Name: El Sistema Swimmeret de cangrejo de río: Una guía práctica para la disección del cordón nervioso y extracelulares Grabaciones del patrón motor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprende a diseccionar el cordón nervioso abdominal del cangrejo de río para realizar grabaciones electrofisiológicas de motoneuronas del sistema swimmeret. Este método permite estudiar patrones de locomoción fictiva y coordinación de generadores de patrones centrales en neurociencia.

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Damos las gracias a Jos Burgert por ayudar con algunas de las figuras. Estamos muy agradecidos a Ingo Selbach (y el grupo &quot;Edelkrebsprojekt NRW&quot;) por sus esfuerzos para suministrar el laboratorio con animales de experimentación. Damos las gracias a Anna C. Schneider para la corrección primeras versiones del manuscrito. Esta investigación fue apoyada por una beca SM Emmy Noether DFG 206 / 3-1 y una subvención de inicio de la Universidad de Colonia para la facultad femenina.

Este procedimiento de disección está de acuerdo con las Comunidades Europeas Directiva del Consejo de 22 de septiembre de 2010 (2010/63 / UE). 1. Preparación <ol><li> Obtener cangrejos, Pacifastacus leniusculus (Dana), de ambos sexos ≥8 cm de tamaño. Asegúrese de que los animales son vitales y las extremidades y abdomen abdominales están intactos. </li><li> Tenga cuidado para inspeccionar el caparazón y que esta cutícula es duro y rígido. Antes y animales postmuda tienen un caparazón suave y no son adecuados para los experimentos debido a que durante el proceso de muda muchos parámetros cambian (por ejemplo, disminución de la actividad locomotora). </li><li> Ensamblar todas las herramientas y materiales utilizados durante la disección, alfileres y desheathing del cordón nervioso se muestra en la Figura 2 y que figuran en los suplementos suministrados. </li></ol><img alt="Configuración del microscopio de disección con herramientas quirúrgicas para el análisis de muestras biológicas; Incluye fuente de luz." src="/files/ftp_upload/52109/52109fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: (1) gran cubo lleno de hielo; (2) solución salina cangrejos; (3) dispensador de solución salina; (4) microscopio de disección; (5) plato de disección; (6) tijeras fuertes; (7) pinzas (8) tijeras de primavera; (9) caja de Petri llena de Sylgard claro; (10) pernos de fijación; (11) fuente de la lámpara fría. 2. Bruto Disección <ol><li> Anestesiar a los animales en hielo durante 15 - 20 min. Llevar a cabo la primera parte de la disección bruto a un banco de laboratorio cerca del fregadero, ya que incluye un paso exanguinación y la muestra necesita ser enjuagado regularmente con solución salina cangrejos de río durante el procedimiento. </li><li> Sostenga la parte ventral de los animales y utilizar tijeras fuertes para cortar las dos garras en sus bases cerca de tórax (Figura 3-1). Retire urópodo izquierda y derecha (Figura 3-2). </li><li> Coloque la cara ventral de los animales en el plato forrado con disección Sylgard negro. Elevate cefalotórax mediante la inserción de hielo debajo y precisar el abdomen en el telson (Figura 4A). </li><li> Llene el depósito de solución salina con ~ 60 ml de solución salina enfriada cangrejos. Perfundir cangrejos con solución salina fría a través de la apertura de la garra (Figura 4B). El exceso de solución salina se escurra a través de los cortes en los urópodos. Cubrir los cangrejos con hielo durante desangramiento </li><li> Decapitar al animal con un único corte transversal justo por detrás de los ojos del animal con unas tijeras fuertes (Figura 5A). Retire todos piernas para caminar cerca de las articulaciones de base como se indica en la figura 5B. </li><li> Aislar el abdomen con los últimos segmentos torácicos desde el resto de la cephalothorax. Hacer un primer corte en el nivel de las segundas patas para caminar (segmento torácico 3) mediante la inserción de la punta de las tijeras en la abertura de la segunda pata caminar y de corte hacia el lado opuesto. (Figura 6A-1). </li><li> Extender este primer corte a ambos lados a través de tque cefalotórax (Figura 6A-2). </li><li> Voltear el animal abierta para que algunos de los órganos internos visibles. Empuje la glándula digestiva prominente (Figura 6B-3) a la parte anterior de la muestra y el uso de fórceps para retirar los órganos reproductivos de la cavidad abdominal. </li><li> Retire la parte anterior del cefalotórax (Figura 6C). Utilice cortes laterales para eliminar las partes laterales del caparazón, que cubren las branquias, en ambos lados del tórax restante (Figura 6D-4). Retire las branquias y enjuague la muestra con solución salina fría. </li><li> Continuar la disección con un corte a través de toda la longitud de la placa esternal como se indica en la Figura 6E-5. Hacer este recorte en las posiciones laterales máximas entre Pleurón y swimmerets (Figura 6E marcas rojas). Proceder en el otro lado con un mismo corte. Enjuagar la muestra con solución salina fría. </li><li> Llevar a cabo la disección restante bajo un dissection microscopio. Coloque el lado ventral del abdomen de los cangrejos de río arriba en el plato de la disección forrado con Sylgard negro y lleno con solución salina cangrejos de río de modo que cubra la muestra. NOTA: Los siguientes pasos (02.12 a 04.08) contiene instrucciones direccionales que se aplican a los experimentadores diestros. En los siguientes pasos (02.12 a 06.08) es importante para reemplazar salina cangrejos en intervalos regulares, cada 20 a 30 minutos con solución salina fría, para mantener el sistema nervioso saludable. </li><li> Fijar la muestra con alfileres de insectos posteriormente en el telson y anterior a los restos del caparazón. Coloque la muestra de forma que los puntos de Telson a la izquierda y es paralelo al borde de la mesa. </li><li> El uso de fórceps gruesas en la mano izquierda para agarrar a través de una abertura de la pierna para caminar (Figura 7A) y tire de la muestra abierta (flecha blanca Figura 7B). Identificar los grandes dos cadenas musculares flexor dorsal (Figura 7B-1 y C-1) y reducir su ventralbase como se muestra en la Figura 7B. </li><li> Identificar la arteria esternal (Figura 7C-2), que desciende del dorsal (el corazón) a ventral, en el segmento torácico 4º. Esta arteria se encuentra justo por encima del cordón nervioso (Figura 7C-3), antes de que se proyecta bajo el cordón nervioso, formando la arteria ventral. </li><li> Seccionar la arteria esternal. Como se demuestra en la Figura 7C, levante la arteria primero, utilizando una cuchilla de las tijeras, y sólo cortar cuando el cordón nervioso ventral situado es visible. </li><li> Fijar los músculos flexores dorsales anterior (a la derecha). Esto debe hacerse con la máxima posición estirada con alfileres para que no se bloquee la visión y la muestra permanece en tensión. Cuando las fibras musculares se fijan dorsal (Figura 8-1), el primero de los ganglios abdominal, A1 y ​​A2, con los nervios asociados N1, N2, y N3 son visibles (Figura 8). </li><li> El uso de fórceps en la mano izquierda para agarrar la especificaciónimen en una abertura de las piernas para caminar. A lo largo de los siguientes pasos disección tire suavemente para mantener la muestra abierta. </li><li> Seccionar los nervios N3 en la posición más distante del cordón nervioso. (Figura 8-3). </li><li> Cortar los músculos flexores cerca de la apodema ventral como se muestra en la Figura 8-4. Tenga cuidado de no dañar el cable de los nervios o la N2 nervios. </li><li> Repita los pasos de 2,18 y 2,19 para la N3 nervios y los músculos flexores de los restantes abdominal ganglios A2 a A5. </li><li> En el último ganglio abdominal, A6, cortar los músculos flexores dorsales del apodema ventral y el espécimen debe verse como se muestra en la Figura 9. </li><li> Cortar la placa posterior del esternón a los nervios del A6 (Figura 9-1) y mantener la parte ventral (Figura 9-2). Deseche la parte dorsal con los músculos flexores (Figura 9-3). Fije la placa esternal anterior con alfileres en las aberturas de las piernas para caminar,y posteriormente a A6. </li></ol> 3. fina disección <ol><li> Coloque la muestra bajo el microscopio con la parte anterior dirigida lejos y la parte posterior hacia el borde de las tablas. </li><li> El uso de fórceps, como se muestra en la Figura 10A para eliminar las partes más anteriores de la sterna cefalotórax. NOTA: Los ganglios torácicos y nervios asociados están parcialmente cubiertas por la musculatura de la pierna y sterna cefalotórax. El sterna cefalotórax formar un esqueleto que separa las cavidades situadas lateralmente de las piernas para caminar unos de otros y de la cavidad medial en el que reside el cordón nervioso ventral. </li><li> Cortar los músculos entre las estructuras exoesqueléticas restantes tal como se indica en la Figura 10B -1 y B2. El uso de fórceps para agarrar y levantar la parte anterior del cordón nervioso ventral (Figura 10C). NOTA: El cordón nervioso será dañado en el proceso para evitar la captación de la nerve cable varias veces. </li><li> Cortar los nervios torácicos lateralmente mientras levanta el cordón nervioso (Figura 10C-3). Mantenga estos nervios en longitud adecuada para la fijación. Quitar la parte exprimido de la cadena de ganglios, que fue recogido con una pinza, cortando todo el tejido anterior a la T4 (Figura 10C-4). </li><li> Coloque la muestra con la parte anterior a la izquierda y se centran en A1. Cortar la N1 y N2 nervios de A1 en una longitud adecuada (máx. 1 cm) para fijar a cabo. </li><li> Concéntrese en A2 e identificar los nervios N1, N2, N3 y de este segmento (Figura 11). Los nervios N1 de ganglios abdominal A2-A5 residen entre dos repliegues cuticulares esternales en cada segmento (Figura 11A-1) y están cubiertos por la musculatura. Haga un corte a lo largo de la invaginación cuticular esternal posterior. Comience en el borde lateral del abdomen y proceder hacia la línea media, como se muestra en la Figura 11A. </li><li> Si el objetivo sigue siendo N1 calarojo con el tejido como se muestra en la Figura 11B (flecha roja), corte a través del haz muscular, pero esta vez anterior a los dos repliegues cuticulares esternales y el nervio N1 (Figura 11B-2). </li><li> Cortar N1 nervio lo más distante posible (Figura 11 C-3). Nervio N1 es totalmente visible y la rama anterior y posterior se puede identificar (Figura 11C). </li><li> Proceder a la N1 nervio contralateral y primero cortar los músculos a lo largo de la invaginación cuticular esternal posterior, comenzando medialmente, cerca del ganglio (Figura 11D). Si el nervio está todavía cubierta por el tejido, corte a través del haz muscular, pero esta vez anterior a los dos repliegues cuticulares esternales y el nervio N1, similar a la figura 11B-2. Cortar la N1 nervio lo más distante posible. </li><li> Cortar los nervios N2 de este ganglio a una longitud adecuada (aprox. 0,5 cm) para la fijación. </li><li> Repita los pasos 3.7 a 3.11 para los nervios de A3-A5. </li><li> Cortar el nerves de ganglio A6 lo más distante posible (Figura 12A). El uso de fórceps para agarrar múltiples nervios de A6 a levantar este ganglio y empezar a aislar la cadena de ganglios de la placa esternal. </li><li> Mientras levanta el cordón nervioso, tire de ella suavemente en la dirección anterior como se demuestra en la figura 12B (flecha blanca). A medida que se levantaron los ganglios individuales, retire la arteria ventral que puede ser instalado en la parte ventral del cordón nervioso (Figura 12C). Continúa esta secuencia (suavemente) cortar pull-hasta que el cordón nervioso está completamente aislado. </li><li> Transferir la cadena aislada de ganglios a una placa de Petri llena de Sylgard claro y lleno de solución salina cangrejos de río (Figura 12D). </li></ol> 4. Fijación del cordón nervioso en la placa de Petri NOTA: Utilice pequeños pasadores cortados de alambre de acero inoxidable (ver suplementos) para fijar el cordón nervioso. Toque sólo la terminación nerviosa con las pinzas y no hacer squeeze las conectivas o ganglios. <ol><li> Pin de la cadena de ganglios en línea recta, mientras que la aplicación suave estiramiento. </li><li> Colocar el cable de nervio en la placa de Petri con el lado dorsal hacia arriba (Figura 13, línea negro). El lado ventral de los ganglios puede ser identificado por su convexidad; el lado dorsal es plana. Pin de los nervios torácicos a los lados. Continuar con los nervios de A6, estirando la cuerda nerviosa largo de su eje longitudinal. </li><li> Pin los nervios de A1 en un ángulo de 90 ° en relación con el cordón nervioso. </li><li> Continúe con el A2 y el pin de la N2 nervios en un ángulo de 35 a 45 ° en relación con el cordón nervioso (Figura 1). </li><li> Separar los nervios N1 en sus ramas anterior y posterior antes de fijar como se demuestra en la Figura 14. Utilice dos pares de pinzas finas para recoger con un par de pinzas de la anterior y con la otra la rama posterior del nervio N1. Tenga cuidado al elegir sólo el extremo más distals de las ramas del nervio. Ahora tire cuidadosamente separados. </li><li> Pin de la rama anterior de la N1 nervio en un ángulo de 90 ° con respecto al cordón nervioso (Figura 1A). Pin de la rama posterior del nervio N1 entre la rama N1 anterior y el nervio N2. </li><li> Repetir el 4.4 hasta 4.6 pasos por los nervios de los ganglios A3-A5. Si bien fijando el tramo cordón nervioso en longitudinal, así como las direcciones transversales. </li></ol> 5. Desheathing los ganglios <ol><li> Coloque la preparación de tal manera que las manos del experimentador siempre están descansando en un plano estable para evitar la agitación. Con el fin de desheath los ganglios iluminan el cordón nervioso desde abajo. </li><li> Concéntrese en cualquier ganglio abdominal A1 a A5. Con unas tijeras finas primavera para hacer un pequeño corte lateral a través de la vaina del ganglio, posterior al ganglio y entre los nervios N2 y N3 (flecha roja Figura 15A). </li><li> Recoge la vaina ganglio usando muy ffórceps INE y cortan transversalmente a través de la vaina por encima de los conectivos, como se indica en la figura 15A-1. Tenga cuidado de no apretar o cortar el cordón nervioso con las tijeras. </li><li> Todavía sostener y levantar la vaina ganglio con pinzas siguen a cortar a lo largo de los bordes laterales del ganglio (Figura 15B-2 y -3). Retire la funda. Alternativamente fijarlo a ambos lados de las conectivas de tal manera que se fija el cordón nervioso pero no se aprieta. </li><li> Repita los pasos 5.2 a 5.4 para todos los ganglios de A1 a A5 abdominal. </li><li> Desheathe los ganglios torácicos y el ganglio A6 de una manera similar. Para desheathe A6 inicio anterior al ganglio y proceder en dirección posterior. Pin de la vaina de ganglio A6 al extremo posterior de la cadena de ganglios. </li></ol> 6. extracelular Grabaciones de neuronas motoras <ol><li> Ensamblar todas las herramientas y materiales utilizados para las grabaciones extracelulares mostrados in Figura 16B y que figuran en los suplementos. Una visión general de la configuración de la grabación se muestra en la Figura 16A. Iniciar todo el equipo electrónico utilizado en este experimento (Figura 16C), de manera que los amplificadores pueden calentarse durante al menos 30 min antes de la grabación. Encienda el ordenador e inicie el software de grabación. </li><li> Coloque la cadena de ganglios en la mesa microscopio e iluminar desde abajo. Insertar el electrodo de registro en el Sylgard cerca del nervio objetivo y el electrodo de referencia en una posición cercana, pero lateral a los ganglios (Figura 17A y B). Doble el nervio objetivo alrededor del electrodo de registro (Figura 17C). </li><li> Estire el nervio ligeramente, para asegurar el contacto entre el electrodo y el nervio y el pin en el lado (F igura 17D). Fijar los cables de los electrodos a la mesa microscopio usando arcilla, para que se mantengan en la posición deseada. </li><li> Utilice unjeringa llena de vaselina y una aguja de calibre 20 (con punta redondeada) (Figura 17E-3) para aislar el nervio objetivo de la solución de baño. Primero aplique un poco de vaselina en el Sylgard alrededor del electrodo de registro. El resultado es una capa de vaselina que cubre el Sylgard en la proximidad del electrodo de registro (Figura 17E-4). Tenga cuidado de no frotar directamente sobre el nervio y evitar las burbujas de aire en esta capa. </li><li> Sellar el electrodo de registro con vaselina desde todos los lados hasta el nivel de la superficie de la solución salina (Figura 17F). </li><li> Repita este procedimiento para todos los nervios de destino cuya actividad debe ser monitoreado. </li><li> Inicie la grabación. Use un modo de adquisición libre continua o hueco y una frecuencia de muestreo de 5 kHz. Ajuste el amplificador extracelular a los siguientes parámetros; ganar para 1000 (amplifica la señal de 1.000 veces, tener cuidado de incluir este parámetro amplificación en la configuración del software de adquisición) unda gama de filtros de paso de banda de 300 Hz (corte bajo) a 2000 Hz (corte alto). </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

<html> La anatomía del cangrejo de río y su ganglio abdominal se ha descrito anteriormente 5, 18, ​​19, 20 y se recomienda para familiarizarse con ellos antes de la disección para evitar el corte de nervios importantes. Es fundamental para mantener la preparación a temperaturas inferiores a 23 ° C para evitar la degradación del cordón nervioso aislado. Esto se puede conseguir fácilmente mediante la sustitución de la solución de baño cada 20-30 min con solución salina cangrejos de r...

Los swimmerets de cangrejos de río tienen una función en el control de la postura y la golpeaban rítmicamente cuando los animales nadan hacia adelante, ventilar sus madrigueras o hembras airean sus huevos 5, 6. Los swimmerets del cangrejo señal, Pacifastacus leniusculus, ocurren en pares de la segunda a la quinta segmento abdominal, con una extremidad a cada lado del abdomen 7. El sistema nervioso central produce en su propia el golpeteo rítmico motor que impulsa el movimiento swimmeret en el animal intacto, así como en la preparación cordón nervioso aislado. Cuando no hay retroalimentación sensorial o de entrada presente descendente el patrón motor rítmico producido se llama la locomoción ficticia 1, 2. En el sistema swimmeret este patrón motor no difiere en cualquier parámetro de la actividad de los swimmerets medidos en el animal intacto. El movimiento de cada swimmeret es accionado por un microcircuito que se encuentra en y limitado a un corresponding hemiganglion 1 -. 3 En cada microcircuito hay un kernel generadores de patrones que se compone de cinco interneuronas no enriquecidas identificados. Pueden caracterizarse funcionalmente como siendo Inhibidor de Power Stroke (IPS) o inhibidor de la carrera de retorno (IRS) 8. Estos IPS y interneuronas IRS no son osciladores endógenos, en lugar de su actividad alterna es impulsado por la inhibición recíproca 9. Debido a que estas interneuronas inhiben directamente las neuronas motoras swimmeret, la alternancia PS-RS movimiento se genera 10. Locomotion sin embargo, no sólo requiere la generación de actividad, sino también la coordinación de los diferentes microcircuitos independientes. En el sistema swimmeret dicha coordinación es establecida por el microcircuito de coordinación que asegura que las extremidades son activos en tiempos correctos. Este microcircuito es construido por tres neuronas identificadas en cada segmento de 11 a 15. Este protocolo prevé ªe primera vez una guía disección paso a paso para aislar la cadena de ganglios (T4 a A6, Figura 1). Mostramos cómo la clavija del cable aislado nervio abdominal y desheathe cada ganglio. En este aislado de preparación del sistema nervioso, las neuronas responsables del movimiento swimmeret están listos para su uso en experimentos electrofisiológicos y morfológicos. La segunda parte de este protocolo demuestra las principales características del patrón motor swimmeret. Esto incluye una guía paso a paso para grabar extracelularmente la actividad de las neuronas motoras swimmeret. Los axones de las neuronas motoras RS proyectan a través de la rama anterior del nervio N1, mientras que los axones de las neuronas motoras PS proyectan a través de la rama posterior del mismo nervio (Figura 1) 4. Por lo tanto su actividad se puede grabar a partir de estas ramas con electrodos diferenciales pines. <img alt="Diagrama de estructura neural e ilustración etiquetada para el estudio de anatomía, destacando las ramas nerviosas." fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig1highres.jpg" width="200" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Aislado sistema nervioso de ganglio torácico 4 (T4) para ganglio abdominal 6 (A6) y un diagrama esquemático de que T4:. Ganglio torácico 4; T5: ganglio torácico 5; A1, A2 ... A6 ganglio abdominal 1, el ganglio abdominal 2 ... ganglio abdominal 6; N1: nervios N1; N2: nervio N2; N3: nervio N3; PS: el poder de carrera; RS: vuelta de carrera. Abreviaturas direccionales: A = anterior; P = posterior. Este procedimiento de disección y la técnica electrofisiológica demostrado son convenientes para los estudiantes de pregrado y pueden complementar los cursos prácticos de los estudiantes en la fisiología. La cadena aislado de los ganglios se ha utilizado en una serie de experimentos para estudiar la función del sistema nervioso, la coordinación, o modulación de microcircuitos swimmeret 6 así como el control neuronal de la conducta adaptativa en la locomoción 16, 17. Así, el sistema swimmeret cangrejo de río proporciona una cantidad enorme de la enseñanza interesante o tllover las oportunidades que todos comienzan con la disección del cordón nervioso ventral de cangrejos de río y registro extracelular del patrón motor ficticio.

<table><tbody><tr><td>Amplificador extracelular de 4 canales: MA 102&nbsp;</td><td>Amplificador</td><td>Elektroniklabor, Zoologie, Universit&auml; t zu K&ouml; ln, Alemania</td><td></td></tr><tr><td>Air-table</td><td></td><td>Technical Manufacturing Corporation (TMC) una unidad de AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, EE. UU</td><td>. 63-534</td></tr><tr><td>Axon Digidata 1440A</td><td>Digitizador</td><td>Axon Instruments, Diseño de dispositivos moleculares, Union City, CA</td><td>DD1440A</td></tr><tr><td>gran cubo&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex & Clampfit</td><td>pClamp 10, software de registro y análisis</td><td>Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>pClamps 10 Fuente de</td></tr><tr><td>lámpara fría</td><td>estándar con guía de luz flexible (haz de fibra óptica)&nbsp;</td><td>Microscopios Euromex holanda, Arnhem, BD</td><td>LE.5211 & LE.5235</td></tr><tr><td>ordenador y monitor</td><td>equipado con software</td><td></td><td></td>de registro</tr><tr><td>, contenedor y pipeta para residuos líquidos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cangrejo de río salino&nbsp;</td><td>contiene (en mM): 5,4 KCl, 2,6 MgCl2, 13,5 CaCl2 y 195 NaCl, tamponado con 10 mM de base Tris y 4,7 mM de ácido maleico; aireado durante 3 horas. Ajuste a pH de 7.4.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dextrano, Texas Red (3000MW, lisina fijable)</td><td>tinte fluorescente, lisina fijable</td><td>Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemania</td><td>D3328</td></tr><tr><td>plato de disección&nbsp;</td><td>(largo x ancho x alto) 15x7x5 cm; forrado con silicona</td><td></td><td></td>negra</tr><tr><td>Pinzas de fijación</td> de la jaula <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>Faraday</td></tr><tr><td>(biología, Dumont #5)</td><td>Pinzas: Biología, punta 0,05 x 0,02 mm, longitud 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Alemania</td><td>11252-20</td></tr><tr><td>pinzas (biología, Dumont #55)</td><td>Pinzas: Biología, punta 0,05 x 0,02 mm, longitud 11cm, INOX</td><td>Pinzas Fine Science Tools (FST), Alemania</td><td>11255-20</td></tr><tr><td>(electrónicas, Dumont #5)</td><td>Pinzas: Estándar, punta 0,1 x 0,06 mm, longitud 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Alemania</td><td>11251-20</td></tr><tr><td>electrodo intracelular</td><td>Capilares de vidrio de borosilicato (diámetro exterior/interior: 1 mm/0,5 mm), con filamento</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>BF100-50-10</td></tr><tr><td>Leica S8 Apo StereoZoom</td><td>Microscopio de disección&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Zoom 1x - 8x</td><td>Leica, Alemania</td><td>10446298</td></tr><tr><td>espejo</td><td>de mesa</td> para iluminar la preparación desde abajo <td></td><td></td></tr> arcilla <tr><td>de modelismo</td><td></td><td></td><td></td></tr> Microscopio de disección <tr><td></td> Olympus SZ61&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Zoom 0.67x - 4.5x</td><td>Olympus, Alemania</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri&nbsp;</td><td>94 x 16 mm; forrado con silicona transparente</td><td>Greiner bio-one, Alemania</td><td>633180</td></tr><tr><td>tijeras de anillo</td><td>ThoughCut, filo: afilado/romo, recto: 13 cm</td> Tijeras de muelle <td>Fine Science Tools (FST), Alemania</td><td>14054-13</td></tr><tr><td>o alternativa: Tijeras de muelle Vannas</td><td>filo de corte: 8 mm, diámetro de la punta: 0,2 mm, recto: 10 cm o filo de corte 2,5 mm, diámetro de la punta 0,075 mm, recto: 8 cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Alemania</td><td>15024-10 o&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15000-08</td></tr><tr><td>estudiante Vannas&nbsp; tijeras de resorte o alternativa:&nbsp; Tijeras de resorte Moria</td><td>filo de corte: 5 mm, diámetro de la punta: 0,35 mm, recto: 9 cm o filo: 5 mm, diámetro de la punta 0,1 mm, recto: 8 cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Alemania</td><td>91500-09 o&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15396-00</td></tr><tr><td>sylgard</td><td>184 base de elastómero de silicona y agente de curado; para sylgard negro agregue carbón activado</td><td>Dow Corning, Midland, MI, USA</td><td></td></tr><tr><td>jeringa rellena de vaselina y equipada con una aguja de gauche 20 con punta</td><td></td><td></td><td></td> redondeada</tr></tbody></table>

el sistema swimmeret de cangrejo de río: una guía práctica para la disección del cordón nervioso y extracelulares grabaciones del patrón motor

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Aquí se demuestra la disección del nervio espinal cangrejos abdominal. La preparación comprende los dos últimos ganglios torácicos (T4, T5) y la cadena de ganglios abdominal (A1 a A6). Esta cadena de ganglios incluye la parte del sistema nervioso central (CNS) que impulsa la locomoción coordinada de los pleópodos (swimmerets): el sistema swimmeret. Se sabe desde hace más de cinco décadas que en los cangrejos cada swimmeret es impulsada por su propio núcleo generadores de patrones independiente que genera la actividad rítmica alternancia 1-3. Las neuronas motoras que inervan la musculatura de cada swimmeret comprender dos anatómica y funcionalmente distintas poblaciones 4. Uno de ellos es responsable de la retracción (carrera de potencia, PS) de la swimmeret. El otro impulsa la prolongación (carrera de retorno, RS) de la swimmeret. Las neuronas motoras del sistema swimmeret son capaces de producir espontáneamente un patrón motor ficticio, que es idéntico al patrón grabado en vivo </em&gt; 1. El objetivo de este informe es dar a conocer una interesante y conveniente sistema modelo para el estudio de las redes y la coordinación de los microcircuitos independientes para prácticas de laboratorio de los estudiantes de generación de ritmo. El protocolo previsto incluye paso a paso las instrucciones para la disección del cordón nervioso abdominal del cangrejo de río, el fijar de la cadena de aislados de ganglios, desheathing los ganglios y registrando el patrón motor ficticio swimmerets extracelular del sistema nervioso aislado. Además, podemos controlar la actividad de las neuronas swimmeret registrados intracelularmente a partir de las dendritas. Aquí también se describe brevemente estas técnicas y proporcionamos algunos ejemplos. Además, la morfología de las neuronas swimmeret se puede evaluar usando varias técnicas de tinción. Aquí proporcionamos ejemplos de intracelular (por iontoforesis) tinte lleno neuronas y rellenos de grupos de neuronas motoras swimmeret. En nuestro laboratorioutilizamos esta preparación para estudiar las funciones básicas de locomoción ficticia, el efecto de la retroalimentación sensorial sobre la actividad del SNC, y la coordinación entre los microcircuitos en un nivel celular.

Con las grabaciones extracelulares simultáneas de RS y PS, las neuronas motoras de un ganglio, la actividad alterna de estos conjuntos de neuronas motoras, se puede controlar (Figura 18), lo que representa el patrón de locomoción ficticia. <img alt="Análisis de impulsos neuronales, diagrama con señales etiquetadas RS, PS; configuración experimental y formas de onda." src="/files/ftp_upload/52109/52109fig18highres.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 18"><br...

Aquí describimos la disección del cordón nervioso abdominal del cangrejo de río. También demostramos una técnica electrofisiológica para registrar la locomoción ficticia de las neuronas motoras de Swimmeret.

El Sistema Swimmeret de cangrejo de río: Una guía práctica para la disección del cordón nervioso y extracelulares Grabaciones del patrón motor

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar el cordón nervioso abdominal del cangrejo de río para utilizarlo en estudios electrofisiológicos. Esto se logra anestesiando primero al cangrejo de río. A continuación, se realiza una disección macroscópica para aislar la placa ventral del cangrejo de río.A continuación, se realiza una disección fina para aislar completamente el sistema nervioso central desde los ganglios raicos hasta los ganglios abdominales. Un seis. Finalmente, se retira la vaina ganglionar de todos los ganglios para facilitar los experimentos electrofisiológicos.En última instancia, la cadena de ganglios abdominales se utiliza para registros extracelulares o intracelulares. Para estudiar la coordinación de los generadores de patrones centrales o para investigar la morfología y el contexto sináptico de las neuronas identificadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como proporcionar experiencia práctica sobre la función de la red nerviosa para poder registrar la conmoción fic FLA en el sistema nervioso aislado, o para caracterizar la morfología de los ganglios abdominales o la de neuronas específicas.Aunque este método puede proporcionar información sobre el sistema de velocidad de natación de los cangrejos de río. También se puede aplicar a otros sistemas, como una red neuronal que impulsa el comportamiento de volteo de la cola en el cangrejo de río que trabaja con el cangrejo de río del Pacífico Stacia Linea Guus. Después de anestesiar a un animal de acuerdo con el protocolo de texto, sostenga el lado ventral hacia arriba y use tijeras fuertes para cortar ambas garras en sus bases cerca del tórax.A continuación, retire los europods izquierdo y derecho. Coloque el animal con el lado ventral hacia arriba en un plato de disección forrado con sarda negra antes de usar solución salina fría para perfundir a través de la abertura de la garra. A continuación, usa unas tijeras fuertes para hacer un solo corte transversal justo detrás de los ojos del cangrejo de río para decapitarlo.A continuación, retire todas las patas que caminan cerca de las articulaciones de la base para aislar el abdomen junto con los últimos segmentos torácicos del resto del tórax. Inserte la punta de las tijeras en la abertura de la segunda pata para caminar y corte hacia el lado opuesto. Después de extender la incisión a ambos lados a través del tórax y exponer algunos de los órganos internos como se describe en el protocolo de texto, retire la parte anterior del tórax.Ahora retire los órganos internos y enjuague al animal con solución salina fría. Continúe la disección con un corte en una posición lateral máxima entre el lumón y las ratas nadadoras a lo largo de toda la longitud de la placa esternal. Haz el mismo corte en el otro lado.Coloca el abdomen del cangrejo con el lado ventral hacia arriba en la placa de disección. Utilice alfileres de insectos para fijar el espécimen posteriormente en el tellson y anteriormente en los restos de la carabase. Rellena el plato con suero salino de cangrejo de río para que cubra el ejemplar.Use pinzas gruesas en la mano izquierda para agarrar a través de la abertura de una pierna móvil y abrir la muestra. Identifica las dos hebras grandes del músculo flexor dorsal. Fíjalos y corta sus bases ventrales, así como la arteria esternal.Exponga los primeros ganglios abdominales A uno y los nervios asociados N uno N dos. Ahora pasando al segundo segmento abdominal. Retire la base de las hebras musculares cerca de la base ventral.El ganglio abdominal A dos es ahora visible con los nervios asociados N uno, N dos y N tres. Transecte los nervios N tres en la posición más distante del cordón nervioso. Repita estos pasos para los siguientes tres segmentos abdominales con los ganglios abdominales.Un tres a un cinco. Al llegar al ganglio abdominal, un seis. Corta la placa esternal, posterior a los nervios de un seis.Mantenga la parte ventral y sujétela con alfileres. Con el lado dorsal hacia arriba en el plato lleno de solución salina bajo el microscopio. Use fórceps para extirpar las partes más anteriores del céfalo torácico de popa.A continuación, corte los músculos entre las estructuras exoesqueléticas restantes. Después de levantar con cuidado el extremo anterior del cordón nervioso ventral, corte los nervios torácicos lateralmente. Concéntrese en un uno y corte los nervios N uno y N dos de un uno a un máximo de un centímetro de largo para sujetarlos.A continuación, muévase a A dos e identifique los nervios N uno, N dos y N tres de este segmento. Los nervios n uno de los ganglios abdominales, de dos a cinco. Residen entre dos cuticulares esternales en desdoblamientos en cada segmento y están cubiertos por musculatura.Luego, comenzando en el borde lateral del abdomen, haga un corte a lo largo del pliegue cuticular esternal posterior y proceda hacia la línea media después de descubrir N one de acuerdo con el protocolo de texto. Si es necesario, corte el nervio lo más distalmente posible. Proceda hacia el lado contralateral y comience a aislar el nervio N uno de la línea media cerca del ganglio, procediendo hacia el borde lateral cortando a lo largo del envolvimiento cuticular esternal posterior.Ahora corte los nervios N dos de este ganglio a una longitud adecuada para sujetarlo. A continuación, repita los pasos que se muestran para los ganglios abdominales. Un dos por un tres a un cinco lo más distalmente posible.Corta los nervios del ganglio a seis. Use fórceps para agarrar varios nervios de un seis para levantar el ganglio y comenzar a aislar la cadena de ganglios de la placa esternal. Después de aislar completamente el cordón nervioso, transfiera la cadena de ganglios a una placa de Petri forrada con un protector de umbral transparente y rellena de solución salina con pequeños alfileres cortados de alambre de acero inoxidable mientras aplica un suave toque de estiramiento.Sujete la cadena de ganglios en línea recta con el cordón nervioso dispuesto con el lado dorsal hacia arriba. Mantenga solo los dos últimos ganglios torácicos y fije los nervios torácicos a un lado. Sujeta con alfileres los nervios de uno en un ángulo de 90 grados con respecto al cordón nervioso.Luego proceda a un dos y fije los nervios N dos en un ángulo de 35 a 45 grados en relación con el cordón nervioso. Una vez que los nervios N uno estén separados y fijados de acuerdo con el protocolo de texto, fije la rama anterior del nervio N uno en un ángulo de 90 grados con respecto al cordón nervioso. A continuación, fije la rama posterior del nervio N uno entre la rama anterior N una y el nervio N dos.Dado que todos los ganglios abdominales tienen que ser desenvainados, use unas tijeras de resorte finas para hacer un pequeño corte lateral a través de la vaina ganglionar posterior al ganglio y entre los nervios N dos y N tres. Corte transversalmente a través de la vaina por encima del conectivo. Luego continúe cortándolo a lo largo de los bordes laterales del ganglio antes de quitar la vaina.Si es necesario, utilice pinzas finas para levantar la vaina y realizar registros extracelulares. Siguiendo la configuración de las herramientas y reactivos enumerados en el protocolo de texto, coloque la cadena de ganglios en la mesa del microscopio e ilumine desde abajo. Inserte el electrodo de registro en el protector sil cerca del nervio objetivo y el electrodo de referencia en una posición cercana pero lateral a los ganglios.A continuación, dobla el nervio objetivo alrededor de la grabación. Después de estirar y asegurar el nervio, use una jeringa llena de vaselina y una aguja de punta redondeada de calibre 20 para aislar el nervio objetivo de la solución de baño. Repita esto para todos los nervios cuya actividad deba registrarse.Finalmente, comience a registrar como se muestra aquí, la actividad PS extracelular de las neuronas motoras PS dos a PS cinco ipsilaterales comienza con un estallido de PS en un cinco y la onda de excitación se propaga en la dirección anterior. Además, el tiempo medido desde el inicio de una ráfaga hasta el inicio de la siguiente ráfaga en cada segmento permanece constante y se define como el período de los períodos de ritmo y ráfaga. Las duraciones pueden variar entre las diferentes preparaciones, pero el retraso de fase entre segmentos permanece constante en aproximadamente un cuarto del ciclo, independientemente de la frecuencia del ritmo.Estos patrones de coordinación se pueden ver mejor en los histogramas de fase que se ven aquí. Aquí, utilizando microelectrodos afilados, los registros intracelulares de las dendritas de las neuronas motoras Ps. muestran oscilaciones de fase de neuronas individuales con la actividad registrada extracelularmente de todas las neuronas motoras PS del mismo ganglio hemi. Para identificar las neuronas registradas intracelularmente, las células se pueden vaciar utilizando microelectrodos afilados e iontoforesis.En esta figura, la sosa ventral de dos neuronas motoras PS llenas de di se encuentra posterior a la base del nervio N uno. La neurita primaria se proyecta anteriormente y se ramifica dentro de la píldora neuro lateral. El axón se proyecta a través de la rama posterior del nervio N uno a la musculatura.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 45 minutos a una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar cambiar la solución salina a intervalos regulares para mantener el tejido nervioso sano. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el registro intracelular de neuronas motoras o interneuronas para responder a preguntas adicionales como analizar el mecanismo celular de coordinación, medir corrientes iónicas o estudiar el efecto de los neuromoduladores en la actividad rítmica de células específicas.

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El Sistema Swimmeret de cangrejo de río: Una guía práctica para la disección del cordón nervioso y extracelulares Grabaciones del patrón motor (Video) | JoVE Journal

El Sistema Swimmeret de cangrejo de río: Una guía práctica para la disección del cordón nervioso y extracelulares Grabaciones del patrón motor

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