Una Novela In vitro Modelo para el estudio de las interacciones entre Whole Sangre humana y del endotelio

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las interacciones entre la sangre y las células endoteliales mediante un nuevo ensayo de cámara endotelial sanguínea. Esto se logra recolectando primero sangre de un voluntario sano mediante venopunción de sistema abierto. En el segundo paso, la sangre se coloca cuidadosamente en capas sobre cámaras de sangre recubiertas de superficie de heparina junto con portaobjetos de cultivo de células endoteliales.

A continuación, estas cámaras de células endoteliales sanguíneas se rotan suavemente para facilitar la interacción entre la sangre y las células endoteliales. En última instancia, las interacciones de célula a célula entre la sangre y las células endoteliales y la producción resultante del complejo trombina y antitrombina se pueden evaluar mediante microscopía de inmunofluorescencia y Eliza, respectivamente. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los que utilizan modelos animales, es que aquí se puede utilizar un sistema de modelo humano para investigar la enfermedad vascular antes de comenzar el experimento.

Acople una aguja hipodérmica de calibre 18 a un tubo de silicona recubierto de superficie de heparina de dos milímetros de diámetro interior. Las superficies de plástico están recubiertas con heparina para evitar la activación inespecífica de la coagulación. Por ejemplo, en esta imagen, un coágulo es claramente visible en esta cámara sin recubrimiento.

Después de 30 minutos de contacto con la sangre, el tratamiento de la cámara con heparina de superficie protege la sangre de la activación incontrolada, asegurando que los resultados se deban a las interacciones sanguíneas de las células endoteliales. Solo después de conectar el tubo, recoja cuidadosamente una muestra de sangre de un donante sano mediante venopunción de sistema abierto en un tubo recubierto de superficie de heparina de 50 mililitros. Complemente la sangre recolectada con heparina no fraccionada para alcanzar una concentración final de 0.75 UI por mililitro e invierta el tubo dos o tres veces para una mezcla suave.

Para el análisis de la concentración inicial de proteínas en sangre, mezcle cuidadosamente un mililitro de sangre por tubo en tubos de microcentrífuga que contengan 30 microlitros de 10 milimolares K tres EDTA, y coloque los tubos en hielo. A continuación, utilice una punta de pipeta recubierta de superficie de heparina para transferir 1,5 mililitros de sangre a cada cámara de células endoteliales sanguíneas recubierta de superficie de heparina, teniendo cuidado de dejar que la sangre fluya lentamente y sin crear burbujas para evitar la activación. A continuación, retire las paredes de plástico de los portaobjetos de cultivo de células endoteliales de acuerdo con las instrucciones del fabricante y lave suavemente las células endoteliales.

Con PBS, movemos la mayor cantidad posible de lavado de las células sin dejar que los cultivos se sequen y colocamos los portaobjetos encima de las cámaras de sangre con las células mirando hacia la sangre. Luego, use correderas de plástico como soporte adicional. Para evitar la rotura de los portaobjetos de cultivo celular, coloque una pinza alrededor de cada cámara de células endoteliales sanguíneas para asegurar los portaobjetos.

Ahora, gire las cámaras en una rueda giratoria en un baño de agua a 37 grados centígrados a 0,5 G durante 30 minutos. Después de la rotación, desmonte las cámaras de células endoteliales sanguíneas, lave los portaobjetos de cultivo celular en PBS y fije las células en paraldehído al 1% helado durante 10 minutos. Finalmente, para evaluar la concentración de proteínas sanguíneas activadas, mezcle un mililitro de sangre de cada cámara en tubos de microcentrífuga que contengan 30 microlitros de 0,34 molar K tres EDTA, y coloque los tubos en hielo durante un máximo de una hora.

Luego, después de girar las células, almacene el plasma en nuevos tubos de microcentrífuga a menos 70 grados Celsius hasta un análisis adicional. La activación de los factores de coagulación es más probable que ocurra en la sangre estancada, ya que aumenta la probabilidad de una interacción entre los factores activados. De hecho, el volumen de sangre sin ningún movimiento por burbujas de aire es dos veces y media mayor.

Cuando se añaden 1,75 mililitros de sangre a la cámara en comparación con cuando se utilizan 1,5 mililitros de sangre, los valores medidos de trombina antitrombina sugieren un aumento de la formación de trombina antitrombina con un aumento del volumen sanguíneo también. Curiosamente, cuando se incuban con cualquiera de los volúmenes de sangre total, no se observan diferencias entre los dos grupos, lo que sugiere que las células endoteliales pueden modular la activación de la coagulación para estudiar el efecto del TNF alfa en el reclutamiento de leucocitos. En este experimento, los qve se trataron con 20 nanogramos por mililitro de TT NF alfa cuatro horas antes del contacto con la sangre, tras lo cual se cuantificó el número de células CD 16 positivas.

El reclutamiento de las células CD 16 positivas aumentó significativamente con el tratamiento con TNF alfa, de 100 a 256 células CD 16 positivas por milímetro cuadrado y 1,5 litros de sangre, y de 172 a 378 y 1,75 mililitros de sangre. A continuación, se midió la formación de los complejos trombina y antitrombina en las muestras de plasma correspondientes de la sangre incubada con células tratadas o no tratadas con TNF alfa. Como era de esperar, las células estimuladas con TNF alfa indujeron una duplicación aproximada de los complejos de trombina antitrombina en comparación con los controles no tratados después de su desarrollo.

Esta técnica abrirá el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploren, complementen y coagulen en un modelo in vitro utilizando células primarias humanas y sangre entera humana.