Name: La técnica de infiltración-centrifugación para extracción de apoplástico fluido procedente de hojas de la planta Uso Phaseolus vulgaris Como ejemplo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprende a extraer fluido apoplástico de hojas de Phaseolus vulgaris mediante infiltración-centrifugación. Este método optimizado minimiza la contaminación citoplasmática para análisis fisiológicos precisos.

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Este trabajo fue financiado por las subvenciones BB/J016012/1 y BB/E007872/1 del Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas del Reino Unido (BBSRC) a Gail Preston.

NOTA: La elección del material de partida de la hoja y la normalización de las condiciones de crecimiento de las plantas es fundamental, ya que estos factores pueden afectar en gran medida la calidad, la variabilidad y el rendimiento de AWF (Figura 1). Parámetros a tener en cuenta se muestran en la Tabla 1 y se analizan con más detalle en la discusión. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parámetro </td><td colspan="3"> Ejemplo estandarizaciones </td></tr><tr><td></td><td> Phaseolus vulgaris </td><td> Solanum lycopersicum </td><td> Arabidopsis thaliana </td></tr><tr><td> Tipo de hoja </td><td> Las primeras hojas verdaderas, completamente expandida, saludable </td><td> 2 ª y 3 ª hojas a partir de la parte inferior, 4 folletos más grandes toman folleto apical no se utiliza para la extracción apoplasto </td><td> Hojas en roseta totalmente expandidas </td></tr><tr><td> Edad de la planta </td><td> 21 días </td><td> 7-9 weeks </td&gt; <td> 7 semanas </td></tr><tr><td> Hora del día </td><td> Mitad del período de luz (12:00) </td><td> Mitad del período de luz (12:00) </td><td> Mitad del período de luz (12:00) </td></tr><tr><td> Hidratación </td><td> Todas las plantas bien regadas 1 hora antes de la cosecha </td><td> Todas las plantas bien regadas 1 hora antes de la cosecha </td><td> Todas las plantas bien regadas 1 hora antes de la cosecha </td></tr><tr><td> Luz </td><td> 16 h de luz, 400 mol m -2 s -1 </td><td> 16 h de luz, 400 mol m -2 s -1 </td><td> 10 horas de luz (día corto) desde la semana 2, 400 mol m -2 s -1 </td></tr><tr><td> Humedad </td><td> 70% </td><td> 70% </td><td> 70% </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> 22 ° C la luz, 18 ° C oscura </td><td> 22 ° C la luz, 18 ° C oscura </td><td> 21 ° C </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Ejemplos de pará estandarizadatros de hojas utilizadas en extracciones AWF. 1. Generación de apoplasto Lavado Fluid NOTA: Durante este protocolo materila peligrosos inculding patógenos microbianos a partir de hojas infectadas no se debe lavar por el desagüe; se deben utilizar procedimientos más adecuados de eliminación. <ol><li> Elige un aparato basado en el tamaño de la hoja: <ol><li> Infiltrarse en hojas más pequeñas (por ejemplo, Arabidopsis, frijol) utilizando una jeringa sin aguja. Utilice un frasco de vacío para infiltrarse en las hojas que son demasiado grandes para caber en una jeringa. Utilice el método de frasco vacío para infiltrarse en varias hojas a la vez. </li><li> Divida hojas que son demasiado grandes para el método de infiltración disponibles en pequeñas secciones usando una cuchilla de afeitar. Secciones de hojas Enjuague completamente cortadas en agua destilada antes de la infiltración para eliminar los contaminantes citoplásmicos que exudan de las células dañadas. </li></ol></li><li> La infiltración de la hoja usando una jeringa de 60 ml: <ol><li> Separe la hoja de laplanta en el peciolo usando una cuchilla de afeitar. Para hojas compuestas, tales como tomate, separar folletos en la peciólulo. </li><li> Enjuague la hoja recién extirpado por inmersión en agua destilada para eliminar contaminantes de la superficie de la hoja. Seque la hoja secando suavemente con papel absorbente o papel. </li><li> Medir el peso de la hoja antes de la infiltración. </li><li> Rodar con cuidado y / o doblar la hoja en una jeringa de 60 ml y llenar la jeringa con agua destilada (otros fluidos de infiltración pueden ser utilizados, véase el debate). Expulsar todo el aire dentro de la jeringa al tiempo que reduce el émbolo hasta aproximadamente la marca de 40 ml. </li><li> Cubrir la punta de la jeringa, ya sea con un dedo con guante o un trozo de Parafilm, a continuación, crear una presión negativa dentro de la jeringa tirando del émbolo hacia el exterior hasta la marca de 60 ml. Suelte lentamente el émbolo. NOTA: la liberación de la presión puede resultar en la lisis celular y la contaminación citoplasmática rápidamente. </li><li> Desenchufe la punta de la jeringa y se expulsa el aire, y luego vuelva a conectar la punta y pulsemás hacia abajo sobre el émbolo para crear una modesta cantidad de presión positiva. </li><li> Repita los pasos 1.2.5 - 1.2.6 hasta que la hoja está completamente infiltrada, como se ve por el color oscuro de las zonas infiltradas. </li><li> Retire la hoja de la jeringa. Suavemente pero a fondo secar la hoja con papel absorbente para eliminar el líquido de la superficie. </li><li> Medir el peso de la hoja infiltrada. Calcular la diferencia de peso antes y después de la infiltración que se aproxima estrechamente el volumen de infiltración. </li></ol></li><li> Hoja infiltración de frasco de vacío: <ol><li> Separe la hoja de la planta en el pecíolo utilizando una hoja de afeitar. </li><li> Enjuague la hoja recién extirpado por inmersión en agua destilada para eliminar contaminantes de la superficie de la hoja. Seque la hoja secando suavemente con papel absorbente. </li><li> Medir el peso de la hoja antes de la infiltración. </li><li> Coloque la hoja (u hojas si infiltrarse múltiples hojas) en un 250 ml o más grande lado frasco brazo containing agua destilada (otros fluidos de infiltración se pueden usar, véase la discusión). Cubrir la totalidad de las hojas con el líquido. </li><li> Aplicar un vacío en el matraz. Agitar suavemente para liberar las burbujas de aire de las hojas. Con cuidado y lentamente liberar el vacío. NOTA: liberar el vacío rápidamente puede resultar en la lisis celular y la contaminación citoplasmática. </li><li> Repita el paso 1.3.5 hasta que la hoja está completamente infiltrada, como se ve por el color oscuro de las zonas infiltradas. </li><li> Retire la hoja del matraz. Suavemente pero a fondo secar la hoja con papel absorbente para eliminar el líquido de la superficie. </li><li> Medir el peso de la hoja infiltrada. Calcular la diferencia de peso antes y después de la infiltración que se aproxima estrechamente el volumen de infiltración. </li></ol></li><li> Recuperación de AWF por centrifugación: <ol><li> Coloque la hoja en un pedazo de 4 pulgadas (10 cm) de ancho Parafilm. Con una punta de pipeta de 5 ml (o un objeto de tamaño similar),enrollar la hoja dentro del Parafilm. </li><li> Inserte la hoja enrollada con punta de la pipeta en una jeringa de 20 ml. Coloque los bordes de las hojas de corte hacia arriba. Inserte la jeringa en un tubo de polietileno o policarbonato 50 ml limpio. </li><li> Centrifugar la jeringa dentro del tubo durante 10 min a 1.000 xg en un rotor de cubeta oscilante a 4 ° C. NOTA: El examen visual de las hojas después de la centrifugación debe revelar que la mayoría de la infiltración de fluido ha sido expulsado. Manchas verdes más oscuros indican que se requiere tiempo de centrifugación adicional. </li><li> Pipetear la AWF recuperado en fresco tubos de 1,5 ml. NOTA: El volumen de AWF debe coincidir aproximadamente con el volumen de infiltración para que la hoja; si el volumen es menos tiempo de centrifugación adicional o se requiere velocidad de centrifugación. </li><li> Centrifugar las muestras AWF a 15.000 xg durante 5 min para eliminar cualquier célula o materia particulada. Alternativamente, pasar la AWF a través de un filtro de 0,22 micras a remocinco células y partículas. </li><li> Pipetear el sobrenadante a un tubo nuevo. Mantener las muestras en hielo hasta el almacenamiento. </li><li> Almacenar las muestras AWF a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Los ensayos para la contaminación citoplasmática <ol><li> Mantener las muestras AWF en hielo para minimizar las reacciones enzimáticas (por ejemplo, proteólisis) y llevar a cabo los ensayos inmediatamente después de las etapas de centrifugación se han completado. NOTA: Para los ensayos de metabolitos, las muestras se pueden congelar inmediatamente después de la extracción y se almacenan a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Para una malato deshidrogenasa estándar (MDH) protocolo de ensayo ver 15; de otro modo utilizar un kit de ensayo comercialmente disponible MDH. </li><li> Para una deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato estándar (G6PDH) protocolo de ensayo ver 16; de lo contrario utilizar un kit de ensayo de G6PDH disponible comercialmente. </li><li> Para la cuantificación de metabolitos citoplasmáticos tales como glucosa-6-fosfato (G-6-P) utilizar GC-MS como se describe en el paso 5 </strong&gt;. De lo contrario, utilice un kit disponible comercialmente para el ensayo directo de G-6-P. </li></ol> 3. Cálculo del factor de dilución apoplasto <ol><li> Preparar dos volúmenes de fluido de infiltración utilizado anteriormente en la etapa 1.2.4 o 1.3.4 (por ejemplo, agua destilada). Añadir polvo de carmín de índigo a una solución a una concentración final de 50 mM, añadir nada a la otra. </li><li> Medir la absorbancia a 610 nm (OD 610) de 200 l de la solución de infiltración índigo carmín con un lector de placas. Corrija este valor restando el OD 610 de 200 l de solución de infiltración sin índigo carmín. Sustituir este valor corregido como OD 610infiltrate en la ecuación a continuación. </li><li> Realizar al menos tres infiltraciones de hoja de replicar como anteriormente (paso 1.2 o 1.3) con ambas soluciones de infiltración (con y sin índigo carmín). </li><li> Después de la infiltración, rinse las hojas en agua destilada para eliminar cualquier resto de carmín de índigo presente en las superficies exteriores. </li><li> Proceda con centrifugación como anteriormente (paso 1.4). </li><li> Determinar la densidad óptica promedio 610 de 200 l de las extracciones de AWF índigo carmín. Corrija este valor restando el valor medio de DO 610 de 200 l de índigo carmín libre AWF. Sustituir este valor corregido como OD 610AWF en la ecuación a continuación. </li><li> Calcular el factor de dilución (es decir, doble dilución) a partir de los valores de absorbancia corregida como: Apoplasto factor de dilución = OD 610infiltrate / (610infiltrate OD - OD 610AWF) </li><li> Concentración o actividad Multiplique los valores de AWF por el factor de dilución para estimar la concentración / actividad en el líquido apoplástico in planta. </li></ol> 4. Concentración de AWF de Resistencia Total por liofilización <ol><li> Encienda el liofilizador y unllow que se estabilice a la temperatura y presión de trabajo. </li><li> Aunar la cantidad deseada de muestras AWF frescos o almacenados. </li><li> Distribuir las muestras de manera uniforme entre 2 tubos ml de centrífuga. </li><li> Determinar el volumen de la reconstitución: El volumen de reconstitución = volumen antes de factor de dilución de liofilización / apoplasto </li><li> Con los párpados cerrados, congelar los tubos en nitrógeno líquido. </li><li> Transfiera los tubos congelados a uno o más vasos de liofilización refrigerados. Si bien la transferencia de los tubos, reemplace la tapa con una que ha sido perforado con un objeto afilado para permitir el intercambio de gases. </li><li> Coloque los vasos al liofilizador y liofilizar las muestras completamente. </li><li> Retire las muestras de la máquina y reconstituir el AWF añadiendo la cantidad calculada de agua destilada. </li><li> Vuelva a colocar la tapa no perforada y almacenar las muestras a -80 ° C. </li></ol> 5. Análisis de metabolitos por cromatografía de gases espectrometría de masas 17 &lt;ol&gt; <li> Pipeta 200 l de AWF en un tubo de 1,5 ml </li><li> Añadir 700 l de metanol que contiene 10 mg / ml ribitol como patrón interno. </li><li> Se calienta a 70 ° C durante 10 min. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 11.000 x g. </li><li> Transferir 700 l de sobrenadante a un tubo de 1,5 ml frescos. </li><li> Añadir 375 l de cloroformo frío y agitar durante 10 seg. </li><li> Añadir 500 l de dH 2 O y agitar durante 10 segundos. </li><li> Centrifugar durante 15 min a 2200 x g. </li><li> Transferir 150 l de la capa acuosa superior a un nuevo tubo de 1,5 ml, a continuación, secar las muestras completamente en un concentrador de vacío sin calor. </li><li> Disolver las muestras en 30 l de piridina que contienen 20 mg / ml de clorhidrato de metoxiamina. </li><li> Incubar a 70 ° C mientras se agita vigorosamente durante 2 hr. </li><li> Añadir 50 l de MSTFA (N-metil-N- (trimetilsilil) trifluoroacetamida). </li><li> Incubar a 37 ° C mientras se agitaba durante 30 min. </li><li> Transferir las muestras de GC-MS borradorviales de vidrio atible. </li><li> Realizar análisis de GC-MS de las muestras. Consulte Lisec et al. 2009 17, para obtener detalles sobre la configuración del equipo GC-MS y el rendimiento. </li></ol>

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No se declaran conflictos de intereses.

Optimización de la fuente de tejido de la planta La variación biológica y técnica puede ser grande cuando se realiza apoplasto extracciones, por lo tanto un flujo de trabajo altamente estandarizado es útil para aumentar la continuidad a través de experimentos (Figura 1). Es importante destacar que la fuente de tejido de la planta debe ser estandarizada, incluyendo el tipo de hoja, edad de la hoja, de crecimiento / condiciones ambientales y hora del día (Tabla 1). Existen grandes diferencias en la facilidad con que las diferentes hojas están infiltrados y, posteriormente, la AWF recuperaron por centrifugación; estas diferencias se correlacionan con el número de estomas, tamaño de la abertura y la resistencia mesófilo 12,14. Incluso entre los diferentes cultivares de P. vulgaris hay grandes diferencias en la facilidad y el rendimiento del procedimiento de extracción AWF; por ejemplo, las hojas de la variedad Tendergreen utilizado aquí son más susceptibles a la extracción AWF utilizando este método que el cultivar Canadian Wonder. DentroP. vulgaris las primeras hojas verdaderas son los más grandes y los más fáciles de infiltrar, lo que la elección obvia para extracciones apoplásticas. El volumen de aire y agua apoplástico se ha demostrado que varían con la edad de la hoja en varias especies que conducen a diferencias en AWF de extracción 12,14. En P. vulgaris, las hojas más viejas se vuelven mucho más difícil de infiltrar y rendir menos AWF la centrifugación; Por lo tanto, las hojas se cosecharon cuando alcanzaron plena expansión. Las hojas que son difíciles de infiltrar exigir posteriormente velocidades de centrifugación más altos para recuperar la AWF. Por ello se debería examinar cuidadosamente varios tipos de hojas diferentes y variedades antes de decidir sobre una fuente de tejido para las extracciones AWF gran escala. Las condiciones de crecimiento de la planta también deben normalizarse tanto como sea posible en el contexto del experimento. El uso de cámaras de cultivo es preferible, ya que permiten la humedad constante, la temperatura y lighregimientos t intensidad que se mantenga. La recolección de hojas siempre debe ocurrir en el mismo momento del día porque las concentraciones de metabolitos, enzimas, etc. varían durante el ciclo diurno 14. Por último, para asegurar que la planta deja todos tienen la presión de turgencia similares, las plantas deben regarse poco antes (~ 1 h) de la cosecha. Optimización de la infiltración de la hoja y centrifugación Contaminación citoplasmática indeseable de la AWF debido a la lisis celular parcial resultará si el estrés mecánico encontrado por las células es demasiado alta durante los pasos de infiltración o centrifugación. Por lo tanto, el procedimiento para un tipo dado de la hoja debe ser un equilibrio optimizado entre maximizar el rendimiento y minimizar la contaminación citoplasmática de la AWF. En todos los casos, se debe utilizar la velocidad de centrifugado baja a la que AWF se puede recuperar para evitar una posible rotura mecánica de las células de las hojas. Optimización de la centrifuvelocidad gación debe determinarse empíricamente para cada tipo de hoja por el seguimiento del volumen recuperado y apoplasto la contaminación a través de una gama de velocidades de centrifugación. Se ha observado que las actividades de enzima marcadora, como MDH, G6PDH y la isomerasa de glucosa-fosfato, siguen siendo bajos hasta que una fuerza centrífuga de umbral es superado, por encima del cual estas actividades aumentan rápidamente, presumiblemente debido a las fugas citoplasmática 9,12,14. El uso de Parafilm para el apoyo durante la etapa de centrifugación, como se ha señalado por Baker et al. 2012 11, puede mejorar la eficacia de la extracción AWF y puede minimizar el daño mecánico a la lámina de la hoja causado por plegado excesivo y compresión. Además, el uso de Parafilm mejora la visualización de la hoja después de la centrifugación cuando uno debe examinar la hoja de los daños y la integridad de la extracción AWF. Nouchi 12 describen la optimización de la recuperación AWF de secciones de hojas de arroz corte, que son difficult infiltrarse y requieren velocidades de centrifugado superiores a recoger AWF debido a sus pequeñas aberturas de los estomas. Mejora de la humectación de la superficie de la hoja de arroz, ya sea por remojo previo de las hojas en agua destilada o la adición de un agente tensioactivo para el fluido de infiltración, facilitado el proceso de infiltración. Una velocidad de centrifugado más alta (6.000 xg) también se utilizó durante el seguimiento de la contaminación apoplástico 12. Cuando se utilizan secciones de hoja de corte siempre hay el riesgo de que la contaminación citoplasmática será más prevalente incluso con un lavado extensivo de los sitios de la herida; hojas cortadas únicamente deben utilizarse cuando sea necesario. Para muchos estudios de agua destilada se utiliza como fluido de infiltración 11. Sin embargo, los compuestos se pueden añadir al fluido de infiltración, tales como sales o tampones, para mejorar la extracción de ciertos compuestos apoplásticas, especialmente proteínas 13. Lohaus 14 evaluó el efecto de la fuerza iónica y osmótica on la composición de la AWF recuperado y los encontró a ser insignificante. Los cambios en el pH del medio de infiltración, sin embargo, pueden afectar a la composición AWF 14. El manejo adecuado y el almacenamiento del fluido apoplástico extraído es importante. AWF se ha demostrado que contienen una abundancia de proteasas y otras enzimas 13,20, así como compuestos orgánicos volátiles. Por lo tanto, para reducir los cambios en la composición de AWF después de la recuperación, se recomienda mantener las muestras en hielo o almacenados a -80 ° C. Además, los ensayos enzimáticos de AWF se debe realizar lo más pronto posible después de la extracción para limitar la inactivación de la enzima debido a la proteolisis, dilución prolongado o congelación-descongelación. El proceso de infiltración diluye el líquido apoplástico y a menudo es necesario para determinar el alcance de esta dilución. La etapa de centrifugación también puede diluir la AWF con agua de los compartimientos intracelulares. Se necesita un factor de dilucióned para estimar in vivo apoplasto concentraciones químicas en cuando las mediciones se hacen en AWF. También se necesita un factor de dilución para concentrar AWF de nuevo a plena potencia cuando está siendo usado como un apoplasto imitando medio de crecimiento para los microbios - juego tanto en las concentraciones de metabolitos in vivo con la mayor precisión posible. Existen varias variaciones en el método descrito en el paso 4 para determinar el factor de dilución AWF mediante la medición de la dilución de un compuesto marcador añadido al fluido de infiltración. Para todos los métodos de dilución AWF el cálculo asume que el fluido de infiltración no está apreciablemente absorbe o se diluirá con las células de las hojas durante el proceso de recuperación AWF. Esta hipótesis ha sido verificada previamente para el paso de infiltración 14 pero no está verificado por la etapa de centrifugación. El compuesto marcador tampoco debe ser absorbida, transportada o mientras modificado en el apoplasto. Indigo carmín es el más utilizado y probado a fondo de los colorantes utilizadospara los cálculos de dilución AWF. Indigo carmín muestra una absorbancia baja a la resina de intercambio catiónico y las paredes celulares aisladas y ha demostrado ser adecuado para los cálculos AWF en Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum y Glycine max 11,21,22. Sin embargo, en algunos tipos de hojas, por ejemplo, el arroz y el pepino, índigo carmín parecía no ser recuperado totalmente después de la infiltración, lo que llevaría a una subestimación del factor de dilución AWF 12,21. La falta de recuperación de índigo carmín puede ser debido a su susceptibilidad a la escisión en sulfonato de isatina por superóxido 23, que se sabe que se produce en el apoplasto, especialmente bajo estrés 24. La escisión de índigo carmín en sulfonato de isatina se traducirá en una pérdida de absorbancia a 610 nm y un incremento a 245 nm. Si esta reacción se produce en una medida apreciable en el apoplasto, o si esta reacción puede ser inhibida por la adición de eliminadores de superóxido para infiltratlíquido iónico no se ha investigado hasta la fecha. Azul de dextrano se ha usado en lugar de índigo carmín para la cuantificación del factor de dilución AWF en el arroz hojas 12, aunque no se ha informado de su estabilidad y recuperación de la AWF. Alternativamente, los compuestos radiomarcados tales como [14 C] de sorbitol u otros estándares internos cuantificables se pueden utilizar en lugar de colorantes y la disminución de la radiactividad o la concentración mide y se utiliza para calcular el factor de dilución de una manera análoga 11,14,25. Limitaciones de la técnica Existen algunas advertencias para el método de aislamiento AWF infiltración-centrifugación. En primer lugar, la dilución de la apoplasto durante la infiltración puede obtener una respuesta de la planta. Si las células de las hojas que rodean detectan una concentración disminuida para ciertos componentes del fluido apoplástica, pueden responder mediante la excreción de metabolitos adicionales, distorsionando la interpretación de las concentraciones de metabolitos. Ense observó una evaluación de este problema que ni el tiempo entre la infiltración y la centrifugación ni diferencias moderadas en la fuerza iónica del fluido de infiltración afectó a la composición de la AWF extraída 14,22. Por lo tanto, los artefactos resultantes de apoplasto se cree dilución para ser mínimo. Una segunda desventaja potencial es que la elución de AWF por centrifugación no captura todas las moléculas presentes en el apoplasto por varias razones. Algunos compuestos, en cationes y proteínas particulares pueden estar estrechamente asociados con la pared celular cargada negativamente, y no se eluyen con la AWF 13. Otras moléculas tales como proteínas pueden ser demasiado grandes para eluir eficientemente fuera de la apoplasto a las velocidades de centrifugación utilizados 14. Especies de oxígeno reactivas son una clase importante de compuesto producido en el apoplasto, pero debido a la naturaleza de corta duración de estos compuestos, y los requisitos especificados para su producción, su presencia no está bien capturado por extracción AWF. No se sabe con qué precisión AWF representa la composición in vivo del fluido apoplasto y esto puede variar entre las especies. Existen varios ensayos para determinar la contaminación citoplasmática, aunque ninguno es universalmente aceptada. Los ensayos de enzimas citoplasmáticas predominantemente (por ejemplo, G6PDH, fosfato isomerasa de hexosa, MDH) tienen la ventaja de ser fácil de realizar, pero puede no correlacionarse bien con fugas citoplasmática 14,18. La evaluación de los metabolitos citoplasmáticos (por ejemplo, fosfatos de hexosa, clorofila) es quizás más indicativo pero no está bien establecida 11. Sin embargo, cualquier tipo de ensayo puede ser útil para la cuantificación relativa de contaminación entre muestras apoplástico. Idealmente, múltiples mediciones independientes deben ser utilizados para validar la integridad de la muestra AWF. Si bien reconocen sus limitaciones, la infiltración-centrifugatien técnica descrita aquí sigue siendo una técnica sencilla y robusta en el estudio de las proteínas apoplásticas, metabolitos primarios y secundarios e iones inorgánicos.

<html> El apoplasto de la planta es el espacio intercelular que rodea a las células vegetales. Este es un entorno dinámico en el que muchos de los procesos metabólicos y de transporte tienen lugar. El principal componente estructural de la apoplasto es la pared celular, que se monta y modificado por enzimas, proteínas estructurales y metabolitos situados dentro de la apoplasto. En las células vegetales saludables apoplasto se mantiene generalmente en un estado de acidez permite aminoácidos, azúcares y otros nutrientes para ser importados desde el apoplasto al citoplasma por H + symport 1. Durante el transporte de sacarosa, se mueve de sacarosa a partir de fuentes fotosintéticos a través del apoplasto y en la vasculatura del floema; a continuación, la sacarosa es transportada por un potencial osmótico mantenido por invertasas apoplásticas de escisión de sacarosa en los órganos del fregadero 2. Los azúcares y otros nutrientes también pueden ser transportados hacia arriba y se acumulan en las cavidades de los estomas a través de la corriente de transpiración 3. &quot;&gt; El apoplasto también representa un nicho ambiental donde muchos patógenos establecen su estilo de vida parasitaria. Patógenos bacterianos de plantas tienen la capacidad de multiplicarse a altas densidades en el apoplasto, que acceden a través de las aberturas naturales tales como estomas o a través de heridas 4. La concentración de amino ácidos y otros compuestos de nitrógeno en tomate apoplasto han demostrado ser suficiente para soportar los requisitos nutricionales de los patógenos bacterianos y fúngicos 5,6. respuestas de defensa primarios hacia patógenos microbianos también se producen en el apoplasto, a saber, la producción de especies reactivas del oxígeno por peroxidasas extracelulares . y oxidasas y el fortalecimiento de la pared celular a través de la reticulación y callosa deposición 7 La pared celular vegetal es rica en metabolitos secundarios con actividad anti-microbianas, la naturaleza bioquímica de estos metabolitos secundarios varía entre las especies 8. Como resultado de la mención anteriormenteed y otros procesos, el líquido apoplástico hoja contiene una variedad de proteínas, azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, metabolitos secundarios, metales y otros cationes (por ejemplo, Mg 2+, K +, Na +, Ca 2+, Fe 2/3 +). Concentraciones de soluto en el apoplasto de brotes se controlan en gran medida por el equilibrio de los procesos de transporte que ocurren entre el apoplasto y el xilema, floema y el citoplasma 9. Sin embargo, las reacciones metabólicas y el crecimiento microbiano también consumen o producen solutos apoplásticas. La composición del apoplasto se sabe que difieren entre las especies de plantas y genotipos y en respuesta a las cambiantes condiciones ambientales, incluyendo la luz, la nutrición y bióticos y abióticos 9. Mediante el estudio de la composición de la apoplasto y cómo cambia, incluyendo propiedades tales como redox y el potencial osmótico, pH, nutrientes / disponibilidad metabolito y las actividades enzimáticas, se puede obtener nuevos conocimientos sobre cómo las plantas reresponden a su entorno. Comprensión o caracterizar los cambios moleculares que se producen en la solución apoplasto se complica debido a que es un compartimiento espacialmente estructurado y dinámico en el que los metabolitos y / o iones pueden ser volátiles, transitoria o asociado con la pared celular y la membrana plasmática. Además, se requieren diferentes técnicas analíticas para cubrir la gama de diferentes tipos químicos. Para estudiar la composición de la apoplasto soluble, líquido usualmente necesita ser extraído del tejido. Existen varios métodos para extraer fluido apoplasto de diversos tejidos, incluyendo un método de la tira de filtro nueva propuesta de 10, pero el método de extracción más establecido para las hojas es la infiltración-centrifugación. Esta técnica ha sido evaluada previamente 11-13 y Lohaus et al. 2001 14 proporcionar un examen a fondo de muchos de los parámetros técnicos del método. Como implica el nombre, la infiltración-centrifugación técnica es un método de dos etapas que implica esencialmente la sustitución del espacio de aire apoplástico con un fluido de infiltración acuosa, que se mezcla con el líquido apoplástico nativo, seguido de la recuperación de la mezcla de fluido de infiltración / apoplástico por centrifugación suave de las hojas. Como se diluye el líquido recuperado y no contiene todos los compuestos presentes en el apoplasto (véase más adelante), este líquido se conoce comúnmente como apoplasto fluido de lavado (AWF), o fluido de lavado intercelular veces, en lugar de líquido apoplástico. La técnica de infiltración-centrifugación es fácilmente escalable que permite muestras individuales o agrupados AWF de volumen adecuado que se generen y se sometieron a una amplia gama de técnicas analíticas bioquímicas y aguas abajo (por ejemplo, la electroforesis de proteínas, la medición de la actividad enzimática, RMN, muchos tipos de cromatografía y la masa espectrometría). Hoja AWF también es útil como un apoplasto imitando medio de crecimiento para el estudio de la interacción de colonizar la planta microbios ingenioh su entorno 5. En los siguientes protocolos se describe cómo realizar la técnica de infiltración-centrifugación utilizando Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen hojas, y proporcionar algunos ejemplos de análisis posteriores con un enfoque en la metabolómica. Es importante destacar que los métodos para evaluar la calidad de AWF se proporcionan junto con consejos para optimizar el procedimiento para diferentes tipos de hojas.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga Eppendorf</td> Hoja <td></td> de afeitar <td>Eppendorf</td> 22364111 <td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td></td><td>12-640&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 60 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 20 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>parafilm de 4 pulgadas</td><td>Matraz</td> de brazo lateral Bemis <td>PM-996</td><td></td>Fuente de</tr> vacío <tr><td></td><td>SciLabware</td><td>12972831</td><td></td></tr><tr><td>puntas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>de<td>pipeta de 5 ml Fisher</td><td></td><td>50-813-28&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de cangilón oscilante</td><td>Beckman Coulter</td><td>369702</td><td></td></tr><tr><td>añil carmín</td><td>Sigma</td><td>I8130</td><td></td></tr><tr><td>lector de microplacas</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200</td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>liofilizador</td><td>SciQuip</td><td>Christ Microcentrífuga Alpha 2-4 LD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>biorad</td><td>166-0612EDU</td><td></td></tr><tr><td>ácido oxaloacético</td><td>Sigma</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa-6-fosfato</td><td>Sigma</td><td>G7250</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10128023001</td><td></td></tr><tr><td>MDH kit de ensayo</td><td>Biovision</td><td>K654-100</td><td></td></tr><tr><td>G6PDH kit de ensayo</td><td>Sigma</td><td>MAK015-1KT</td><td></td></tr><tr><td>kit de ensayo G-6-P</td><td>Biovision</td><td>K657-100</td><td></td></tr><tr><td>ribitol</td><td>Sigma</td><td>A5502</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>cloroformo</td><td>Sigma 472476</td><td></td><td></td></tr><tr><td>concentrador de vacío</td><td>Thermor Scientific</td><td>SC250EXP</td><td></td></tr><tr><td>clorhidrato de metoxiamina</td><td>Sigma</td><td>226904</td><td></td></tr><tr><td>N-metil-N-(trimetilsilil) trifluoroacetamida</td><td>Sigma</td><td>394866</td><td></td></tr></tbody></table>

la técnica de infiltración-centrifugación para extracción de apoplástico fluido procedente de hojas de la planta uso phaseolus vulgaris como ejemplo

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

El apoplasto es un compartimento extracelular distinta en los tejidos de la planta que se encuentra fuera de la membrana plasmática y la pared celular incluye. El compartimiento apoplástico de hojas de la planta es el sitio de varios procesos biológicos importantes, incluyendo la formación de la pared celular, nutriente celular y la absorción de agua y de las exportaciones, las interacciones planta-endófitos y respuestas de defensa frente a patógenos. El método de infiltración-centrifugación está bien establecida como una técnica robusta para el análisis de la composición apoplasto soluble de varias especies de plantas. El fluido obtenido por este método se conoce comúnmente como apoplasto fluido de lavado (AWF). El siguiente protocolo describe un método de infiltración de vacío y centrifugación optimizada para la extracción de Phaseolus vulgaris AWF (habichuela) cv. Tendergreen hojas. Se discuten las limitaciones de este método y la optimización del protocolo para otras especies de plantas. AWF recuperado se puede utilizar en una amplia gama de aguas abajo experiments que tratan de caracterizar la composición del apoplasto y cómo varía en respuesta a las especies de plantas y genotipo, desarrollo de la planta y las condiciones ambientales, o para determinar cómo los microorganismos crecen en apoplasto fluidos y responden a los cambios en su composición.

Los resultados típicos para extracciones realizadas en AWF saludable de 3 semanas P. vulgaris cv. Tendergreen hojas, utilizando agua destilada como fluido de infiltración se muestran en la Tabla 2. Joven P. hojas vulgaris son susceptibles a la infiltración, y a la velocidad de centrifugación utilizado aquí (1.000 xg) la eliminación de la mayoría de fluido de infiltración por centrifugación se pueden ver directamente como las hojas vuelven a su color original verde. P. hoja vulgaris peso fresco fue en promedio de 1.1 xg antes de la infiltración y cedió 0,5 ml de AWF por gramo de peso fresco. La concentración de proteína de la AWF se determinó que era 0,18 ± 0,08 mg / ml utilizando un ensayo de proteínas Bradford estándar. El factor de dilución de estas hojas, calculados mediante la medición de la dilución índigo carmín, fue de 2,3 ± 0,3 veces. Los valores anteriores pueden variar sustancialmente entre las especies y los proyectos piloto son necesarios para determinar el rendimiento de AWF por gramo de hoja que frescoight, así como la concentración de proteína AWF y el factor de dilución que se puede esperar para un tipo de hoja determinado. El daño a la integridad de las células puede ocurrir tanto durante la etapa de infiltración, si los cambios en la presión son demasiado rápida, y durante la etapa de centrifugación, si la fuerza centrífuga es demasiado alta. Por lo tanto, es necesario para someter a ensayo muestras AWF para los marcadores de contaminación citoplasmática; idealmente, se realizan varios ensayos independientes. Aquí, los resultados de tres ensayos posibles se presentan en la Tabla 2. En extracciones bien realizados de P. vulgaris AWF, G6PDH era indetectable por un ensayo enzimático estándar. Esto es consistente con otros informes donde la actividad G6PDH se vuelve detectable sólo por encima de una fuerza centrífuga umbral de 12. En contraste, un nivel basal de actividad de la malato deshidrogenasa (2,5 U / ml) fue detectable en todos P. muestras vulgaris AWF utilizando un ensayo metabólico estándar. El aumento de la centrífuga parace encima de un umbral de 1.000 xg resultó en aumento de las actividades de MDH (resultados no mostrados). Como se sabe que el apoplasto de otras especies para contener la actividad endógena MDH 18, la cantidad detectada aquí se considera verdadera actividad apoplástico y aumentos significativos por encima de este nivel de referencia son indicativos de contaminación. Los metabolitos que se cree que son predominantemente citoplasmática, tales como hexosa-6-fosfatos, también se pueden utilizar para evaluar la contaminación de AWF. Aquí, el análisis GC-MS detecta cero o traza niveles de G-6-P en extracciones AWF. Por el contrario, en las secciones de raíz de maíz corte, G-6-P se detectó después de la extracción AWF a todas las velocidades de centrifugación y el aumento en la concentración a velocidades más altas, lo que indica la contaminación citoplasmática 10. El análisis de metabolitos por GC-MS de P. vulgaris hoja AWF produce típicamente 40-60 metabolitos identificables y un número aproximadamente igual de compuestos no identificados (Figura 2). Oácidos inorgá-, azúcares simples y aminoácidos representan la mayor parte de los metabolitos identificables, sin embargo, los metabolitos secundarios de las plantas también se han detectado y cuantificado de AWF 11. Varios picos ejemplo de estas diferentes clases de moléculas están etiquetados en la figura 2 Otras técnicas analíticas aguas abajo son aplicables a estas muestras AWF para cuantificar diversas moléculas, por ejemplo:. ICP-MS, RMN, HPLC, espectroscopía de absorción atómica, espectrometría de masas de proteínas. El componente proteico de la apoplasto también está representado en el AWF como se muestra en la Brilliant gel azul manchado SDS-PAGE Coomassie en la Figura 3. Entre otras funciones, las enzimas apoplásticas son responsables de la síntesis de la pared celular y la creación de reactivo extracelular especies de oxígeno. Los estudios proteómicos de AWF de varias especies se han identificado docenas de proteínas individuales y demostrado que el componente de proteína del apoplasto responde a Enviroestrés nmental 13,19. Lo ideal sería que el extracto de AWF debe estar libre de contaminación por proteínas citoplasmáticas como Rubisco; Sin embargo en la práctica esto es difícil de lograr. La presencia de una banda de proteína Rubisco a ~ 53 kDa tras SDS-PAGE proporciona un ensayo cualitativo más para la integridad de las muestras AWF. Por ejemplo, la muestra cargada en el carril 2 en la figura 3 contiene una mayor cantidad de contaminación que Rubisco de carril 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Phaseolus vulgaris AWF </td></tr><tr><td> Volumen de AWF (ml g -1 hoja FW) </td><td> 0.49 ± 0.09 </td></tr><tr><td> Conc proteína. (Mg ml -1) </td><td> 0.18 ± 0.08 </td></tr><tr><td> Factor de dilución </td><td> 2,3 ± 0,3 </td></tr><tr><td> Actividad G6PDH (U ml -1) </td><td no detectado></td></tr><tr><td> Glc-6-P (mg ml -1) </td><td> ninguno detectado </td></tr><tr><td> Actividad MDH (U ml -1) </td><td> 2,5 ± 0,9 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Los resultados típicos para extracciones AWF de P. vulgaris cv. Tendergreen hojas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig1highres.jpg"> Figura 1. Las tareas de extracción apoplasto estándar. Los números se refieren a los pasos en el protocolo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig2highres.jpg"> Figura 2. Un ejemplo GC-MS cromatograma de P. Vulgaris cv. . Tendergreen AWF Los picos de metabolitos ejemplo numeradas son: 1-malonato, 2-fosfato, 3-succinato, 4-desconocido, 5-malato, 6-asparagina, 7-ribitol (st internaandard), 8-citrato, 9-glucosa, 10-inositol, ácido 11-cafeico, 12-sacarosa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig3highres.jpg" width="250"> Figura 3. Un ejemplo SDS-PAGE gel teñido con Coomassie de P. Vulgaris extractos de hoja de AWF. Este gel proporciona una comparación entre los componentes proteicos de dos extracciones AWF que difieren en la cantidad de contaminación citoplasmática por la abundante enzima Rubisco plastidial. Después de la extracción AWF ambas muestras se sometieron a la precipitación de proteínas acetona en un exceso de 4 veces (v / v) de acetona fría y resolubilized en agua a un décimo del volumen original. Los carriles 1 y 2 contienen 40 g de proteína. La banda correspondiente a la cadena de gran Rubisco (~ 53 kDa) se indica mediante una flecha. M r: proteína de marcadores de peso molecular.

Este protocolo detalla la extracción optimizada del fluido de lavado de apoplasto de las hojas de las plantas, utilizando plantas de frijol francés (Phaseolus vulgaris) como ejemplo modelo.

La técnica de infiltración-centrifugación para extracción de apoplástico fluido procedente de hojas de la planta Uso Phaseolus vulgaris Como ejemplo

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

El objetivo de este procedimiento es demostrar la extracción de fluido aplástico de las hojas de las plantas mediante la técnica de centrifugación por infiltración. Esto se logra sumergiendo primero una hoja en el líquido de infiltración y utilizando las diferencias de presión generadas con una jeringa o una bomba de vacío para infiltrarla completamente. El segundo paso es preparar la hoja que se va a centrifugar con un aparato de soporte.A continuación, la hoja se centrifuga suavemente para obtener el líquido de lavado APO plast. El paso final es determinar el factor de dilución de APO plast y analizar la calidad del fluido de lavado alast. En última instancia, el ensayo de centrifugación por infiltración se utiliza para obtener muestras representativas de plast APO que se pueden utilizar para una variedad de análisis posteriores.La principal ventaja de esta técnica con respecto a otros métodos existentes es que es fácil de optimizar para una variedad de tipos de hojas con el fin de obtener muestras superiores que tengan una contaminación mínima con compuestos citoplasmáticos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en campos como la fisiología de las plantas y las interacciones de los microbios de las plantas, donde es importante comprender cómo varía la composición de los APL entre las plantas y cómo cambia bajo diferentes condiciones fisiológicas o estreses. Como primer paso, tome precauciones de seguridad usando una bata de laboratorio, guantes y reglas de gafas.A continuación, prepare un volumen de agua destilada en el que sumergir la muestra de hojas. Tenga una hoja de afeitar lista para recolectar una muestra, en este caso, una hoja del cultivar de frijol verde tierno. Coloque la hoja de afeitar contra la mascota de una hoja y adhiera la hoja de la planta.Una vez recolectada, sumerja la hoja recién extirpada en agua destilada para eliminar los contaminantes de la superficie de la hoja. Luego, use un pañuelo absorbente o papel para bloquear suavemente el secado de la hoja. Mida el peso de la hoja antes de proceder con la infiltración.Esto ayudará más adelante a aproximar el volumen de infiltración. Inicie el proceso de infiltración con una jeringa de 60 mililitros. Con el émbolo retirado, enrolle o doble con cuidado la hoja en la jeringa.A continuación, llene la jeringa con líquido de infiltración. Aquí, se utiliza agua destilada. Inserte el émbolo e invierta la jeringa para expulsar el aire que contiene.Fíjate en el color de la hoja para una comparación posterior. Mueva el émbolo a la marca de 40 mililitros con un pequeño trozo de param. Cubra la punta de la jeringa.Luego tire del émbolo hasta la marca de 60 mililitros para crear presión negativa. Invierta la jeringa para liberar las burbujas de aire de la superficie de la hoja. Regrese lentamente el émbolo a la posición inicial durante unos dos segundos.Destape la punta de la jeringa y expulse el aire. A continuación, vuelva a cubrir la punta y presione el émbolo para crear una cantidad modesta de presión positiva. Continúe aplicando presión negativa expulsando aire y aplicando presión positiva hasta que la hoja esté completamente infiltrada.La evidencia de infiltración completa es el color oscurecido de las áreas infiltradas. Una vez que vea esto, retire la hoja de la jeringa. Bloquee suavemente la hoja con papel absorbente para eliminar el líquido de la superficie.A continuación, mida el peso de la hoja infiltrada, y un método de infiltración alternativo utiliza un matraz de vacío. Nuevamente, recoja una hoja y enjuáguela con agua destilada. Después de secarlo, mida el peso de la hoja.Obtenga un matraz de brazo con una capacidad mínima de 250 mililitros. Coloque la hoja en el matraz y cúbralo con agua destilada. A continuación, coloque un tapón en el matraz y conecte una bomba de vacío al brazo lateral.Aplique un vacío al matraz el tiempo suficiente para lograr una presión. Aproximadamente 650 milímetros de mercurio. Agite suavemente el matraz para liberar las burbujas de aire de la hoja mientras está bajo presión reducida.Luego, suelte el vacío con cuidado y lentamente en el transcurso de unos 10 segundos. Repita el proceso de aplicar una aspiradora, agitar el matraz y soltar el vacío hasta que la hoja esté completamente infiltrada. La evidencia de infiltración completa es el color oscurecido de las áreas infiltradas.Retire la hoja completamente infiltrada del matraz y seque suavemente la hoja con papel absorbente. Para eliminar el líquido de la superficie, mida el peso de la hoja infiltrada para permitir la determinación del volumen aproximado de infiltración. Después de que una hoja se haya infiltrado por completo, prepárela para la centrifugación.Coloque un trozo de película para de cuatro pulgadas de ancho. Coloque la hoja en la película para. A continuación, con una punta de pipeta de cinco mililitros, enrolle la hoja en la película para.Tome un cuerpo de jeringa de 20 mililitros con el émbolo retirado e inserte la hoja enrollada con la punta de la pipeta. Coloque los bordes de las hojas cortadas y hacia el extremo del émbolo. Consigue un tubo de polietileno o policarbonato de 50 mililitros e inserta la jeringa en él.Emplee una centrífuga con un rotor de cangilón oscilante. Cargue el tubo que contiene la hoja infiltrada y la centrífuga de cuatro grados centígrados y 1000 G durante 10 minutos. Después de la centrifugación, examine la hoja para determinar si la mayor parte del líquido de infiltración ha sido expulsado.El tubo de centrífuga ahora contiene el fluido de lavado APO plast recuperado, continúe pipeteando el fluido de lavado alast recuperado en tubos nuevos de 1,5 mililitros. Coloque las muestras de líquido de lavado APO plast en la centrífuga y gírela a 15.000 g durante cinco minutos para eliminar cualquier célula o partícula. Después de la centrifugación, pipetee el supinato en tubos nuevos.Mantenga las muestras en hielo hasta que se puedan almacenar a menos 80 grados centígrados. Un método para evaluar la calidad del fluido de lavado de la placa APO es calcular el factor de dilución de la plataforma APO. Para hacer esto, prepare dos volúmenes de agua destilada del fluido de infiltración, en este caso, cada uno suficiente para varias infiltraciones en un volumen.Agregue polvo de índigo carmín hasta una concentración final de 50 micromolares. No añadas nada al otro. Obtenga una microplaca de 96 pocillos, llene tres pocillos con 200 microlitros de la solución de infiltración.Con índigo carmín, llene otros tres con 200 microlitros de la solución de infiltración sin adulterar base la microplaca en el lector para medir la absorbancia de cada fluido. A 610 nanómetros, la absorbancia promedio para el fluido con índigo carmín menos el absorbente promedio para el fluido sin da la absorbancia corregida del infiltrado. A continuación, replique el protocolo de infiltración de hojas tres veces para cada una de las soluciones de infiltración.Sumerge una muestra de hoja en agua. Aplique presión negativa y positiva cuando use la solución de infiltración de índigo carmín, enjuague las hojas con agua destilada después de la infiltración para eliminar cualquier resto de carmín índigo de la superficie de la hoja. Recuperar el último fluido de lavado mediante centrifugación.Después de recuperar el líquido de lavado alast, regrese al lector de placas en los pocillos de la microplaca. Se colocaron 200 microlitros de cada una de las extracciones libres de índigo carmín, y también 200 microlitros de cada índigo carmín de extracción de líquido de lavado alast. Mida la absorbancia de las muestras a 610 nanómetros para obtener la absorbancia corregida.Promedie cada conjunto de números y tome la diferencia. Utilice la absorbancia corregida del infiltrado y la absorbancia corregida del fluido de lavado aplástico para determinar el factor de dilución de APL para obtener estimaciones de concentraciones o actividades en el fluido aplástico. El implantador multiplica los valores de concentración o actividad del fluido de lavado alast por el factor de dilución extraído del fluido de lavado alast del cultivar fasi vulgaris.Se utilizó verde tierno para producir estos ácidos orgánicos de espectro de masas por cromatografía de gases. Los azúcares simples y los aminoácidos representan la mayor parte de los metabolitos identificables. Aquí hay una comparación de la página SDS, geles de tinción Kumasi de extractos de hojas de líquido de lavado fasi vulgarus alast.Las extracciones difieren en la cantidad de contaminación citoplasmática. Esto se observa como diferentes cantidades de la enzima rubis del yeso. Al realizar este procedimiento, es importante recordar ser lo más suave posible al menos para evitar causar daño tisular o contaminación citoplasmática después de este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos, como la espectrometría de masas de proteínas o metabolitos, para responder a preguntas adicionales sobre la composición del fluido aplásico. El líquido de lavado aplásico también se puede utilizar como medio macroscópico para estudiar el efecto de los productos químicos aplásicos en los microorganismos que colonizan los tejidos vegetales.

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Investigación

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Biología

Fuente: Rufián, J. S., et al, Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae en el tejido vegetal. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demuestra un método de presión basado en jeringuilla para extraer bacterias apoplásicas, que proliferan y forman microcolonias dentro del apoplasto, el espacio intercelular entre las células vegetales. El método proporciona muestras bacterianas libres de residuos adecuadas para análisis de células individuales posteriores.

Extracción de bacterias apoplásicas usando un método de presión basado en jeringuilla

El conocimiento de la composición de la savia del floema, así como el mecanismo de su transporte de carga y de larga distancia es esencial para la comprensión de la señalización de larga distancia en el desarrollo de la planta y el estrés / respuesta patógeno y de transporte de asimilados. Este manuscrito describe la colección de exudados del floema utilizando el método de EDTA-facilitado.

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Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

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Transitoria expresión heteróloga de enzimas biosintéticas en las hojas de Nicotiana benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno. Es en este documento se describe un protocolo detallado para rápido (5 días) escala de preparativo de triterpenos y análogos utilizando esta potente plataforma basada en plantas.

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La técnica de infiltración-centrifugación para extracción de apoplástico fluido procedente de hojas de la planta Uso Phaseolus vulgaris Como ejemplo (Video) | JoVE Journal

La técnica de infiltración-centrifugación para extracción de apoplástico fluido procedente de hojas de la planta Uso Phaseolus vulgaris Como ejemplo

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