A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de una cóclea embrionaria tomada de un ratón reportero fluorescente a intervalos de 30 minutos durante cinco días. Esto se logra mediante la recolección inicial de cóclea embrionaria de día 13 de ratones reporteros fluorescentes. A continuación, se cultiva la cóclea in vitro.

A continuación, los cultivos cocleares se colocan en un microscopio incubador. Por último, se establece una rutina de imágenes automatizada y se obtienen imágenes de la cóclea E. En última instancia, las imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de los cultivos cocleares explan se pueden utilizar para mostrar los movimientos morfogenéticos del epitelio coclear en su conjunto, así como los cambios en la expresión del gen reportero a lo largo del tiempo y los efectos de los agentes farmacológicos de acción lenta.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la fotografía manual de las culturas de los fondos X a lo largo de un período de tiempo, es que este sistema está totalmente automatizado. Permite recolectar más puntos de tiempo y garantiza que la misma región de la cóclea o conjunto de células se visualice con la misma orientación en cada punto de tiempo, todo mientras crece en una incubadora de cultivo de tejidos irregular. Después de complementar el medio de águila modificado de KO o DMEM y la solución salina de equilibrio de Hank o HBSS de acuerdo con el protocolo de texto adjunto.

Bajo una campana de flujo laminar, use cinco mililitros de DMEM no suplementado para resuspender, 200 microlitros de sustrato de membrana basal pipetea 150 microlitros en el centro de cada pocillo de 10 milímetros de una placa de cultivo con fondo de vidrio de 35 milímetros de diámetro. Incubar durante 40 minutos en una incubadora de CO2 a 35 grados centígrados. Para preparar la estación de trabajo y las herramientas, encienda el banco de limpieza de flujo laminar y use etanol al 70% para rociarlo y remojar pinzas, cucharas y un plato recubierto de silicona negra.

En la estación de trabajo limpia, recoja los embriones de la gestación adecuada en hielo. HBSS frío suplementado con montones al 1%. Usando un microscopio estereoscópico fluorescente, identifique los embriones que exhiben actividad reportera externamente o dentro de un órgano visible y transfiéralos a HBSS fresco y helado con montones del 1% para recolectar huesos temporales, usando una fuente de luz fría y pinzas finas.

Trabaje rápidamente para cortar las vértebras cervicales y debajo de la mandíbula para recoger las cabezas. Después de recolectar las cabezas de los embriones de acuerdo con el protocolo de texto, abra con cuidado el cráneo, luego retire el recorte del cerebro de la parte delantera de la cabeza y transfiera el cráneo posterior a un plato con hielo fresco. Frío. Los montones de HBSS diseccionan cuidadosamente los huesos temporales en forma de cacahuete, teniendo cuidado de mantener intacto el sistema vestibular.

Para diseccionar la cóclea, transfiera los huesos temporales a un plato recubierto de elastómero de silicona negra en montones de HBSS helados. Sujete la región vestibular del hueso insertando clavos en un ángulo oblicuo para estabilizar el hueso temporal y crear espacio para las pinzas. A continuación, retire con cuidado el cartílago que rodea la cóclea insertando un lazo de las pinzas en el cartílago en el borde exterior de la base de la cóclea y recortando un agujero en el cartílago.

Sujételo horizontalmente a través de la parte superior y levante en diagonal y con cuidado la sección frontal de la cápsula. Inserte una punta de las pinzas entre el cartílago restante y el conducto, y corte suavemente el cartílago restante. La superficie apical de la cóclea ahora está expuesta.

Comenzando en la base, atrape el área donde el techo del conducto se encuentra con el epitelio coclear y abra el conducto coclear. Despegue suavemente la moldura del techo cuando sea necesario hasta que se retire por completo. Recorte cualquier porción de membrana que quede en el lado medial del conducto.

A continuación, limpie el conducto del exceso de tejido mesenquimal y separe el conducto del sistema vestibular para cultivar implantes. Coloque una superficie luminal en el centro de una placa de cultivo con fondo de vidrio recubierta de sustrato. Retira el líquido con cuidado y déjalo actuar durante dos minutos.

A continuación, gota a gota. Añadir 150 microlitros de DMEM suplementado al explan, teniendo cuidado de no alterarlo para que se asiente en el sustrato. Coloque los platos con fondo de vidrio en una placa de Petri profunda de 12 centímetros de diámetro con un plato pequeño de agua estéril para mantener la humedad.

Coloque los cultivos en una incubadora a 35 grados centígrados durante la noche para que el explan se adhiera al sustrato y se aplane para realizar imágenes en vivo. Después de seleccionar las muestras, utilice un microscopio estereoscópico fluorescente para evaluar el estado de cada cóclea explantada, y seleccione solo los explantes en los que el conducto esté intacto y se adhiera al vidrio desde la base hasta el ápice. Ajuste la incubadora a 35 grados centígrados con 5% de CO2 para cultivar.

El tejido coclear aspira suavemente el DMEM suplementado de los cultivos y sustitúyelo por al menos 500 microlitros por medio fresco. En los casos en los que los explan, pipetee un anillo de medio alrededor del borde del plato. Este líquido adicional formará una cámara humidificada en miniatura sin perturbar el diseño mientras continúa adhiriéndose a la matriz.

El microscopio en este ejemplo tiene una plataforma giratoria que contiene 8 placas de muestra de 35 milímetros debajo de la campana de flujo laminar. Sustituya las tapas de plástico por tapas de cristal e inserte los platos en el soporte para platos de muestra. Si es necesario cambiar el medio durante el transcurso del experimento.

Para evitar perturbar la explicación, utilice cubiertas de platos con bisagras que permitan la apertura de las tapas mientras la placa permanece en su accesorio en el microscopio, coloque el soporte de la placa de muestra dentro del microscopio de la incubadora, teniendo cuidado de no desalojar la placa del fondo de la placa o de alterar el medio. Para configurar la rutina de imágenes, encienda la lámpara UV del microscopio y la cámara, y abra el software de imágenes. Para cada muestra localizada, elija un plano de enfoque y exposición del área de imagen, teniendo en cuenta no solo la vista del plan en el momento del inicio, sino también cómo se moverá el tejido durante el transcurso de la ejecución.

En el canal de fluorescencia, establezca una pila Z centrada alrededor del plano focal seleccionado. A continuación, establezca la frecuencia y la duración del muestreo para el experimento. Esto estará limitado por el tiempo que se tarda en recopilar imágenes para generar una película al final de un período de lapso de tiempo.

Utilice un software como METAMORPH para abrir los archivos de imagen de una muestra fotograma a fotograma. Elija el mejor plano focal para mostrar la población celular de interés. Finalmente, convierta las imágenes en un archivo de punto VI, o expórtelas como un montaje para generar un conjunto de imágenes que se pueden abrir y analizar en un software de procesamiento de imágenes o convertir a otros formatos.

Aquí se muestra una película que demuestra cómo crecerá un explanado coclear organotípico si se platea. En E 13.5 se utilizó un ratón reportero SOX dos para visualizar la región sensorial pros como se ve en verde a medida que las células de las regiones no sensoriales se dividen y se mueven. La región sensorial no proliferativa en verde experimenta reordenamientos de tejidos y movimientos de extensión convergentes.

Un segundo experimento de lapso de tiempo centrado en la base media de un modelo coclear diferente demuestra que a medida que se extiende, la región sensorial se estrecha cuando se cultiva por primera vez. El grosor del tejido permite identificar regiones de expresión, pero no células individuales.

Sin embargo, después de tres días en cultivo, el tejido se ha aplanado considerablemente, lo que permite visualizar células fluorescentes individuales siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la tinción inmunofluorescente o la extracción de proteínas y ARN, para evaluar los cambios en la expresión génica a nivel molecular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar y cultivar la cóclea y cómo usar un microscopio de incubadora para realizar imágenes en vivo durante todo el período de días.