1.13: Cultivo de explantes de tejido Neural

Los cultivos de explantes sirven como técnica para investigar el desarrollo de poblaciones celulares específicas y estructuras neuronales. En los experimentos de neurociencia del desarrollo, los explantes son tejidos neurales extirpados de un embrión para su desarrollo continuo in vitro. Estos cultivos dan a los investigadores la capacidad de manipular y visualizar los tejidos en desarrollo de formas que no son posibles in vivo. Este video presentará algunos principios importantes detrás del trabajo con tejidos explantados, procedimientos paso a paso para dos enfoques para el cultivo de explantes, así como aplicaciones de esta técnica.

Antes de profundizar en los métodos, repasemos algunos principios básicos. Los explantes se pueden establecer a partir de una serie de organismos modelo y una variedad de tipos de tejidos. Por lo general, los cultivos se crean mediante la extracción cuidadosa de tejido neural de un embrión, la disección de una región de interés y la colocación en un entorno artificial.

Los tejidos también se pueden seccionar en láminas delgadas y cultivar en "cultivo de rebanadas". Debido a que el entorno de cultivo está diseñado para imitar las condiciones in vivo de todo el órgano, esta estrategia de cultivo a menudo se denomina "organotípica".

Antes de comenzar, asegúrese de esterilizar sus instrumentos con etanol al 70%. A continuación, practica la eutanasia a una ratona embarazada utilizando el método preferido de tu laboratorio. Luego, extirpe quirúrgicamente el útero y colóquelo en un tampón helado. Transfiera la placa a un microscopio de disección y extraiga los embriones individuales de su saco vitelino. A continuación, aísle el cerebro, diseccione cuidadosamente su región de interés y transfiéralo a una placa de cultivo que contenga medio de cultivo. Los explantes se pueden mantener en un 37 ? C incubadora que contiene un 5% de CO2 durante unas semanas sustituyendo el 50% del medio cada 2 - 3 días.

El cultivo en cortes de tejido cerebral requiere algunos pasos adicionales. Antes de la sección, el tejido se incrusta en agarosa, que proporciona soporte al tejido para que permanezca intacto mientras se corta. Para ello, se calienta una solución de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% hasta que la agarosa se disuelve. A continuación, la agarosa se transfiere a moldes de inclusión y se deja enfriar ligeramente para evitar dañar el tejido.

A continuación, el tejido se puede sumergir con cuidado y dejar que la agarosa se endurezca. Los bloques resultantes se recortan y luego se pegan a una etapa de muestra y se seccionan con un vibrátomo, que es un instrumento que utiliza una cuchilla vibratoria para cortar rodajas finas de tejido vivo. A medida que se generan las rebanadas, se transfieren cuidadosamente a una placa recubierta que contiene medios de cultivo y se cultivan como se mencionó anteriormente.

El uso de cultivos de explantes en comparación con los cultivos in vivo y otros métodos in vitro tiene una serie de ventajas. En primer lugar, las células del tejido explantado son más accesibles a las herramientas experimentales. En segundo lugar, el hecho de que los explantes mantengan la compleja arquitectura celular del tejido neural en desarrollo significa que se pueden estudiar las interacciones célula-célula. En tercer lugar, dado que pueden controlar la composición química del medio de cultivo, los científicos pueden utilizar explantes para probar el efecto de compuestos específicos en el desarrollo de tejidos.

Sin embargo, dado que se está retirando de su entorno natural, se debe tener especial cuidado para mantener el tejido feliz y sano in vitro. Por ejemplo, la presencia de matriz extracelular, o MEC, tiene un impacto significativo en el comportamiento celular, por lo que las proteínas de MEC purificadas se utilizan a menudo para recubrir las placas de cultivo. Otra consideración importante es la solución en la que se bañan los explantes. Si bien a menudo se utilizan medios de cultivo celular tradicionales, algunos experimentos requieren soluciones que se asemejan mucho al líquido que circula en el sistema nervioso central: el líquido cefalorraquídeo, que es un reactivo crítico en experimentos como los que está a punto de ver.

Ahora que hemos repasado los métodos de cultivo de explantes, veamos cómo se utilizan estas técnicas.

Los ensayos de migración celular utilizan tejido explantado para examinar las señales repulsivas y atractivas que están involucradas en el movimiento de las células neuronales. En este experimento, las perlas que han sido previamente empapadas en factores de crecimiento se implantan en explantes del cerebro posterior para examinar la migración de las células neuronales. Después de 3 a 4 días de exposición, se obtuvieron imágenes de las neuronas con un microscopio confocal. Los resultados muestran que las neuronas motoras migran hacia las perlas empapadas en el factor de crecimiento endotelial vascular, pero no hacia las perlas de control empapadas en tampón.

Los ensayos de cocultivo se utilizan a menudo para investigar las interacciones célula-célula durante el desarrollo. En este ejemplo, se cultivaron segmentos de la médula espinal sobre una capa de células musculares para estudiar cómo se establecen las conexiones entre las neuronas motoras espinales y el músculo esquelético. Tan pronto como 2 días después de la incubación, se ven proyecciones de las neuronas, también conocidas como neuritas, que emergen del explante. A los 5 días, se observa una inervación funcional por la contracción de la capa de células musculares.

Durante el desarrollo del sistema nervioso, las neuronas deben alargar sus axones para establecer una conexión entre el tejido diana y el sistema nervioso central. Una forma de estudiar este complejo proceso es a través de ensayos de guía de axones. Los investigadores utilizan tejidos explantados para examinar los factores dentro de las neuronas y en el entorno circundante que ayudan a guiar el axón a su ubicación correcta.

Acabas de ver la guía de JoVE para el cultivo de explantes de tejido neural. Este video cubrió una descripción general de las ventajas de los cultivos de explantes, estrategias de cultivo, protocolos paso a paso de dos procedimientos de explantes comúnmente utilizados y formas en que estas técnicas se usan en el laboratorio hoy en día.

¡Gracias por mirar!