La técnica de infiltración-centrifugación para extracción de apoplástico fluido procedente de hojas de la planta Uso Phaseolus vulgaris Como ejemplo

El objetivo de este procedimiento es demostrar la extracción de fluido aplástico de las hojas de las plantas mediante la técnica de centrifugación por infiltración. Esto se logra sumergiendo primero una hoja en el líquido de infiltración y utilizando las diferencias de presión generadas con una jeringa o una bomba de vacío para infiltrarla completamente. El segundo paso es preparar la hoja que se va a centrifugar con un aparato de soporte.

A continuación, la hoja se centrifuga suavemente para obtener el líquido de lavado APO plast. El paso final es determinar el factor de dilución de APO plast y analizar la calidad del fluido de lavado alast. En última instancia, el ensayo de centrifugación por infiltración se utiliza para obtener muestras representativas de plast APO que se pueden utilizar para una variedad de análisis posteriores.

La principal ventaja de esta técnica con respecto a otros métodos existentes es que es fácil de optimizar para una variedad de tipos de hojas con el fin de obtener muestras superiores que tengan una contaminación mínima con compuestos citoplasmáticos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en campos como la fisiología de las plantas y las interacciones de los microbios de las plantas, donde es importante comprender cómo varía la composición de los APL entre las plantas y cómo cambia bajo diferentes condiciones fisiológicas o estreses. Como primer paso, tome precauciones de seguridad usando una bata de laboratorio, guantes y reglas de gafas.

A continuación, prepare un volumen de agua destilada en el que sumergir la muestra de hojas. Tenga una hoja de afeitar lista para recolectar una muestra, en este caso, una hoja del cultivar de frijol verde tierno. Coloque la hoja de afeitar contra la mascota de una hoja y adhiera la hoja de la planta.

Una vez recolectada, sumerja la hoja recién extirpada en agua destilada para eliminar los contaminantes de la superficie de la hoja. Luego, use un pañuelo absorbente o papel para bloquear suavemente el secado de la hoja. Mida el peso de la hoja antes de proceder con la infiltración.

Esto ayudará más adelante a aproximar el volumen de infiltración. Inicie el proceso de infiltración con una jeringa de 60 mililitros. Con el émbolo retirado, enrolle o doble con cuidado la hoja en la jeringa.

A continuación, llene la jeringa con líquido de infiltración. Aquí, se utiliza agua destilada. Inserte el émbolo e invierta la jeringa para expulsar el aire que contiene.

Fíjate en el color de la hoja para una comparación posterior. Mueva el émbolo a la marca de 40 mililitros con un pequeño trozo de param. Cubra la punta de la jeringa.

Luego tire del émbolo hasta la marca de 60 mililitros para crear presión negativa. Invierta la jeringa para liberar las burbujas de aire de la superficie de la hoja. Regrese lentamente el émbolo a la posición inicial durante unos dos segundos.

Destape la punta de la jeringa y expulse el aire. A continuación, vuelva a cubrir la punta y presione el émbolo para crear una cantidad modesta de presión positiva. Continúe aplicando presión negativa expulsando aire y aplicando presión positiva hasta que la hoja esté completamente infiltrada.

La evidencia de infiltración completa es el color oscurecido de las áreas infiltradas. Una vez que vea esto, retire la hoja de la jeringa. Bloquee suavemente la hoja con papel absorbente para eliminar el líquido de la superficie.

A continuación, mida el peso de la hoja infiltrada, y un método de infiltración alternativo utiliza un matraz de vacío. Nuevamente, recoja una hoja y enjuáguela con agua destilada. Después de secarlo, mida el peso de la hoja.

Obtenga un matraz de brazo con una capacidad mínima de 250 mililitros. Coloque la hoja en el matraz y cúbralo con agua destilada. A continuación, coloque un tapón en el matraz y conecte una bomba de vacío al brazo lateral.

Aplique un vacío al matraz el tiempo suficiente para lograr una presión. Aproximadamente 650 milímetros de mercurio. Agite suavemente el matraz para liberar las burbujas de aire de la hoja mientras está bajo presión reducida.

Luego, suelte el vacío con cuidado y lentamente en el transcurso de unos 10 segundos. Repita el proceso de aplicar una aspiradora, agitar el matraz y soltar el vacío hasta que la hoja esté completamente infiltrada. La evidencia de infiltración completa es el color oscurecido de las áreas infiltradas.

Retire la hoja completamente infiltrada del matraz y seque suavemente la hoja con papel absorbente. Para eliminar el líquido de la superficie, mida el peso de la hoja infiltrada para permitir la determinación del volumen aproximado de infiltración. Después de que una hoja se haya infiltrado por completo, prepárela para la centrifugación.

Coloque un trozo de película para de cuatro pulgadas de ancho. Coloque la hoja en la película para. A continuación, con una punta de pipeta de cinco mililitros, enrolle la hoja en la película para.

Tome un cuerpo de jeringa de 20 mililitros con el émbolo retirado e inserte la hoja enrollada con la punta de la pipeta. Coloque los bordes de las hojas cortadas y hacia el extremo del émbolo. Consigue un tubo de polietileno o policarbonato de 50 mililitros e inserta la jeringa en él.

Emplee una centrífuga con un rotor de cangilón oscilante. Cargue el tubo que contiene la hoja infiltrada y la centrífuga de cuatro grados centígrados y 1000 G durante 10 minutos. Después de la centrifugación, examine la hoja para determinar si la mayor parte del líquido de infiltración ha sido expulsado.

El tubo de centrífuga ahora contiene el fluido de lavado APO plast recuperado, continúe pipeteando el fluido de lavado alast recuperado en tubos nuevos de 1,5 mililitros. Coloque las muestras de líquido de lavado APO plast en la centrífuga y gírela a 15.000 g durante cinco minutos para eliminar cualquier célula o partícula. Después de la centrifugación, pipetee el supinato en tubos nuevos.

Mantenga las muestras en hielo hasta que se puedan almacenar a menos 80 grados centígrados. Un método para evaluar la calidad del fluido de lavado de la placa APO es calcular el factor de dilución de la plataforma APO. Para hacer esto, prepare dos volúmenes de agua destilada del fluido de infiltración, en este caso, cada uno suficiente para varias infiltraciones en un volumen.

Agregue polvo de índigo carmín hasta una concentración final de 50 micromolares. No añadas nada al otro. Obtenga una microplaca de 96 pocillos, llene tres pocillos con 200 microlitros de la solución de infiltración.

Con índigo carmín, llene otros tres con 200 microlitros de la solución de infiltración sin adulterar base la microplaca en el lector para medir la absorbancia de cada fluido. A 610 nanómetros, la absorbancia promedio para el fluido con índigo carmín menos el absorbente promedio para el fluido sin da la absorbancia corregida del infiltrado. A continuación, replique el protocolo de infiltración de hojas tres veces para cada una de las soluciones de infiltración.

Sumerge una muestra de hoja en agua. Aplique presión negativa y positiva cuando use la solución de infiltración de índigo carmín, enjuague las hojas con agua destilada después de la infiltración para eliminar cualquier resto de carmín índigo de la superficie de la hoja. Recuperar el último fluido de lavado mediante centrifugación.

Después de recuperar el líquido de lavado alast, regrese al lector de placas en los pocillos de la microplaca. Se colocaron 200 microlitros de cada una de las extracciones libres de índigo carmín, y también 200 microlitros de cada índigo carmín de extracción de líquido de lavado alast. Mida la absorbancia de las muestras a 610 nanómetros para obtener la absorbancia corregida.

Promedie cada conjunto de números y tome la diferencia. Utilice la absorbancia corregida del infiltrado y la absorbancia corregida del fluido de lavado aplástico para determinar el factor de dilución de APL para obtener estimaciones de concentraciones o actividades en el fluido aplástico. El implantador multiplica los valores de concentración o actividad del fluido de lavado alast por el factor de dilución extraído del fluido de lavado alast del cultivar fasi vulgaris.

Se utilizó verde tierno para producir estos ácidos orgánicos de espectro de masas por cromatografía de gases. Los azúcares simples y los aminoácidos representan la mayor parte de los metabolitos identificables. Aquí hay una comparación de la página SDS, geles de tinción Kumasi de extractos de hojas de líquido de lavado fasi vulgarus alast.

Las extracciones difieren en la cantidad de contaminación citoplasmática. Esto se observa como diferentes cantidades de la enzima rubis del yeso. Al realizar este procedimiento, es importante recordar ser lo más suave posible al menos para evitar causar daño tisular o contaminación citoplasmática después de este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la espectrometría de masas de proteínas o metabolitos, para responder a preguntas adicionales sobre la composición del fluido aplásico. El líquido de lavado aplásico también se puede utilizar como medio macroscópico para estudiar el efecto de los productos químicos aplásicos en los microorganismos que colonizan los tejidos vegetales.