Name: Derivación de células T In Vitro De células madre embrionarias de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprende a derivar células T in vitro a partir de células madre embrionarias de ratón utilizando el sistema de co-cultivo OP9-DL1. Este protocolo permite estudiar los eventos moleculares y celulares de la hematopoyesis.

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Agradecemos a Joon Kim por su asistencia experta en citometría de flujo. La investigación en los laboratorios de los autores está respaldada por el programa SCORE de los Institutos Nacionales de Salud (subvención SC1-GM095402 a B.D.O.) y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (a J.C.Z.P.). J.C.Z.P. cuenta con el apoyo de una Cátedra de Investigación de Canadá en Inmunología del Desarrollo. La infraestructura de investigación biomédica de Hunter College está respaldada en parte por el programa de Centros de Investigación en Instituciones Minoritarias (RCMI) de los NIH a través de subvenciones MD007599. También reconocemos al Programa de Ciencia de Células Madre del Estado de Nueva York (NYSTEM, por sus siglas en inglés) por su apoyo al inicio de la investigación con células madre en Hunter College a través de subvenciones C023048.

1 Preparación de medios de cultivo, citoquinas y Placas gelatinizada <ol><li> Preparar los medios de comunicación de células ES mediante el uso de Modificación de Medio de Eagle (DMEM) de Dulbecco con alto contenido de glucosa y piruvato de sodio. Añadir 20% ESC Calificación suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% Tampón HEPES, ácidos 1% para no esencial amino, 0,1% de gentamicina (50 mg / ml) y 0,1% ( 55 M) β-mercaptoetanol. Esterilizar medio de células ES por filtración. </li><li> Preparar medios OP9 al hacer 1 L de medio esencial mínimo alfa (α-MEM) a partir de polvo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir 20% de suero fetal bovino (FBS) y 1% penicilina / estreptomicina. Invertir para mezclar. Esterilizar por filtración en dos alícuotas de 500 ml. NOTA: Se recomienda el uso de medios elaborados a partir de polvo y es probable que para producir un mejor mantenimiento de células OP9 y en los resultados de diferenciación in vitro. Este enfoque se ha convertido en nuestro procedimiento estándar. Sin embargo, también observamos That hemos utilizado a veces líquidos pre-hechos α-MEM con éxito adecuada. </li><li> Preparar medio de congelación mediante la adición de 10% sulfóxido de dimetilo (DMSO) al 90% de FBS. Agitar suavemente y esterilizar por filtración. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar 2,000x Flt-3 ligando (10 g / ml) por disolución de Flt-3 humana recombinante ligando (Flt-3L) en medios OP9 completa a 10 g / ml. Alícuota en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacenan a -80 ° C. Siga las recomendaciones del proveedor respecto a la estabilidad y el almacenamiento. NOTA: La estabilidad de Flt-3L es corto (1 mes a 4 ° C o 3 meses a -80 ° C). </li><li> Preparar 1,000x IL-7 (1 g / ml) mediante el uso de medios de comunicación OP9 completa. Alícuota en 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacenan a -80 ° C. Siga las recomendaciones del proveedor sobre la estabilidad y almacenamiento (IL-7 es estable por hasta 12 meses a -80 ° C). </li><li> Preparar 1,000x Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) (10 g / ml) por una dilución 1:10 de 10 7 unidades de LIF in medio de células ES. Alícuota Almacenar a 4 ° C. Asegúrese de anotar la fecha de caducidad indicada por el fabricante en los viales alícuotas. NOTA: El producto es estable en forma concentrada o diluida al menos 18 meses a partir de la fecha de fabricación. </li><li> Preparar placas de 6 pocillos gelatinizados por añadir 1,5 ml de 0,1% de solución de gelatina en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Deja los platos en la campana estéril a temperatura ambiente con las tapas en, dejando al menos 30 minutos para el recubrimiento. Los platos también se pueden dejar en una incubadora humidificada durante la noche. Retire cualquier solución de gelatina sobrante justo antes de la siembra de células. No deje que la solución de gelatina se seque por completo en el pozo. </li></ol> 2 Preparación y mantenimiento de células alimentadoras y las células madre embrionarias de ratón (mESC) NOTA: Incubar todas las células en un 37 ° C humidificado incubadora con 5% de CO 2. <ol><li> Descongelación fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) <ol><li> Quick-descongele un vial congelado (~ 5 x 10 6 </sup&gt; células / vial) de mitomicina C-tratado (o de otra manera detenidas mitóticamente MEFs) y los transfieren a un tubo de 15 ml. </li><li> Añadir 8 ml de medio de células ES a las células descongeladas, de una manera gota a gota para diluir gradualmente el DMSO a partir del medio de congelación. </li><li> Centrifugar las células a 400 x g a 4 ° C durante 5 min. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 3 ml de medio de células ES. </li><li> Preparar un tubo de centrífuga de 50 ml con 33 ml de medio de células pre-calentado ES. Añadir los 3 ml de MEFs resuspendidos a llevar el volumen final a 36 ml. </li><li> Distribuir 3 ml de los MEFs resuspendidos en cada pocillo de dos placas de 6 pocillos gelatinizado. Colocar las placas en la incubadora durante al menos seis horas para permitir que las células se unan y se extienden antes de la siembra de las mESCs en ellos. Estas capas alimentadoras mitóticamente detenidas pueden ser utilizables durante varios días después de la siembra inicial, si sus medios se cambian cada 2-3 días. NOTA: MEFs recién detenidos también se pueden utilizar. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> MESCs Siembra <ol><li> Quick-descongele un vial con un congelado clon mESC en el baño a 37 ° C y preparar las células como se describe en 2.1.1-2.1.3. NOTA: Nos congelamos 2 viales de mESC de un pozo confluente de una placa de 6 pocillos. </li><li> Retire el medio de un pozo (por clon mESC) de la placa de 6 pocillos con monocapas MEF detenidos (preparado en el paso 2.1.5) y sembrar el 3 ml de mESCs en la parte superior de la monocapa MEF. Añadir 3 l de 1,000x LIF (10 ng / ml). Volver platos en la incubadora. </li></ol></li><li> El mantenimiento de células ES y la tripsina mediada pasaje NOTA: Cambiar medios diarios o Split basado en la confluencia de mESC. En condiciones óptimas, la cosecha y de división / re-placa de las células cada dos días. <ol><li> Retire el medio de células ES y lavar mESCs con 2 ml de PBS. Retire PBS. Añadir 1 ml de 0,25% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 3-5 min. </li><li> Recoger las células tratadas con tripsina y transferirlos en un tubo de centrífuga de 15 ml. Pipetear vigorosamente la suspensión celular a romper los grumos de mCES. Añadir 2 ml de medio de células ES completa a la suspensión celular para neutralizar la tripsina. </li><li> Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 3 ml de células ES medios de comunicación. </li><li> Retire el medio de placas de 6 pocillos que contienen monocapas MEF detenidos preparados. Añadir la cantidad apropiada de la suspensión celular (basado en la relación de separación deseada) en 3 ml de medio de células ES a cada pocillo para sembrar. Añadir 3 l de LIF 1,000x. Una confluencia mESC bien dividida 1: 6 estará listo para el paso en 2 días. </li></ol></li><li> OP9 / mantenimiento de células OP9-DL1 <ol><li> Descongelar un vial de células OP9 (siga los pasos 2.1.1-2.1.3 utilizando medios OP9) </li><li> Añadir 7 ml de medio OP9 a 10 cm placa de cultivo tisular. Añadir los 3 ml de células resuspendidas en una forma gota a gota, la distribución de las células de todo el plato. Colocar las células durante la noche en la incubadora. </li><li> Compruebe la confluencia de las células OP9 al día siguiente. Si el plato contiene muchas células flotando muertos, remove los medios de comunicación y añadir 10 ml de medio OP9 fresco. Devuelva el plato a la incubadora si no se observa casi llena confluencia. Split (utilizando tripsina) 1: 4 cerca de la monocapa confluente OP9. NOTA: Las placas deben llegar a mismo nivel confluencia de nuevo en unos 2 días. Tenga cuidado de no dejar que las células OP9 vuelto sobre-confluente. </li><li> Congelar los primeros pasajes de células OP9 como acciones de expansión. NOTA: Nos congelamos 2 viales de células OP9 de una cerca de la confluencia placa de 10 cm. Cada vial de expansión de valores puede ser propagado a crear reservas de trabajo que se utilizan posteriormente en mESC experimentos de co-cultivo. Mantenga todas las existencias OP9 congelados en nitrógeno líquido y no en el congelador -80 ° C, ya que las temperaturas fluctuantes pueden influir negativamente en la calidad de las heladas. </li></ol></li></ol> 3. OP9-DL1 Procedimiento Co-cultura <ol><li> Preparaciones de Co-cultura <ol><li> Aproximadamente una semana antes de la iniciación de un co-cultivo, descongelar MEFs, mESCs y sto celular OP9 trabajocks. Dado que las células OP9-DL1 no son necesarios hasta el día 8 de co-cultivo, descongelar las células OP9-DL1 durante los primeros tres días después del inicio de co-cultivo. Mantener o congelar todas las células según sea necesario. </li><li> Determinar el número inicial de placas de 10 cm con monocapas de células OP9 preparados para alcanzar el 80% de confluencia en co-cultura día 0 en base a la escala del experimento (por ejemplo, número de clones mESC para diferenciarse y el número de puntos de tiempo de co-cultivo de ser analizada). Para prepararse para una co-cultura, dividido cerca plato confluente de células OP9 entre 1: 4 y 1: 6 dos días antes de que se necesitarán las monocapas. NOTA: Uno necesitará al menos una placa por clon ESC. Típicamente, un solo clon ESC sembró en una sola placa (como se describe a continuación) en el día 0 deben producir suficientes células para sembrar placas de seis días en el paso 5. Cada placa 5 días permitirá una posterior punto de tiempo de análisis. </li><li> Desde monocapas OP9 serán continuamente necesarios para el paso de co-cultivo, tenga cuidado de siempre maintaen un número adecuado de placas de cultivo de OP9 adicionales en paralelo con el co-cultivo. </li></ol></li><li> Día 0: Inicio de la co-cultura <ol><li> Recoger mESC como en 2.3.1-2.3.4. Contar las células. </li><li> Para cada clon mESC preparar 5 x 10 4 mESC en 10 ml de medio por placa OP9. NOTA: Aunque no hemos utilizado, observamos que un medio alternativo que consiste en α-MEM, el 10% de SFB, y 5 x 10 -5 M β-mercaptoetanol También se ha informado para el uso en la diferenciación de co-cultivos 10. </li><li> Eliminar los viejos medios de OP9 platos y añadir los 10 ml de suspensión mESC a los platos teniendo cuidado para distribuir las células uniformemente a través de la placa. Colocar las cápsulas en la 37 ° C incubadora. </li></ol></li><li> Día 3: Cambio de medio <ol><li> Sacar los recipientes de la incubadora y observar bajo el microscopio. Las colonias deben comenzar a perder brillo y un aspecto apisonado. </li><li> Retire el medio de platos y añadir con cuidado 10 ml de fresco OP9medios de comunicación. </li><li> Devolver los platos de co-cultivo a la incubadora. Monitorear visualmente la formación de colonias de mesodermo, como todos los días para informar al momento de OP9 preparación monocapa alimentador para el siguiente paso (día 5), ​​que no debe llevarse a cabo hasta ~ 80-90% de las colonias mostrar visualmente mesodermo como morfología. Aplazamiento máximo de la etapa de transferencia de células 5 días es de 2 días. </li></ol></li><li> Día 5: La tripsina pasaje mediada con pre-chapado. NOTA: Preparar de antemano un número adecuado de placas de 10 cm con células OP9 óptimamente confluentes. Proceda con los siguientes pasos sólo si los co-cultivos muestran visualmente las características que se describen en el paso 3.3.3 (ver resultados también representativos). <ol><li> Retire el medio de los platos de co-cultivo. Añadir 4 ml de PBS para lavar. Agitar el PBS y quitar. Añadir 4 ml de tripsina al 0,25% y colocar los platos en la incubadora de ~ 5 min. </li><li> Interrumpir la capa de las células tratadas con tripsina por pipeteo vigoroso, con cuidado de no introducir burbujas de aire excesivas, hasta que unhomogénea se logra, sobre todo sola suspensión celular. </li><li> Añadir 4 ml de medio OP9 completos y mezclar con la pipeta. Transferencia de células en un nuevo, vacío placa de 10 cm y el lugar en la incubadora durante 30 min para permitir que las células se adhieran OP9 al plato. Este paso de &quot;pre-chapado&quot; reduce el número de OP9 células transferidas a la siguiente etapa de co-cultivo. </li><li> Preparar 50 ml tubos de centrífuga con células coladeras 40 micras. </li><li> Recoger las células no adherentes de la placa de pre-chapado y pasar a través del filtro de células en el tubo. Lave el plato suavemente con 6 ml de PBS y pasarla a través del mismo filtro, dejando las células OP9 unidos detrás. </li><li> Centrifugar las células a 400 x g 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en 3 ml de medio OP9 completa. Contar las células. </li><li> Retire el papel de placas de 10 cm con células OP9 óptimamente confluentes. </li><li> Para cada punto de tiempo de análisis, sembrar 5 x 10 5 células en el mono OP9capa en volumen final de 10 ml. </li><li> Añadir 5 ng / ml humana recombinante Flt-3L y colocar los platos en la incubadora. </li></ol></li><li> Día 8: hematopoyético de células progenitoras (HPC) de recogida NOTA: Preparar de antemano un número adecuado de placas de 6 pocillos con monocapas OP9 o-DL1 OP9 celulares para que puedan ser ~ 80% de confluencia en el tiempo para este paso. <ol><li> Preparar 50 ml tubos de centrífuga con 40 micras coladores. </li><li> Quitar los platos de la incubadora y observar bajo el microscopio. Grupos brillante de HPC deben ser débilmente unidos a la monocapa OP9. Recoger la mayor cantidad de estas células como sea posible mediante el lavado (pero no demasiado interrumpir) la monocapa OP9 con una pipeta y los medios de comunicación existentes en el plato. Para evitar la formación de espuma, siempre dejar al menos 1 ml de los medios de comunicación en la punta de la pipeta durante esta colección HPC / paso de lavado. </li><li> Pasar las células a través del filtro de 40 micras en un tubo. Añadir 8 ml de PBS a la misma placa y comprobar bajo el microscopio si todos nos HPCsre recogido. Repita el paso de lavado / colección con PBS y (si es necesario) con el lavado más enérgico. Colar las células en el tubo ya que contiene las células de la misma placa. </li><li> Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Preparar una mezcla maestra de 3 ml (por placa sembró en el día 5) de los medios de OP9 con 5 ng / ml de Flt-3L y 1 ng / ml de IL-7. </li><li> Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en medios OP9 con Flt-3L + IL-7 mezcla maestra (3 ml por cada placa de 10 cm procesado). Transferencia de las células recogidas de cada placa en un pocillo de una placa de 6 pocillos con células OP9. <ol><li> Con el fin de conducir hacia las células monocíticas, células B o linajes eritroides, sembrar las células recogidas en las células OP9. Para derivar células T, sembrar las células en monocapas de células OP9-DL1. </li></ol></li><li> Coloque las placas de 6 pocillos en incubadora. </li></ol></li><li> Día 10: Cambio de medio <ol><li> Preparar un tubo de centrífuga de 15 ml para cada distinto mESC clon-alimentador tipo de células combición en co-cultivo. </li><li> Preparar una mezcla maestra de los medios OP9 con 5 ng / ml de Flt-3L y 1 ng / ml de IL-7. Preparar 3 ml para cada pocillo. </li><li> Recoger suavemente los medios de comunicación de cada pocillo de la placa de 6 pocillos que combina los medios de comunicación de múltiples pocillos que contienen el mismo clon de alimentador de tipo de célula combinación ESC. </li><li> Añadir 2 ml de mezcla maestra medios OP9 (véase 3.6.2) en cada pocillo. </li><li> Centrifugar los medios de recogida a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender cada pellet (muy pequeña si es visible) en 1 ml de OP9 maestro de la mezcla de medios (ver 3.6.2) por pocillo recogido inicialmente en el paso 3.6.3. </li><li> Distribuir 1 ml de células de nuevo en cada pocillo de la que los medios de comunicación se recogió originalmente llevando el volumen en cada pocillo a 3 ml. Vuelva a poner las placas en la estufa. </li></ol></li><li> Día 12: Ningún pasaje tripsina NOTA: Preparar de antemano un número adecuado de placas de 6 pocillos con células OP9 o OP9-DL1 para que puedan ser confluentes de manera óptima en el tiempo para este step. Día 12 es ideal para el análisis de citometría de flujo de eritroide en desarrollo, monocitos y células T en fase inicial. <ol><li> Preparar una mezcla maestra (3 ml para cada pocillo que continuará en co-cultivo) de los medios de comunicación OP9 con 5 ng / ml de Flt-3L y 1 ng / ml de IL-7. </li><li> Preparar 50 ml tubos de centrífuga con 40 micras coladores (uno para cada clon-alimentador tipo de célula combinación ESC en co-cultura). </li><li> Vigorosamente pipetear los medios de comunicación existentes en cada pocillo para desagregar todas las células (incluyendo la monocapa) en el pozo. Continuar con pipeteo enérgico hasta que se alcanza un estado parecido a una suspensión de células individuales. </li><li> Pasar las células recogidas a través del filtro en el tubo. Añadir 3 ml de PBS en cada pocillo para lavar y recoger todas las células restantes. Pasar las células a través del mismo filtro. Combinar celdas de múltiples pozos que contienen el mismo clon-alimentador tipo de célula combinación ESC. </li><li> Desechar el filtro de células utilizado y eliminar una parte alícuota equivalente a un pocillo (~ 6 ml) para cualquier deseadacitometría de flujo (u otro) análisis a realizar en ese día. Guarde estas alícuotas en hielo antes de su uso. </li><li> Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante. Resuspender el sedimento de los tubos de centrífuga de 50 ml en 3 ml de mezcla maestra por pozo a ser re-sembrado. Añadir 3 ml por pocillo de cada suspensión de células en el tipo de células de alimentación apropiada y colocar los platos en la incubadora. </li></ol></li><li> Día 14: Cambio de medio <ol><li> Siga los pasos que se indican en el apartado 3.6. </li></ol></li><li> Día 16: Ningún pasaje tripsina NOTA: Preparar con antelación placas de 6 pocillos de células OP9 o OP9-DL1 óptimamente confluentes para este paso. NOTA: El día 16 es ideal para el flujo de análisis de citometría de los linfocitos B y las células T de la etapa intermedia. <ol><li> Siga los pasos descritos en la sección 3.7. </li></ol></li><li> Día 18: Cambio de medio <ol><li> Siga los pasos que se indican en el apartado 3.6. </li></ol></li><li> Día 20: Ningún pasaje tripsina NOTA: Día 20 is ideal para citometría de flujo análisis de mediados o finales de etapa de desarrollo las células T. <ol><li> Siga los pasos descritos en la sección 3.7. Si lo desea, realizar la diferenciación de células día 20 cambio de medio alterna pasado y no tripsina pasajes cada dos días con un seguimiento diario de la tasa de expansión de los linfocitos. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El sistema OP9-DL1 de co-cultivo se ha utilizado para estudiar el papel de los diversos productos de genes durante el desarrollo de tipos de células sanguíneas a partir de células madre. 8,12,13 También ha demostrado ser un modelo eficaz para estudiar la función del ADN reguladora del gen durante la diferenciación celular. 9,14 Con este enfoque como una alternativa a los modelos enteros de ratón puede producir un considerable ahorro en tiempo y coste de los experimentos que abordan muchas cuestione...

Se ha establecido un sistema de cultivo celular en el que las células madre embrionarias de ratón (mESC) se diferencian en células T in vitro.1 Este sistema explota la capacidad de la señalización Notch para impulsar la diferenciación de las células T. 2 La línea celular OP9-DL1 se creó mediante la transducción de células OP93 derivadas de la médula ósea con un ligando Notch, Delta-like 1 (DL1). 4 La activación de la cascada de señalización Notch in vitro facilita el desarrollo de células T hasta la exclusión de otros linajes celulares. Con la inclusión de citocinas apropiadas, este sistema proporciona un "microambiente" de cultivo celular que apoya el avance secuencial de mESC hacia linajes de células hematopoyéticas y, en última instancia, de células T. Este sistema apoya la identificación por citometría de flujo de las células T en las diversas etapas de desarrollo que se observan durante la ontogenia normal de las células T en el timo. Para investigar cuestiones seleccionadas relacionadas con el desarrollo de células T, este procedimiento se ha convertido en una alternativa atractiva a los modelos de ratón entero in vivo 5 y a los métodos de cultivo de órganos tímicos fetales in vitro utilizados para provocar el desarrollo de células T a partir de precursores hematopoyéticos derivados de células madre embrionarias de ratón. 6 La principal ventaja del sistema de cocultivo OP9 es que implica técnicas de cultivo celular estándar y sencillas y no depende del uso continuo de animales de experimentación. 
Seguimos un protocolo detallado y previamente publicado en nuestros experimentos utilizando este enfoque. 7 Hemos utilizado esta tecnología para examinar los productos de diferenciación hematopoyética de clones de mESC no manipulados, clones de mESC de alta calidad seleccionados a mano para hacer embriones quiméricos8 y clones de ESC transfectados de manera estable que provienen directamente de la selección de fármacos. 9 Hemos observado que la cinética temporal de la diferenciación inicial in vitro de mESC a colonias tipo mesodermo en este modelo puede ser variable entre clones individuales. Los cocultivos mESC-OP9 pueden evaluarse visualmente para determinar la progresión a mesodermo. Si bien esto generalmente se completará al quinto día de cocultivo, entre los clones individuales, la finalización se puede retrasar uno o dos días. La formación cuantitativa (~80-90%) del mesodermo debe lograrse antes de la transferencia para obtener una formación óptima de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) y una linfopoyesis robusta. Por lo tanto, cuando se trabaja con múltiples clones de mESC, es mejor retrasar este pasaje del "día 5" hasta que todos los clones completen la transición a colonias similares al mesodermo. Esto permite la sincronía del desarrollo posterior entre los clones después de su transferencia a condiciones de diferenciación hematopoyética. Tres días después del paso del 80-90% de las formaciones mesodérmicas, las HPC se recogen de las monocapas OP9. Las HPC se pueden sembrar en nuevas células OP9 para permitir la diferenciación de linajes de células monocíticas, eritroides y B. Alternativamente, las HPC se pueden sembrar en células OP9-DL1 y dirigirse hacia el desarrollo de células T. Todos los cultivos de diferenciación in vitro se suministran Flt-3L a partir del día 5, con una adición adicional de IL-7 a partir del día 8. Los análisis de citometría de flujo realizados en varios puntos temporales durante el experimento permiten monitorear el progreso a través de las etapas y linajes de la diferenciación hematopoyética y el desarrollo de células T. Los linfocitos T CD4/CD8 doble positivo (DP) comienzan a emerger en el día 16 del cocultivo, y tanto los linfocitos DP como los CD8 monopositivos (SP) son abundantes en el día 20. El resultado general y la solidez de la cocultura dependen en gran medida de la capacidad de determinar visualmente la finalización de los puntos de inflexión significativos del desarrollo que ocurren. Este protocolo pretende ser una guía para el reconocimiento de estos hitos, así como de los demás parámetros críticos, que son clave para una diferenciación exitosa.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Células madre calificadas FBS</td><td>Gemini</td><td>100-125</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td> inactivada por calor <td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-alanil L-glutamina</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HEPES&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>TMS-003-C</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos No Esenciales</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Solución Regente de Gentamicina (50 mg/ml)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol (55 mM) en DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &mu; m Membrana PES</td></tr><tr><td>Grado de cultivo celular Agua</td><td>Corning</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp;</td><td>12000-022</td><td>Polvo, reconstituir según la recomendación de fabricación</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoScientific</td><td>SH 30396.03</td><td>Se requieren pruebas de lotes individuales&nbsp;</td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetilo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>ligando Flt-3 humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>308-FK</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Murine IL-7</td><td>PeproTech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>LIF&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Agua Utrapure con gelatina al 0,1%</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>MEFs tratados con mitomicina C</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CF</td><td>Se puede utilizar cualquier MEF detenido mitóticamente</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (40 &mu; m)</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos 100 x 20 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Multipocillo BD Falcon de 6 pocillos</td><td></td><td>353046</td><td></td></tr> tubos <tr>de<td>microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td>Tubos de</tr><tr><td>centrífuga de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tubo de poliestireno de fondo redondo con tapa de filtro de celdas</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td>Tubos para FACS&nbsp;</td></tr><tr><td>Células ES R1 Células</td><td></td><td></td> ATCC SCRC-1011 <td></td></tr><tr><td>OP9</td><td>Las células se pueden obtener del Repositorio de Células del Laboratorio Riken (Japón).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células OP9-DL1</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td>Las celdas se pueden solicitar desde el Z&uacute; &ntilde; iga-pfl&uuml; Laboratorio CKER.</td></tr><tr><td>Software FlowJo&nbsp;</td><td>En</td> nuestro laboratorio se han utilizado <td>análisis de datos Tree</td>Star <td></td> FACS</tr><tr>,<td>citómetro de flujo</td><td>BD</td><td></td>, <td>FACScan, FACSCalibur y FACSVantage</td></tr></tbody></table>

derivación de células t in vitro de células madre embrionarias de ratón

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

El sistema de cocultivo OP9/OP9-DL1 se ha convertido en un método bien establecido para derivar tipos de células sanguíneas diferenciadas a partir de progenitores embrionarios y hematopoyéticos de origen humano y de ratón. Ahora se utiliza para abordar una variedad cada vez mayor de cuestiones genéticas, celulares y moleculares complejas relacionadas con la hematopoyesis, y está a la vanguardia de los esfuerzos para traducir estos hallazgos básicos a aplicaciones terapéuticas. Los procedimientos son sencillos y habitualmente producen resultados sólidos. Sin embargo, lograr una diferenciación hematopoyética exitosa in vitro requiere especial atención a los detalles del mantenimiento del reactivo y del cultivo celular. Además, el protocolo presenta pasos sensibles a la técnica que, si bien no son difíciles, requieren cuidado y práctica para dominar. Aquí nos centramos en los procedimientos para la diferenciación de linfocitos T a partir de células madre embrionarias de ratón (mESC). Proporcionamos un protocolo detallado con discusiones de los pasos críticos y los parámetros que permiten una diferenciación celular robusta y reproducible in vitro. Es de interés para el campo considerar una adopción más amplia de esta tecnología, ya que tiene el potencial de reducir el uso de animales, reducir el costo y acortar los plazos de la experimentación básica y traslacional.

Cuando se cultiva en MEFs en presencia de LIF, mESCs se pueden mantener en un estado indiferenciado. Bajo condiciones ideales, aparecen como colonias compactas de células rodeadas por un halo brillante en la microscopía de contraste de fases (Figura 1). Estos cultivos deben ser monitoreados diariamente. Dependiendo de la confluencia de las células, los medios de comunicación pueden ser cambiados o células se pueden dividir. Vecinas colonias mESC no deben llegar al punto de contacto entre sí. Un cultivo ...

Las células madre embrionarias de ratón pueden diferenciarse a células T in vitro utilizando el sistema de cocultivo OP9-DL1. El éxito en este procedimiento requiere una atención cuidadosa al mantenimiento del reactivo/célula y a los pasos sensibles de la técnica clave. Aquí discutimos estos parámetros críticos y proporcionamos un protocolo detallado para fomentar la adopción de esta tecnología.

Derivación de células T In Vitro De células madre embrionarias de ratón

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

El objetivo general de este procedimiento es impulsar la diferenciación cuantitativa de las células T a partir de células madre embrionarias de ratón o ESC e in vitro. Esto se logra primero sembrando las ESC en una monocapa de células estromales OP nine. Después de cinco a siete días, las formaciones de colonias mesodérmicas se cosechan y se vuelven a colocar en una monocapa fresca de nueve células OP.Tres días más tarde, las pequeñas células progenitoras hematopoyéticas redondas o HPC se cosechan y se transfieren a una nueva monocapa OP nine para la generación de células eritroides, monocíticas y B, o a una nueva monocapa OP nine DL una para generar células T. En última instancia, este método se puede utilizar como modelo in vitro para estudiar los eventos moleculares, genéticos y celulares que regulan la hematopoyesis y el desarrollo de linfocitos T. Este procedimiento fue desarrollado en el laboratorio del Dr. Juan Carlos Sunga Fluker en la Universidad de Toronto.Aprendimos la técnica de su grupo para poder aplicarla a nuestra investigación sobre la regulación génica durante el desarrollo de células T en Hunter College. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos exis

derivation-of-t-cells-in-vitro-from-mouse-embryonic-stem-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este protocolo detalles de la derivación de células madre hematopoyéticas trasplantables a partir de células madre embrionarias de ratón (ESC) y su posterior inyección en ratones receptores irradiados letalmente. En pocas palabras, el CES se diferencian como cuerpos embrioides, que luego se infectan con HOXB4 retrovirales y co-cultivadas con células del estroma y OP9 citocinas hematopoyéticas.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

La capacidad de las células madre embrionarias humanas de auto-renovación y diferenciación en todos los tipos celulares del cuerpo sugiere que una gran promesa para aplicaciones médicas y como herramienta de investigación para abordar las cuestiones fundamentales en el desarrollo y la enfermedad. Aquí, ofrecemos un breve paso a paso el protocolo para la derivación de células madre embrionarias humanas a partir de embriones por el aislamiento immunosurgical de la masa celular interna.

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

La capacidad de las células germinales embrionarias a diferenciarse en células germinales primordiales durante etapas tempranas del desarrollo es un modelo perfecto para hacer frente a nuestra hipótesis sobre el cáncer y la infertilidad. Este protocolo se muestra la forma de aislar las células germinales primordiales de las gónadas en desarrollo de embriones de 10.5 a 11.5 días después de ratón coitum.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

En este vídeo, se demuestra el aislamiento de los blastocistos de ratón y la derivación de células madre del trofoblasto de los blastocistos. También describe las condiciones para el mantenimiento de la propiedad de células madre, así como la inducción de diferenciación en la cultura.

Derivación de células madre de ratón a partir de blastocistos Trofoblasto

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

Este video muestra un protocolo para generar linfocitos T funcionales específicos de antígeno a partir de linfocitos T inmaduros derivados de iPSC utilizando un sistema de cultivo tímico tridimensional. El cocultivo de las células T inmaduras derivadas de iPSC con lóbulos tímicos fetales de ratones con depleción de linfocitos endógenos dio lugar a una maduración exitosa de las células T para formar emigrantes tímicos (iTE) derivados de iPSC CD8αβ+ MHC clase I+.

Sistema de cultivo tímico tridimensional para generar emigrantes tímicos derivados de iPSC

+ &gt; 'jove_content'Naïve se polarizan en varios subconjuntos dependiendo del entorno en el momento de la activación.  La diferenciación de los linfocitos T CD4+ naïve a varios subconjuntos efectores se puede lograr in vitro mediante la adición de estímulos del receptor de linfocitos T y señales específicas de citocinas.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Este artículo describe la metodología in vivo e in vitro para caracterizar los progenitores de sedimentación tímica mediante el análisis de la cinética de generación, fenotipo y número de su progenie de células T.

Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Este artículo describe un protocolo y eficiente derivar líneas de células madre pluripotentes de embriones de ratón de la cultura en la etapa de blastocisto.

Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

Este protocolo describe la diferenciación de linfocitos T CD4+ naïve en linfocitos Th17 patógenos in vitro. Específicamente, cuando se combina con un enfoque basado en citometría de flujo multiparamétrica, se puede obtener una pureza del 90% de las células Th17 patógenas a partir de células T CD4+ naïve utilizando este método de diferenciación.

Diferenciación in vitro de linfocitos T CD4+ naive en linfocitos Th17 patógenos en ratón

Aprende a derivar células T in vitro a partir de células madre embrionarias de ratón utilizando el sistema de co-cultivo OP9-DL1. Este protocolo permite estudiar los eventos moleculares y celulares de la hematopoyesis.

Derivación de células T In Vitro De células madre embrionarias de ratón

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