecimiento de la biblioteca en relación con los controles para evaluar la selección. La rigurosidad también coloca la placa en la biblioteca en medios represores de glucosa y luego incuba todas las placas durante dos o tres días a 30 grados Celsius hasta que las colonias parezcan usar cinco FOA para la selección de las células, que ya no mantienen plásmidos que expresan HSP 1 0 4 y luego rayan las colonias individuales de cada cepa por duplicado en placas de medios de abandono dobles y simples por incubación nocturna a 30 grados Celsius.

Estas placas se utilizarán para la secuenciación posterior para evitar que las placas se sequen. Envuelva las placas Euro de silbido SD en una película para e instálelas a cuatro grados centígrados mientras realiza la pantalla de cinco FOA. A continuación, raye las colonias de las placas de silbido SD a colonias individuales en cinco placas FOA para una incubación de uno a dos días a 30 grados centígrados hasta que aparezcan colonias individuales. Próximo.

De cada cinco placas de FOA, seleccione y raye. Tres colonias supervivientes en un SD Euro y una SD su placa por colonia superviviente después de otros uno o dos días de incubación a 30 grados centígrados. Las colonias que han perdido el plásmido HSP 1 0 4 crecerán en placas de silbido SD, pero no en placas SD Euro.

Cultive estas cepas hasta la saturación en medios de abandono de rafinosa en 96. Pozo profundo de placas de dos mililitros durante la noche a 30 grados centígrados con temblor. Luego, para eliminar cualquier falso positivo, realice un ensayo de manchado.

Cerca del final de la incubación se coloca una pipeta multicanal para alícuota de 200 microlitros de medio de caída de rafinosa por pocillo a una nueva placa de 96 pocillos, reservando las columnas uno y siete para los cultivos limpios. A continuación, alícuota 250 microlitros de cada uno de los 16 cultivos saturados en las columnas uno y siete de la placa y diluir en serie los cultivos cinco veces en cada columna de la placa, mezclando bien con la pipeta multicanal. Luego, para asegurar un manchado uniforme, retire 50 microlitros del cultivo diluido de las columnas seis y 12 para asegurarse de que el volumen final de cada pocillo sea de 200 microlitros.

A continuación, utilice una herramienta replicadora de 96 voltios para detectar los cultivos por duplicado en las placas SD de silbido y silbido de escalada. Después de una incubación de dos a tres días a 30 grados centígrados, seleccione las cepas de secuenciación que exhiben toxicidad en las placas de silbido de escalada. Similar a la de los controles, las cepas falsas positivas, que no son tan tóxicas como los controles, se pueden descartar.

También descarte las cepas que presenten un defecto de crecimiento en el sd. Sus placas o que exhiben una toxicidad sustancialmente mayor que el sustrato de la enfermedad por sí solo. Para secuenciar las variantes de HSP 1 0 4 por PCR de colonias, primero raspe aproximadamente 10 microlitros de levadura de las placas Euro de silbido SD en tres microlitros de hidróxido de sodio de 20 mili en tubos pelados por PCR para obtener las células por congelación.

Primero coloque las tiras en un congelador a menos 80 grados centígrados. Después de 10 minutos en el congelador, incubar los tubos a 99 grados centígrados en el termociclador durante 10 minutos, y luego diluir las cepas a 100 microlitros con agua de grado PCR usando una alta concentración de cebador. A continuación, ejecute un programa de PCR estándar en las muestras y, a continuación, analice las muestras mediante electroforesis de Agel para confirmar la amplificación de un producto de PCR del tamaño adecuado.

Por último, secuenciar los productos de PCR teniendo cuidado de analizar minuciosamente los cromatogramas de secuenciación para detectar mutaciones. Las mutaciones pueden observarse como una mezcla de dos nucleótidos en un sitio dado, ya que la levadura a menudo alberga múltiples plásmidos. En este experimento representativo, después de la construcción de una biblioteca de variantes de HSP 1 0 4 aleatorizadas en el dominio medio, la biblioteca se transformó en levadura que alberga un plásmido para la expresión de TDP 43 inducible por galactosa.

A continuación, se recuperaron los transformantes y se colocaron en placas de glucosa y galactosa para evaluar la rigurosidad de la criba. Después de cinco ensayos de detección de tratamiento con FOA de un subconjunto de las variantes seleccionadas en el cribado inicial. Indicó que de las cuatro colonias seleccionadas, dos mostraron supresión de toxicidad mediada por HSP 1 0 4, TDP 43.

Uno de ellos fue un falso positivo y el otro mostró una mayor toxicidad. Después de cinco tratamientos con FOA, los dos resultados verdaderos se secuenciaron mediante PCR de colonias para identificar las mutaciones del dominio medio. Estas mutaciones de HS P 1 0 4 se pueden producir en el plásmido parental HSP 1 0 4 mediante mutagénesis dirigida al sitio para confirmar su supresión de toxicidad Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para detectar hasta 200 resultados a la vez en los cinco FO, un paso en el transcurso de una a dos semanas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante analizar cuidadosamente los resultados de la secuenciación, ya que a menudo se obtienen mezclas de plásmidos siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de fluorescencia, para ayudar a responder preguntas adicionales como, ¿cómo afectan las variantes de HSP 1 0 4 a la agregación del sustrato asociado a la enfermedad? Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo examinar bibliotecas de variantes de HSP 1 0 4 para la selección de supresores de toxicidad.