Name: A gran escala de purificación de porcino o bovino fotorreceptor Outer Segmentos para Fagocitosis ensayos sobre células pigmento retiniano epitelial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprende a purificar segmentos externos de fotorreceptores de retina porcina o bovina mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. Este método permite almacenar grandes stocks a -80°C para ensayos de fagocitosis en células epiteliales pigmentarias retinianas.

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Este trabajo fue apoyado por la Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs a EFN), Fondation Voir et Entendre y Fondation Bettencourt Schueller (Becas a Jóvenes Investigadores a EFN), Centro Nacional de la Recherche Scientifique (CNRS, puesto permanente para EFN) , y el Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud (R01-EY13295 a SCF). Además, el Instituto de la Visión es financiado por el Institut National de la Santé et de la Investigación Médica, Universidad Pierre et Marie Curie en París 6, Centro Nacional de la Investigación Científica y el departamento de París.

Este aislamiento experimento POS es mucho tiempo y puede requerir hasta 12 horas para completar si POS están etiquetados antes de su almacenamiento. El protocolo ha sido adaptado de un artículo publicado por RS Molday y sus colegas en 1987 31 y modificado por SC Finnemann y sus colegas en 1997 10. Los animales fueron manejados de acuerdo a la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research. Protocolos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Charles Darwin Pierre y Marie Curie de París-06 y el Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Fordham. 1. Configuración General <ol><li> Obtener 80 frescos de cerdo o vaca ojos tan frescos, tan pronto después de la matanza como sea posible y mantenerlos refrigerados en la oscuridad. Proporcionar instrucciones al proveedor para que la empresa procede de la misma manera. Este protocolo está optimizado para 80 ojos. Aproceder con más ojos y obtener las reservas más grandes (por ejemplo, desde 160 ojos), el doble de las cantidades de solución y realizar 2 rondas de ultracentrifugación; muestras de la piscina después en la etapa de recolección (ver paso 2.2.2). </li><li> Establecer en el banco de la lámpara de luz de seguridad roja, almohadillas absorbentes, trapos (tabla Materiales). Preparar 15 cm de platos y bolsas de bioseguridad para la recogida de residuos (las partes del ojo no utilizado, vítreos ...). Use bata ajustada, guantes, protectores de mangas y gafas. </li><li> Precauciones: <ol><li> Pre-enfriar todas las soluciones luego mantenerlos fríos durante todos los pasos. Mantener los ojos y los gradientes enfrió en hielo tanto como sea posible. </li><li> Mantener los ojos y tejidos derivados en la oscuridad tanto como sea posible hasta que la etapa de recogida después de la ultracentrifugación para evitar photobleaching de pigmentos visuales y la pérdida de la color naranja-rosa de la forma activa de los fotopigmentos. </li></ol></li></ol> 2. Protocolo de acciones <ol><li> Preparar soluciones y gradientes: <ol><li> Taurina deshielo stock completamente utilizando un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Preparar todas las soluciones de soluciones madre (Tabla 1, las soluciones madre) y mezclar bien la sacarosa con otros ingredientes usando un agitador magnético para cada solución. <ol><li> Preparar 15 ml de la solución de homogeneización a una concentración final de 20% de sacarosa, 20 mM Tris pH 7,2 de etilo, 2 mM MgCl2, 10 mM de glucosa y 5 mM de taurina. </li><li> Preparar la solución de sacarosa al 25% a una concentración final de 25% de sacarosa (usando 70% stock sacarosa), 20 mM de acetato de tris pH 7,2, 10 mM de glucosa y 5 mM de taurina. </li><li> Preparar la solución de sacarosa al 60% a una concentración final de 60% de sacarosa (usando polvo de sacarosa), 20 mM de Tris pH 7,2 etilo, glucosa 10 mM y 5 mM de taurina. </li><li> Preparar la solución de lavado 1 a una concentración final de 20 mM de acetato de tris pH 7,2 y 5 mM de taurina. </li><li> Prepare la solución de lavado 2a una concentración final de 10% de sacarosa, 20 mM de acetato de tris pH 7,2 y 5 mM de taurina. </li><li> Preparar la solución de lavado 3 a una concentración final de 10% de sacarosa, 20 mM de fosfato de sodio pH 7,2 taurina y 5 mM. </li></ol></li><li> Estabilizar el fabricante de gradiente en un agitador magnético e insertar una barra de agitación en la cámara más cercana a la salida donde se insertará la solución al 60%. Utilice una punta de pipeta P200 de corte colocado en la salida de la tubería para lograr velocidad de colada adecuada. </li><li> Reparto de degradados lineales delicadamente diluyendo y agitando la solución de sacarosa al 60% con el 25% uno usando 12 ml de cada solución (es decir, un total de 6 tubos de 80 ojos) en tubos de ultracentrífuga pre-enfriados. Agitar la solución gradualmente-diluyendo sacarosa 60% también. Estabilizar la velocidad del flujo de gradiente, vertiendo la solución de problemas y no demasiado rápido. NOTA: A fin de obtener un gradiente continuo, lineal, mantenga la abertura de la punta de la pipeta a la derecha en la superficie de la solución para toda la formatio gradienten. </li><li> Deje que los gradientes se sientan en hielo durante alrededor de 1 hora para la estabilización. Mantenga los gradientes de temperatura hasta cargado. No agite los tubos para evitar la interrupción de la pendiente. </li></ol></li><li> Colección de tejidos: <ol><li> Recoge los tejidos bajo la luz roja tenue. Tome un ojo en una mano y empuje la parte delantera con el borde de la hoja de afeitar mientras sostiene el ojo lejos (para evitar salpicaduras; Figura 1). Utilice la hoja de afeitar para cortar el globo ocular anterior en 2 mitades (córnea, además de al menos 5 mm en la esclerótica). Retire el objetivo y voltear la ojera adentro hacia afuera de modo que se hace sobre la punta de un dedo exponiendo así a la retina. </li><li> Uso de la hoja de afeitar en un ángulo, raspar suavemente la retina, desprendimiento fácil y que aparece como una capa de color rosado, fuera de la superficie tapetum y cortes en la cabeza del nervio óptico (Figura 1). Recoge todas las retinas en 2 x 50 ml tubos que contienen cada uno 15 ml de solución de homogeneización en hielo. </li><li> Homo Retinahomoge-: <ol><li> Agitar la suspensión vigorosamente a mano durante 2 min con el fin de interrumpir las diferentes capas de células, romper POS fuera el resto de la célula PR, fragmento de POS y homogeneizar la suspensión retina. </li><li> Filtro 3x a través de una doble capa de gasa limpia para eliminar fragmentos de tejido grandes y recoger el flujo a través de limpias tubos de 50 ml (Figura 1). La suspensión de la retina de ser bastante grueso, para maximizar el rendimiento, presione suavemente sobre la gasa para liberar los tejidos restantes fragmentados después de cada filtración. </li></ol></li></ol></li><li> Fotorreceptor exterior fragmento segmento (POS) Aislamiento: <ol><li> Coloque con cuidado la preparación retina crudo, alrededor de 6-7 ml por tubo, más de 6 x 30 ml tubos de ultracentrífuga conteniendo cada uno 24 ml de frío continuo fresca 25 - gradiente de sacarosa al 60% (Figura 1). Equilibre los tubos opuestas que sean procedentes para el rotor que se utilizará. Ultracentrífuga a 106.000 xg durante 50 min a 4 ° C. </li&gt; <li> Eliminar la mayor parte de la solución encima de la banda de color naranja-rosa en el tercio superior del gradiente por aspiración (Figura 2A). Recoger la banda de color naranja-rosa con una punta P1000 de corte en un vaso. Deseche el resto después de neutralizar el uso de cloro (residuos biológicos). </li><li> Diluir con ~ 4 - 5 volúmenes de helado Wash 1 solución. Separar en tantos tubos de 30 ml, según sea necesario. Centrifugar a 3000 xg durante 10 min a 4 ° C. Elimine con cuidado el sobrenadante. </li><li> Pellets de resuspender en 10 ml lavado 2 solución y centrifugado a 3000 xg durante 10 min como se detalló anteriormente. Bolitas Resuspender en 15 ml de lavado 3 y girar de nuevo a 3.000 g durante 10 min. Combinar suspensiones de varias bolitas para reducir el número de tubos necesarios antes de la centrifugación en Wash 2 y 3 Lave soluciones. </li></ol></li><li> POS alicuotear sin etiquetado: <ol><li> Resuspender POS en 10-20 ml de DMEM. Prediluya 10 l en 490 l DMEM (1:50) y el recuento alargado, así como POS giró en uncámara de recuento de células (Figura 2B). Calcular el rendimiento y la concentración en partículas POS por ml. NOTA: El rendimiento varía, dependiendo principalmente de la edad y cepa de cerdos / vacas y el tamaño de los ojos, por ejemplo, una buena preparación varía de 5 - 8 x 10 ojos 9 POS de 80 cerdos. </li><li> Decidir sobre el volumen de DMEM final (típicamente 10 a 20 ml) y se añade sacarosa para producir una concentración final de 2,5% de sacarosa. </li><li> Preparar alícuotas del tamaño deseado, por ejemplo, 5 x 10 7 POS por tubo para un volumen de resuspensión 2 ml para un experimento de 96 pocillos a 40 l / pocillo. Tirada 1 alícuota durante 5 min a 2300 xg a TA y evaluar el tamaño del pellet. Preparar alícuotas diferentes tamaños para diferentes volúmenes de aplicación como POS NO debe congelarse y descongelarse dos veces. </li><li> Congele alícuotas POS a -80 ° C hasta su uso posterior. NOTA: Las alícuotas son estables durante muchos meses. En nuestras manos, no marcado o etiquetado POS se puede almacenar durante al menos un año. </li></ol></li><li> Etiquetado POS y alícuotas: NOTA: normalmente utilizamos FITC para etiquetar POS para la cuantificación de ensayos de fagocitosis, pero otros colorantes se pueden usar también en función de las necesidades. <ol><li> Resuspender 1 10 mg vial FITC a una / ml de concentración 2,5 mg en 0,1 M tampón de carbonato de Na pH 9,5 mediante la mezcla de 2,6 ml 0,1 M de NaHCO3 pH 8,4 con 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (tabla 2, las soluciones de archivo). Girar durante 1 hora a RT mientras se protege de la luz y de centrifugado durante 5 min a velocidad máxima para sedimentar los sólidos FITC no resuspendidas. </li><li> Resuspender el precipitado POS en 10 ml de Wash 3 solución (o DMEM) y añadir 2 ml de solución de FITC durante 80 ojos. Guarde las sobras FITC congelado a -80 ° C. Rotar durante al menos 1,5 horas a RT. Proteger de la luz utilizando papel de aluminio. </li><li> Lave POS marcado dos veces utilizando Wash solución 3 como se describe en la sección 2.3.4, a continuación, una o dos veces en DMEM hasta que casi no FITC libre se ve en el sobrenadante fraction. Resuspender POS en DMEM y proceda como para POS sin etiqueta para contar y alícuotas (sección 2.4). </li></ol></li><li> Uso de POS en los experimentos: <ol><li> POS Descongelar a temperatura ambiente, y mantenerlos en la oscuridad tanto como sea posible si están etiquetados con fluorescencia. Haga girar durante 5 minutos a 2300 xg a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante. </li><li> Inmediatamente resuspender en volumen apropiado de solución de ensayo según lo dictado por el experimento. En caso de diferentes tiempos de desafío POS, POS tienda volvió a suspender a TA en la oscuridad entre los puntos de tiempo durante varias horas. </li></ol></li></ol>

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero contrapuesto.

Tres pasos o condiciones son cruciales para una purificación optimizada: la calidad de la fundición de gradiente y delicada manipulación de tubos de gradiente, manteniendo los tejidos refrigerada y en la oscuridad hasta la etapa de recogida, la fuerza de agitación de homogeneizados de la retina para obtener el aislamiento POS adecuada del resto de la PR célula. Si surge algún problema en ver a la banda naranja correctamente, son muy probablemente debido a una de las tres razones anteriores (véase también el segundo párr...

En la retina, la visión se activa por isomerización de moléculas fotosensibles llamadas opsinas, antes de ser transformada en una señal que puede ser transmitida entre las neuronas hasta las áreas visuales del cerebro. Estas moléculas están incrustados en las pilas de discos membranosos asemejan panqueques que constituyen las porciones de segmentos externos de las células fotorreceptoras (RP). Ser sometido a la exposición constante a la luz y por lo tanto los niveles considerables de estrés oxidativo, RP renovar continuamente sus segmentos externos para limitar el daño oxidativo potencial. Segmentos externos de los fotorreceptores están en estrecho contacto con microvellosidades apicales de las células vecinas del epitelio pigmentario de la retina (RPE). RPE células constituyen la parte exterior de la barrera hemato-retiniana y aseguran numerosas tareas que son cruciales para la salud y la función de los fotorreceptores 1, tales como apagar los rayos de luz a través de pigmentos de melanina, re-isomerización de la retina componente opsina fotoreactivo, proporcionando nutrientes y grecimiento factores, participando en disposición PR metabolito. Además, las células RPE eliminan pasaron POS y reciclan sus componentes, una ocupación diaria que está regulado por el ritmo circadiano en la retina de mamíferos 2,3. El aclaramiento de cobertizo POS es absolutamente necesario para la supervivencia de relaciones públicas. Cuando esté completamente abrogada, POS se acumulan escombros y RP degeneran causando una rápida 4,5 pérdida de visión. Si el perfil rítmico se pierde y se sustituye por una actividad constante, PR y RPE defectos se acumulan con la edad 6. Por lo tanto, es muy importante para caracterizar la regulación molecular de la fagocitosis RPE in vitro con el fin de entender fenotipos vinculados a su disfunción. Curiosamente, la maquinaria molecular en las células RPE es muy similar a la utilizada por los macrófagos para eliminar las células apoptóticas y ambos son dependientes de reconocimiento de fosfatidilserina expuesta sobre los desechos fagocítica 7-9. Sin embargo, las células RPE y macrófagos regular el pHagocytosis diferente, como macrófagos optan por la eliminación inmediata de las células apoptóticas en tiempo de encuentro, mientras que las células del EPR rítmicamente engullir POS sólo una vez al día a pesar de su permanente contacto con los segmentos externos. Esto sugiere mecanismos de regulación específicos que aún no se entienden completamente. Muchas de las moléculas implicadas en la maquinaria fagocítica RPE han sido identificados o validado gracias a la utilización de POS aislado y ensayos de fagocitosis de cultivo celular. El receptor de la integrina alphavbeta5 situado en la superficie celular apical RPE, en coordinación con su ligando MFG-E8, se une específicamente a POS 10-12, que luego se internaliza a través del receptor quinasa de tirosina MerTK 13-15. El receptor scavenger CD36 se ha demostrado que participar en la ingesta de POS e influir en su velocidad de 16,17, y puede servir como un sensor de fosfolípidos oxidados en la superficie POS 18. Internalización necesita la contratación de F-actina del citoesqueleto-culoociated proteínas tales como la anexina 2 19, miosina II 20 y la miosina VIIA 21,22. POS o nativa oxidada in vitro también se utilizan para entender el envejecimiento de fenotipos de células del EPR en vivo vinculados a la acumulación de mal digerido POS oxidado 23-28. La generación de células del EPR derivadas de células madre ha iniciado una nueva aplicación para el aislado POS que se utilizan para probar la funcionalidad de las células antes de que se trasplantan a animales o pacientes 29,30,27. En primer lugar se describe por Molday y sus colegas en 1987 31, el protocolo para el aislamiento de POS bovina combina una etapa de ultracentrifugación de los homogeneizados de la retina en gradientes de sacarosa continuas con la observación del aspecto de color naranja característico de fotopigmento retinal crudos (llevar 11- cis retinal). En los últimos 10 años, debido a las precauciones tomadas para minimizar el riesgo de la enfermedad de las vacas locas, el uso de ojos porcinos se ha convertido en increasingly prominente. El protocolo descrito aquí muestra cómo obtener grandes cantidades de POS de porcino o de los ojos de la especie bovina que se pueden alícuotas y se almacenan durante periodos prolongados de tiempo. Esto elimina la necesidad de preparar POS de los ojos de roedores, que requiere el uso de un gran número de animales por la preparación y ensayo de POS 32,33,21,22. Además, se dan detalles sobre el etiquetado POS antes de su almacenamiento utilizando moléculas fluorescentes, para cuantificar y visualizar POS de una manera simplificada y comparable para algunas aplicaciones en comparación con POS etiquetado después de que el ensayo de la fagocitosis de 32,10. Por lo tanto, estas grandes stocks permiten reproducibilidad y facilidad de uso en muchos tipos diferentes de experimentos.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Material/Equipo específico</td></tr><tr>Generador <td></td><td></td> de<td>gradiente de 2 cámaras</td><td>Máquina de degradado con cámaras de 30 ml</td></tr><tr><td>Tubo de</td><td></td><td></td> silicona de 3 mm <td>de diámetro Tubo para fundición en gradiente</td></tr><tr><td>Barra</td><td></td><td></td> de agitación magnética de tamaño pequeño <td>Montaje de la barra de agitación en la cámara del creador de degradado</td></tr><tr><td>Lámpara</td><td></td><td></td> de luz de seguridad roja <td>Lámpara inactínica para la disección en el oscuro</td></tr><tr><td>Tubos Ultra Clear 25 x 89 cm</td><td>Beckman</td><td></td><td>344058 Tubos de ultracentrifugación</td></tr><tr><td>PP Tubos Oak Ridge Nalgene</td><td></td><td>3119-0050 Tubos de</td><td>centrífuga de 30 ml</td></tr><tr><td>Optima LE-80K</td><td>Beckman Coulter</td><td>365668</td><td>Ultracentrífuga</td></tr><tr><td>SW 32Ti rotor oscilante Beckman</td><td>Coulter</td><td>369694</td><td>Rotor oscilante para ultracentrífuga</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP</td><td>Centrífuga 393124 Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor JA-25.50</td> Rotor <td>363058</td><td>Beckman Coulter</td><td>para centrífuga Avanti J-26 XP</td></tr><tr><td>FITC Isomer I</td><td>Life Technologies</td><td>F-1906</td><td>Colorante</td></tr><tr> fluorescente<td colspan="4">Otros Materiales/Equipos</td></tr><tr><td>Cámara de recuento (como Neubauer o Malassez)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubetas</td><td></td><td></td> de hielo oscuro con tapa<td></td></tr><tr><td>Básculas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético y pértiga</td><td></td><td></td><td></td>de sujeción</tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td>reestructurada</tr><tr><td>37 &deg; C baño</td><td></td><td></td><td></td> de</tr> <tr><td>agua-80 &deg; C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumibles</td></tr><tr><td>Bata</td><td></td><td></td><td>de laboratorio Salud y seguridad</td></tr><tr><td>Guantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protectores de mangas Gafas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> absorbentes <tr><td>Bolsas y contenedores de basura de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>riesgo biológicoCuchillas <td></td><td>Weck-Prep</td><td>Disección</td><td>Hojas de afeitar de 60 mm/2,25 pulgadas de ancho Plato</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de plástico de 15 cm</td></tr><tr>Hojas <td></td><td></td><td></td>de<td>gasa estériles</td></tr><tr><td>Tubos de 15 y 50 ml Consumibles</td><td></td><td></td><td>comunes</td></tr><tr><td>Microtubos</td> Papel <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de aluminio</td></tr></tbody></table>

a gran escala de purificación de porcino o bovino fotorreceptor outer segmentos para fagocitosis ensayos sobre células pigmento retiniano epitelial

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Análisis de una de las funciones vitales de las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), la fagocitosis de gastados fragmentos distales de edad de los segmentos externos de los fotorreceptores (POS) se puede realizar in vitro. Fotorreceptoras segmentos externos con pilas de discos membranosas que contienen la maquinaria fototransducción se renuevan de forma continua en la retina. POS gastados se eliminan diariamente por células del RPE. Roedor, porcino / bovino y células del RPE humanos reconocen POS de diversas especies de una manera similar. Para facilitar la realización de grandes series de experimentos con poca variabilidad, con un amplio stock de POS puede aislarse de ojos porcinos y se almacena congelado en alícuotas. Este protocolo se aprovecha de la característica de fotopigmentos que muestran un color anaranjado cuando se mantienen en la oscuridad. Bajo una luz roja tenue, retinas se recogen en un buffer de ojeras abiertas cortadas en mitades. La suspensión de células de la retina se homogeneiza, se filtró y se cargó en un gradiente de sacarosa continuo. Después centrifugation, POS se encuentran en una banda discreta en la parte superior del gradiente que tiene un color naranja característico. POS se recogen, hilar, volvieron a suspender de forma secuencial en tampones de lavado, se contaron y se dividen en partes alícuotas. POS obtenidos de esta manera se pueden utilizar para ensayos de fagocitosis y análisis de activación de la proteína, la localización o la interacción en diversos momentos después de la exposición POS. Alternativamente, POS puede marcarse con fluoróforos, e. G., FITC, antes de alícuotas para la posterior cuantificación de fluorescencia de POS de unión o inmersión. Otras posibles aplicaciones incluyen el uso de desafío POS POS modificado o combinado con condiciones de estrés para estudiar el efecto del estrés oxidativo o envejecimiento en las células RPE.

La combinación del gradiente de sacarosa lineal y la ultracentrifugación permite la separación de los diferentes componentes de la suspensión de la retina por la densidad. Células de escombros y RPE más grande de la retina pesados ​​se hunden en o cerca de la parte inferior del gradiente (Figura 2A). Encendedor POS y las células individuales más ligeros o restos de células de la retina migran como bandas separadas para llegar a la media parte superior del gradiente por el final del período de centrifuga...

Este artículo describe el protocolo para la purificación de fragmentos de segmento externo (POS) de fotorreceptores mediante ultracentrifugación de retinas porcinas/bovinas utilizando homogeneización y centrifugación en gradiente de sacarosa. Este protocolo permite la preparación de grandes existencias de alícuotas de TPV, etiquetadas o sin etiquetar, que luego pueden almacenarse a -80 °C.

A gran escala de purificación de porcino o bovino fotorreceptor Outer Segmentos para Fagocitosis ensayos sobre células pigmento retiniano epitelial

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

El objetivo general de este procedimiento es generar existencias a gran escala de segmentos externos de fotorreceptores, purificados a partir de signos de guerra u ojos bovinos. Estudiar una de las funciones más importantes del pigmento de la retina, las células epiteliales, su actividad rítmica diaria del ácido OC. Esto se logra mediante la primera fundición de 25 a 60% de sacarosa, gradientes en tubos de ultracentrífuga.A continuación, se diseccionan los ojos porcinos o bovinos y se recogen y homogeneizan los Rey. A continuación, los re se filtran y se cargan en el gradiente de sacarosa y se centrifugan para separar los segmentos exteriores del fotorreceptor. Por último, la banda naranja que contiene los segmentos exteriores de los fotorreceptores se recoge en forma alícuota en almacenado tal cual, o se etiqueta antes de Ali, cotizando y almacenando.En última instancia, el escaneo fluorescente automatizado, la microscopía fluorescente o la inmunotransferencia se utilizan para estudiar la actividad fagocítica de líneas celulares, células diferenciadas derivadas de células madre o cultivos primarios en diversas condiciones. La principal ventaja de esta técnica sobre el aislamiento de segmentos automáticos de la masa o de los ojos para cada experimento es que el mismo conjunto de material se puede utilizar para varios experimentos, lo que permite un mayor grado de reproducibilidad. La demostración visual de este método es práctica, ya que un paso crítico radica en la fundición de iones, ya que condiciona el rango de segmentos externos aislados.La demostración del procedimiento estará a cargo de Celia Parino, una estudiante de posgrado, y contenta con un técnico de mi laboratorio Después de obtener 80 ojos frescos de cerdo o vaca de acuerdo con el protocolo de texto, manténgalos en la oscuridad y enfriados en hielo tanto como sea posible. Para evitar el fotoblanqueo de los pigmentos visuales y la pérdida del color rosa anaranjado instalado en el banco, las almohadillas y toallitas absorbentes de la lámpara de luz roja segura. Prepare un plato de 15 centímetros, bolsas de riesgo biológico para la recolección de desechos y hojas de afeitar.Una vez que se hayan preparado todas las soluciones, de acuerdo con el protocolo de texto, enfríelas previamente y manténgalas frías durante todos los pasos. Fije el generador de degradado en una placa de agitación magnética e inserte la barra de agitación en la cámara más cercana a la salida donde se verterá la solución al 60%. Utilice una punta de pipeta P 200 de corte colocada a la salida del tubo para lograr la velocidad de lanzamiento adecuada con 12 mililitros de cada solución de sacarosa al 25% y al 60%.Y mientras agita la solución al 60%, lance un gradiente lineal de sacarosa en un tubo de centrífuga preenfriado, manteniendo la abertura de la punta de la pipeta en la superficie de la solución de gradiente en continuo aumento. Para llevar a cabo la recolección de tejidos, use una bata de laboratorio ajustada, guantes, protectores de mangas y gafas protectoras bajo una luz roja tenue mientras sostiene un ojo en una mano con la superficie de corte hacia afuera, use el borde de una hoja de afeitar para perforar la parte frontal del ojo. A continuación, utilice la hoja de afeitar para cortar el globo ocular anterior en dos mitades.Retire la lente y voltee el ocular al revés para que pueda sostenerlo sobre la punta de un dedo. Por lo tanto, exponiendo la retina con la hoja de afeitar en ángulo, raspe suavemente la retina, que se desprenderá fácilmente y aparecerá como una capa rosada de la superficie del teto y cortará en la cabeza del nervio óptico. Transfiera las retinas a uno de los dos tubos de 50 mililitros que contienen 15 mililitros de solución de homogeneización en hielo.Después de recoger todas las retinas, agite la suspensión vigorosamente con la mano durante dos minutos. Con el fin de alterar las diferentes capas celulares, romper los segmentos externos de los fotorreceptores o POS del resto de los fotorreceptores, fragmentar el POS y homogeneizar la suspensión de la retina. Para eliminar fragmentos grandes de tejido, use la doble capa de gasa limpia para filtrar la suspensión tres veces en un tubo de 50 mililitros.Presione suavemente la gasa para liberar los tejidos fragmentados restantes. Después de cada filtración, coloque suavemente la preparación cruda de retina sobre seis a 24 mililitros, con gradientes de sacarosa del 25 al 60%. Después de equilibrar los tubos, Ultra centrífuga a 106, 000 Gs durante 50 minutos a cuatro grados centígrados.Cuando se complete el giro, aspire la mayor parte de la solución por encima de la banda rosa anaranjada en el tercio superior del gradiente. Luego, con una punta P 1000, recoja la banda rosa anaranjada en un vaso de precipitados. Use aproximadamente cuatro a cinco volúmenes de lavado, uno para diluir la solución y alícuota en tubos de 30 mililitros según sea necesario.Centrifugar a 3000 GS durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y desechar cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, con dos reus de lavado de solución, suspender los pellets antes de volver a girar. Use la solución de lavado tres para lavar los gránulos.Una tercera vez. Para alícuota el POS. Use de 10 a 20 mililitros de DMM para resuspender las células.A continuación, utilice 490 microlitros de DMM para diluir 10 microlitros de células y vuelva a calcular el rendimiento y la concentración en partículas de POS por mililitro. Decida un volumen final de DMM y agregue sacarosa hasta una concentración final de 2.5%Prepare las alícuotas deseadas. Gire una sola alícuota a 2, 300 GS durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente.Evalúe el tamaño de los gránulos y prepare varios volúmenes de alícuotas para evitar la congelación y descongelación más de una vez. Para etiquetar las celdas antes de la vatia de Eloqua. Use un tampón de carbonato de sodio de 0,1 molar para resuspender un vial de 10 miligramos de ZI a una concentración de 2,5 miligramos por mililitro.Gire durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad y gire a velocidad máxima durante cinco minutos para granular los sólidos ZI restantes. Con 10 mililitros de solución de lavado tres o dmm, vuelva a suspender el pellet de POS y agregue dos mililitros de la solución Fite para 80 ojos. Use papel de aluminio para protegerse de la luz y gire durante al menos 1,5 horas.A temperatura ambiente. Use la solución de lavado tres para lavar las células dos veces, como se describió anteriormente en el video, y luego DM EM una o dos veces hasta que casi no se vea fite libre en el sobrenadante. Use DM EM para volver a suspender POS y contar un cuanta similar a POS sin etiquetar como se ve aquí.Al mantener los ojos y las muestras en la oscuridad hasta después del paso de centrifugación, la prohibición de gradiente de sacarosa que contiene POS se puede reconocer inmediatamente por su color naranja brillante. Y si están dañados, aparecerán como piezas mucho más pequeñas, un poco como un fondo polvoriento. Por lo general, cuando se aísla correctamente, el POS debe aparecer alargado, recto o doblado.Cuando se observan bajo un microscopio, dependiendo del plano de enfoque del microscopio, pueden parecer oscuros o brillantes. Si no se resuspenden correctamente, permanecerán en grupos. Los POS aislados sirven para probar directamente la capacidad fagocítica de las células RPE mutantes.En este ejemplo, las células POS son fácilmente fagocitadas por las células primarias de EPR de ratones de tipo salvaje, mientras que las células de los ratones beta cinco integrina y MFG ocho knockout tito menos POS en la misma cantidad de tiempo. La cuantificación de la fagocitosis de POS se puede realizar mediante el recuento manual de POS marcados con FSE en imágenes de microscopio, midiendo la intensidad de fluorescencia o mediante citometría de flujo después de la tripsina celular. En esta figura se analiza el reclutamiento de proteínas mediante inmunofluorescencia, ensayos de colocalización, y el reclutamiento o activación de proteínas se puede validar en bloques inmunológicos después de la inmunoprecipitación, o mediante la comprobación de la fosforilación después de su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fagocitosis mediada por fosato exploraran y caracterizaran la maquinaria molecular en las células de pétalos de pigmento de la retina y compararan los hallazgos con otras células fagocíticas como los macrófagos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video describimos una técnica para aislar el iris y las células epiteliales del pigmento de la retina de ojos porcinos para obtener sus cultivos primarios para estudios in vivo y ex vivo. Estas células pigmentarias podrían modificarse genéticamente para estudiar enfoques regenerativos para tratar los trastornos oculares.

Aislamiento de células IPE y EPR: una técnica para obtener células epiteliales pigmentadas a partir de ojo porcino aislado

Este video muestra el procedimiento para aislar las células epiteliales pigmentarias de la retina, o EPR, y las células epiteliales pigmentarias del iris, o IPE, de ojos bovinos cosechados. Las células aisladas se pueden cultivar para estudiar su papel en el tratamiento de enfermedades oculares.

Aislamiento de células EPR e IPE del ojo bovino: un procedimiento para cosechar y cultivar células epiteliales de pigmento primario bovino

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y transfectar el iris primario y las células epiteliales pigmentarias de la retina de varios mamíferos (ratones, ratas, conejos, cerdos y bovinos). El método es ideal para estudiar los enfoques de terapia génica ocular en varias instalaciones para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos.

Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral

Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 20161,describe un método para aislar eficientemente y cultivo de células RPE del ratón, que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El procedimiento dura aproximadamente 3 horas.

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Este protocolo presenta dos técnicas para aislar los compartimentos subcelulares de los fotorreceptores de bastón murino para el análisis de proteínas. El primer método utiliza retina viva y papel de filtro de celulosa para separar los segmentos externos de la varilla, mientras que el segundo emplea retinas liofilizadas y cinta adhesiva para pelar las capas internas y externas de la varilla.

Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas

Este manuscrito describe un protocolo simplificado para el aislamiento de las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) de los ojos de ratón de una manera gradual. El protocolo incluye la enucleación y disección de los ojos del ratón, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de células del EPR.

Aislamiento de células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón

Aquí, se presenta un método fácil de seguir para cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina in vitro .

Cultivo primario de células epiteliales pigmentarias de la retina porcina

Describimos un método simple y eficiente para aislar células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes. Este procedimiento permite realizar estudios de biología molecular de seguimiento en el EPR aislado, incluidos los análisis de expresión génica.

Aislamiento de células epiteliales pigmentarias de la retina de ojos de conejillo de indias

Este protocolo describe un modelo de acumulación de lipofuscina en cultivos epiteliales pigmentarios (EPR) humanos altamente diferenciados y polarizados y un ensayo de fagocitosis de segmento externo (SG) mejorado para detectar la capacidad total de consumo/degradación de SG del EPR. Estos métodos superan las limitaciones de los modelos anteriores de lipofuscina y los ensayos clásicos de fagocitosis del segmento externo de persecución de pulsos.

Modelos mejorados de lipofuscina y cuantificación de la capacidad de fagocitosis del segmento externo en cultivos epiteliales de pigmento retiniano humano altamente polarizados

Este protocolo describe el procedimiento para obtener y cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina (EPR) a partir de ojos porcinos de origen local. Estas células sirven como una alternativa de alta calidad a las células madre y son adecuadas para la investigación in vitro de la retina.

Aislamiento de células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina para modelado in vitro

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Aprende a purificar segmentos externos de fotorreceptores de retina porcina o bovina mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. Este método permite almacenar grandes stocks a -80°C para ensayos de fagocitosis en células epiteliales pigmentarias retinianas.

A gran escala de purificación de porcino o bovino fotorreceptor Outer Segmentos para Fagocitosis ensayos sobre células pigmento retiniano epitelial (Video) | JoVE Journal

A gran escala de purificación de porcino o bovino fotorreceptor Outer Segmentos para Fagocitosis ensayos sobre células pigmento retiniano epitelial

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