Identificación de los factores clave que regula la auto-renovación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas EML por análisis de secuenciación de ARN-

El objetivo general de este procedimiento es identificar posibles reguladores clave de la autorrenovación y diferenciación de las células EML de ratón mediante el uso de tecnología de secuenciación de ARN. Esto se logra separando primero las células EML CD 34 positivas de linaje negativo y CD 34 negativas de linaje negativo en función de los marcadores de superficie. El segundo paso es aislar el ARNm, convertirlo en ADNc y preparar la biblioteca para la secuenciación.

A continuación, la biblioteca de ADN se somete a una secuenciación de alto rendimiento. El paso final es analizar los resultados de la secuenciación y buscar factores de transcripción expresados diferencialmente. En última instancia, la tecnología de secuenciación de ARN se utiliza para mostrar factores de transcripción expresados diferencialmente en células EML CD 34 positivas para linaje negativo y CD 34 negativo para linaje negativo.

La principal ventaja de la secuenciación de ARN sobre otros métodos de prolene de expresión G, como los microrayos, es que tiene una mayor sensibilidad, precisión y un rango dinámico más amplio, y no depende de la información de anotación de genes preexistente. Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo de las células madre, como cuáles son los factores de transcripción clave que regulan la autorrenovación y diferenciación celular. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia de la enfermedad de la sangre, ya que una mejor comprensión de los reguladores clave que controlan las células precursoras hematopoyéticas, la autorrenovación y la diferenciación pueden conducir al desarrollo de tratamientos efectivos.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se requieren varias herramientas bioformales para el análisis de secuenciación. El riñón de hámster bebé o las células BHK para la recolección del factor de células madre se cultivan en medio dmem que contiene 10% de FBS en un matraz de 25 centímetros cuadrados a 37 grados Celsius y 5% de CO2. Cuando las células hayan alcanzado el 80 al 90% de confluencia de ojos de tripsina y recoja las por centrifugación a 200 Gs durante cinco minutos a temperatura ambiente, deseche el snat y vuelva a suspender la paleta celular en 10 mililitros de medio de cultivo celular BHK fresco.

Transfiera dos mililitros de la suspensión celular a un nuevo matraz de 75 centímetros cuadrados y agregue 48 mililitros de cultivo celular fresco de BHK. Medio para el cultivo en matraz. Las células BHK durante dos días.

Después de dos días, recoja el medio de cultivo y páselo por un filtro de punto de 45 micrómetros. Almacene el medio a menos 20 grados centígrados. Las células eritroides, mieloides y linfocíticas o EML de ratón utilizadas en este protocolo se cultivan en suspensión en un medio básico EML que contiene un medio de cultivo celular BHK a 37 grados centígrados y 5% de CO2.

Mantenga las células EML a una densidad celular baja con una densidad máxima de menos de 600.000 células por mililitro. Divida las células cada dos o tres días en una proporción de uno a cinco paso a las células suavemente, pero durante no más de 10 generaciones para agotar las células positivas de linaje. Recolectar las células EML por centrifugación a 200 Gs durante cinco minutos.

Lave las células una vez con PBS y centrifugue nuevamente después de desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en PBS y cuente las células con un hemocitómetro. El número de células es necesario para determinar la concentración de anticuerpos en el paso siguiente.

Aísle las células de linaje negativo o negativo de línea utilizando un cóctel de anticuerpos de linaje y un sistema de clasificación de células activadas magnéticamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para comenzar este procedimiento, haga girar las células lin negativas a 200 G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet de células con PBS y cuente las células con un hemocitómetro.

Lave las celdas dos veces con el tampón de fax. Después del segundo lavado, pegue las células a 200 Gs durante cinco minutos. Etiquete los cinco tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros con los números 1, 2, 3, 4 y cinco respectivamente.

Vuelva a suspender las células con un volumen adecuado de tampón de datos a una concentración de 1 millón de células por cada 100 microlitros. A continuación, alícuota de 100 microlitros de suspensión celular a cada uno de los cinco tubos de microcentrífuga. Añada un microgramo de anticuerpo anti ratón CD 34 FE al tubo uno y al tubo dos.

Mezcle los tubos, incube suavemente todos los tubos a cuatro grados centígrados durante una hora en la oscuridad. A continuación, agregue 25 microgramos de antica conjugada con PE, un anticuerpo y 20 microlitros de un linaje conjugado con PC. Cóctel de anticuerpos a dos uno, añadir el punto 25 microgramos de PE conjugado antica un anticuerpo al tubo tres y 20 microlitros de un linaje conjugado PC.

Cóctel de anticuerpos contra el tubo cuatro. Mezcle los tubos suavemente e incube las células a cuatro grados centígrados durante 30 minutos adicionales en la oscuridad. Después de 30 minutos, agregue 300 microlitros de tampón de fax a todos los tubos y gire las celdas a 200 G durante cinco minutos.

Lave las celdas tres veces con 500 microlitros de tampón de fax después del lavado final. Resus suspende cada pellet de célula en 500 microlitros de tampón de fax, aislado de lina, células SCA negativas, CD-34 positivas y lina-negativas, SCA negativas, CD 34 negativas en el tubo uno mediante clasificación de células activadas por fluorescencia. El ARN total se extrae de las células lin negativas CD 34 positivas y lin negativas CD 34 negativas utilizando triol y el ADN contaminado se elimina utilizando la desoxirribo nucleasa uno.

Siguiendo el protocolo del fabricante, evalúe la calidad del ARN total utilizando un bioanalizador siguiendo las instrucciones del fabricante, solo se utilizan muestras de ARN con un número de integridad de ARN o RIN superior a nueve para la extracción de ARNm y los procedimientos posteriores de construcción de bibliotecas. Esta figura muestra el resultado de una muestra de ARN de alta calidad con un RIN igual a 9,4. El protocolo de construcción de la biblioteca utilizado aquí es específico de la plataforma de secuenciación de ARN Illumina y utiliza un kit de preparación de muestras de ARN.

Siga las instrucciones proporcionadas por el fabricante porque en este video solo se muestran los pasos seleccionados. Comience seleccionando positivamente el poli MNA utilizando perlas magnéticas DT oligológicas. A continuación, fragmente el ARNm poli y realice una transcripción inversa utilizando cebadores aleatorios para convertir el ARNm en CD NA. Posteriormente, se utiliza la segunda cadena sintetizada CD NA para generar ADN bicatenario.

A continuación, se eliminan los tres voladizos principales y los cinco voladizos principales se rellenan con denato de ADN polimerasa. Los tres extremos principales de los fragmentos de CD NA se ligan entre sí. Agregue adaptadores de indexación multiplex a ambos extremos del CD NA de doble cadena para la secuenciación.

Por último, realizar la PCR para el enriquecimiento del CD NA de los fragmentos utilizando un espectrofotómetro, medir la absorbancia dos 60 sobreabsorbancia dos 80 del ADN amplificado. Para obtener información sobre la concentración de la biblioteca, evalúe la calidad de la biblioteca y mida el rango de tamaño de los fragmentos de ADN utilizando un bioanalizador. Los métodos para el análisis de datos de secuenciación de ARN se encuentran en el texto del protocolo adjunto e incluyen el procesamiento de archivos de datos para el análisis posterior, la detección de nuevas transcripciones y la evaluación del nivel de expresión, la detección de genes expresados diferencialmente y la identificación de factores de transcripción expresados diferencialmente.

Las células EML de linaje negativo se tiñeron con anticuerpos anti CD 34, antica uno y cóctel de linaje y lin, cráneo negativo, CD 34 positivo y lin negativo sca. Las células negativas CD 34 negativas se separaron utilizando únicamente la clasificación de células activadas fluorescentes. Las células Lin negativas se comprimieron para el análisis de la expresión de SCA one y CD 34.

Se observaron dos poblaciones de células EML cuando se terminó la construcción de la biblioteca. El tamaño de los fragmentos de ADN de la biblioteca se comprobó con un bioanalizador. Estos datos representativos muestran una biblioteca de buena calidad, pero el tamaño del fragmento alcanza un máximo de unos 300 pares de bases.

Se utilizó el algoritmo D-E-S-E-Q para el análisis de expresión diferencial con un enfoque en los factores de transcripción expresados diferencialmente, ya que los factores de transcripción son cruciales para la determinación de sulfatos. Se encontraron factores de transcripción que cambian más de 1,5 veces entre lin negativo CD 34 positivo y lin negativo CD 34 negativo y se muestran en este mapa de calor. En particular, el nivel de expresión relativa de TCF siete en las células CD 34 positivas para lin negativo es más de 100 veces mayor que en las células CD 34 negativas para lin.

Por lo tanto, se eligió el TCF siete para la inmunoprecipitación y secuenciación de la cromatina, el análisis y las pruebas funcionales para confirmar su función en la regulación de la autorrenovación y la diferenciación en las células EML. Una vez dominada, la biblioteca de ARN se puede terminar en unos pocos días y todo el procedimiento se puede completar en aproximadamente un mes si se realiza correctamente después de su desarrollo. Esta tecnología allanó el camino para los investigadores que están dispuestos a explorar diferencialmente la expresión génica entre diversos tipos de células y tejidos, como las células B y las células B malignas.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar ARN alto porque es la base de todo el procedimiento de enfermedad de ARN. Después de ver este video, debería tener una mejor comprensión de cómo identificar los reguladores clave que controlan la renovación y diferenciación celular EML.