Name: El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprende ensayos de citometría de flujo para medir respuestas de células T contra el virus del Nilo Occidental usando células dendríticas. Este método facilita el estudio de la inmunidad celular en condiciones de bioseguridad nivel dos.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH a T.W. (R01AI072060 y R01AI099123). G. Xie fue apoyado por una beca predoctoral del Centro Sealy para el Desarrollo de Vacunas. Agradecemos al Dr. Richard Flavell (Instituto Médico Howard Hughes, Facultad de Medicina de la Universidad de Yale, New Haven) y al Dr. Shizuo Akira (Universidad de Osaka, Japón) por proporcionar los ratones MyD88–/– y al Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) por proporcionar ratones transgénicos OTII.

Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas Medical Branch. 1. Aislamiento de países en desarrollo de ratones y no infectados infectado con el VNO <ol><li> Partido por edad y sexo 6-10 semanas de edad, de tipo salvaje C57BL / 6 (B6) y MyD88 - / - ratones. Inocular por vía intraperitoneal (ip) con 500 formando la placa unidad (PFU) de WNV NS4B- P38G mutante. En el día 3 después de la infección, la eutanasia B6 y MyD88 - / - ratones con CO 2. Utilice los ratones no infectados de ambos grupos como los controles. Utilice tres ratones de cada grupo. </li><li> Marino mojado en el lado izquierdo del ratón sacrificado utilizando etanol al 70% y cortar la piel a lo largo del lado izquierdo del ratón, a mitad de camino entre la patas delanteras y traseras. Cortar abrir la cavidad del cuerpo. Retirar el bazo utilizando las pinzas. Coloque el bazo en una placa de Petri con medio RPMI. </li><li> Aislar esplénicos DCs mediante el uso de perlas magnéticas anti-CD11c segúnlas instrucciones del fabricante. </li></ol> 2. Purificación y Etiquetado de las células T de ratones transgénicos otii <ol><li> Cosecha un bazo de un ratón otii ingenuo como se describe en el paso 1.2 anterior y homogeneizar el bazo entre los extremos helados de dos diapositivas. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml, se añade medio RPMI hasta 14 ml. Deje reposar la suspensión durante 5 min y transferir 13 ml de ella a un nuevo tubo cónico de 15 ml. </li><li> Aislar células T CD4 + esplénicas mediante el uso de un kit de aislamiento de células T CD4 + de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> La transferencia de células en un tubo cónico de 50 ml, se lavan dos veces con PBS. Resuspender las células en PBS con albúmina de suero bovino al 0,5% (BSA) a 1 x 10 6 células por ml, y añadir 0,5 mol / ml de CFSE. Incubar a 37 ° C durante 10 min, protegido de la luz. </li><li> Añadir 5 ml de medio completo frío (RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 1/100 volantibióticos / antimicóticos, 1/100 vol L-glutamina y 1 / 1.000 vol de 1000 x 2-mercaptoetanol). </li><li> Incubar en hielo durante 5 min. Lavar las células una vez con PBS, fijan 0,2 x 10 6 células T CD4 + etiquetados en 2% PFA y adquieren en un citómetro de flujo. Utilice esta muestra para determinar el nivel basal de CFSE. Vuelva a suspender el resto de las células marcadas en medio completo. </li></ol> 3. Co-cultura otii células T con los países en desarrollo de ratones infectados con el WNV <ol><li> Cultura 2 x 10 5 células T CD4 + purificadas de ratones otii solos o con purificados los DC de tipo salvaje o MyD88 - / - ratones (2 x 10 4) en una placa de 24 pocillos con o sin OVA residuos 323-339 (1 g / ml) en 1 ml de medio completo por pocillo. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante 5 días. Las células de la cosecha, se lavan dos veces en tampón FACS (PBS con 1% de SFB) y fijan en 0,25 ml de 2% PFA. Vortex inmediatamente. </li></ol> 4. Análisis de citometría de flujo in vitro &lt;/ Em&gt; de células T de cebado <ol><li> Para la adquisición, haga doble clic en el icono del software de citometría de flujo. Para un gráfico de densidad lineal de FSC-A vs lineal SSC-A, seleccionar canales de 0 a 200 mil en FSC-A y de 0 a 200 mil en SSC-A. A continuación, crear una puerta en células vivas (P2; véase la Figura 1A). </li><li> Para analizar la intensidad de fluorescencia de CFSE, abra el histograma del canal FL1 y adquirir 20.000 eventos en la población cerrada. Establecer un marcador en muestras de células otii cultivadas solas (Figura 1A). </li><li> Adquirir muestras para células otii co-cultivadas con DCs de tipo salvaje (Figura 1B) o MyD88 - / - DCs (Figura 1C) de una manera similar. </li></ol> 5. Aislamiento y estimulación de esplenocitos de citoquinas Ensayos <ol><li> Infect B6 y MyD88 - / - ratones con WNV NS4B-P38G mutante utilizando el mismo procedimiento como se describe en step 1,1. En el día 30 después de la infección, re-desafío de sobrevivir ratones con 2000 UFP de la de tipo salvaje cepa WNV ip En los días 8 y 21 de infección por el VNO post-primaria o en el día 4 después de la infección secundaria, eutanasia ratones con CO 2 para la recolección de bazos . NOTA: Se utilizó 2-3 ratones por grupo para cada punto de tiempo. </li><li> Hacer una suspensión de células de esplenocitos como se describe anteriormente en el paso 1.2 y paso 2.2. Contar las células usando un hemocitómetro y re-suspender en 10 ml de medio completo. </li><li> Diluir las células con medio completo a 2,5 x 10 6 células / ml. Añadir 1 ml de esplenocitos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Para simular las células T CD8 +, diluir NS4B y E-WNV péptidos específicos (SSVWNATTA y IALTFLAV) a 1 mg / ml en DMSO. Para la estimulación de las células T CD4 +, diluir NS3 y péptidos E-WNV específica (RRWCFDGPRTNTILE y PVGRLVTVNPFVSVA) a 1 mg / ml en DMSO. Añadir 10 l de péptidos a las células followed por 1 l de solución de Brefeldina A. Utilice células sin péptidos tratamiento como controles. Mezclar las células. </li><li> Haga dos agujeros con un 18 G aguja en el tapón del tubo. Se incuban las células a 37 ° C durante 5 horas. </li></ol> 6. intracelular de citoquinas tinción <ol><li> La transferencia de células a un nuevo tubo de microcentrífuga. Haga girar las células durante 5 minutos a 300-400 xg y verter el líquido sobrenadante. Añadir 1 ml de tampón FACS, vuelta 5 min a 300-400 xg y volver a suspender las células mediante pipeteo con 120 l de tampón FACS. </li><li> Añadir 2 l Fc bloqueador de células y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir 1 ml de tampón FACS a cada tubo. Girar 5 min a 300-400 x g. </li><li> Vuelva a suspender las células en 300 l de tampón FACS y dividirlos en tres tubos (alrededor de 0,8 x 10 6 células por tubo). Como se muestra en la Tabla 1, reservar el primer tubo de cada condición de cultivo para la rata tinción de IgG-PE. Para el segundo tubo, añadir 3 l de anti-CD4 APC a las células CD4-péptidos tratados, 3 μl de anti-CD8 FITC a las células tratadas con péptidos CD8 o ambos anticuerpos a las células sin tratamiento péptidos. Utilice el tercer tubo para la tinción de compensación. Para cada condición de cultivo, utilizar tres tubos de células teñidas con APC-conjugado CD4, CD8 conjugado con FITC o PE anticuerpos marcados CD3 solos (3 l por tubo) como controles de compensación para FL1, FL2 y canales FL4. </li><li> Células Vortex brevemente. Deja en hielo durante 20 min y protegerlo de la luz. Añadir 1,4 ml de tampón FACS. Haga girar 5 min a 300-400 xg y verter el líquido sobrenadante. </li><li> Agitar para interrumpir sedimento celular (o vórtice brevemente). Vuelva a suspender sedimento de células en 250 l de fijación / permeabilización solutionby pipeta. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min y proteger de la luz. </li><li> Añadir 1,2 ml de tampón FACS. Girar 5 min a 300-400 xg y volver a suspender las células en tampón FACS 300 l. NOTA: En este punto, las células se pueden transferir a un laboratorio BL2 para su posterior procesamiento o almacenado en un refrigerador y protegido de la luz para up a tres días. </li><li> Añadir 500 l de tampón FACS. Girar 5 min a 300-400 xg y volver a suspender las células en 500 l de tampón de permeabilización / lavado 1x. Girar 5 min a 300-400 x g. </li><li> Células en 100 l 1x Perm / Wash Vuelva a suspender, añadir 3,5 l anti-IFN-PE al tubo previamente adicionado con anticuerpos para CD4 y / o marcadores de células T CD8 en el paso 6.3 y 3.5 l rata IgG-PE en el tubo reservados para el control de IgG durante 25 minutos en hielo y protegerlo de la luz. Lavar las células mediante la adición de 1,4 ml de 1x tampón de permeabilización / lavado. Girar 5 min a 300-400 x g. Repita el paso de lavado añadiendo 1.4 ml 1x tampón de permeabilización / lavado. </li><li> Haga girar 5 min a 300-400 xg y decantar el sobrenadante. Lavar las células mediante la adición de 1,4 ml de tampón FACS y re-suspender en 400 l de tampón FACS para la adquisición final. </li></ol> 7. Análisis de citometría de flujo intracelular de citoquinas tinción <ol><li> Utilice la misma configuración de adquisición como en el paso 4.1. Create una puerta en células vivas (P2; ver Figura 2A). Ajuste los voltajes que utilizan los tubos de compensación para cada grupo. </li><li> Abra dos nuevos gráficos de puntos, uno para mostrar los datos recogidos para FL1 frente. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), y el otro es para mostrar los datos recopilados para FL4 vs. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Adquirir 50.000 eventos para la población privada de cada muestra. </li></ol>

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<li>Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+measure+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Methods to measure T-cell responses.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).</li>
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<li>Saxena, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hamster-derived+west+nile+virus+isolate+induces+persistent+renal+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275(2013).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

WNV es un patógeno BL3. Debido a las regulaciones de seguridad, ensayos inmunológicos con muestras infectadas con el VNO son a menudo limitadas por la disponibilidad de equipos en BL3 instalaciones o más largo y tedioso de realizar. En un estudio reciente, se utilizaron dos métodos basados ​​en la citometría de flujo para estudiar respuestas inmunitarias celulares durante la infección por VNO 5. En ambos ensayos, las células infectadas con el VNO fueron tratados con 2.1% PFA directa o con una solución de fija...

Virus del Nilo Occidental (VNO), una neurotrópico, plus-detectados flavivirus, es una amenaza emergente para la salud pública. Actualmente, no hay vacunas han sido aprobados para uso humano 1. Una cepa atenuada de virus del Nilo Occidental, que tiene una sustitución en el P38G no estructural (NS) proteína 4B, se sabe que inducen no letalidad en ratones, pero citoquinas innatas superior y respuestas de células T en ratones de tipo salvaje que WNV NY99 cepa 2. Los ratones inmunizados con el mutante NS4B-P38G fueron protegidos de un desafío secundario con letal de tipo salvaje WNV. Esto sugiere que el mutante NS4B-P38G tiene características adecuadas para un candidato a vacuna ideal. Los mecanismos por los que el mutante NS4B-P38G induce una alta inmunidad adaptativa protectora aún no se conocen del todo. Los receptores tipo Toll (TLRs), que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos, juegan un papel esencial en la iniciación de la inmunidad innata a la infección viral. La vía de señalización TLR núcleo utiliza respuesta primaria de diferenciación mieloide gene 88 (MyD88) como adaptador principal 3,4. En un estudio reciente, la señalización de MyD88 ha demostrado desempeñar un papel importante en el desarrollo de la inmunidad mediada por células durante la infección por WNV NS4B- P38G mutante en ratones 5. Células dendríticas (DC) son una de las células presentadoras de antígenos más importantes que presentan la capacidad única de iniciar respuestas de células T durante la infección viral primaria 6,7. Las células T CD4 + y CD8 + tanto contribuyen a la inmunidad protectora de larga duración y son importantes para la supervivencia de host seguido de tipo salvaje infección por el VNO 8,9. Dos ensayos inmunológicos se utilizaron en este estudio para evaluar las funciones de estas células en el mutante ratones infectados NS4B-P38G. En primer lugar, un ensayo de cebado de células T in vitro se utilizó para comparar la capacidad presentadora de antígeno de las DC de WNV-infectados de tipo salvaje y MyD88 - / - ratones. Para aumentar la sensibilidad del ensayo, ingenuo CD4 &lt;sup&gt; + células T se aislaron de otii ratones transgénicos, que expresan una específica Vα2 / Vβ5 TCR para el péptido ovoalbúmina de pollo (OVA) 323 - 339. DCs de los ratones infectados de WNV se purificaron, y co-cultivadas con carboxifluoresceína succinimidil Pascua (CFSE ) las células T CD4 + -etiquetados en presencia de péptido OVA. Después de 5 días de co-cultivo, las células se recogieron y se fijaron con paraformaldehído (PFA) y se analizaron por citometría de flujo. Los ensayos de proliferación se han realizado tradicionalmente a través de la incorporación de 5-bromo-2&#39;-desoxiuridina (BrdU) o desoxirribósido timina tritiada (3HTdR) 10. Sin embargo, estos ensayos son o radiactivo y / o en la necesidad de equipos especiales en el nivel de bioseguridad (BL) 3 instalaciones, donde se llevan a cabo estudios de WNV. El análisis de citometría de flujo de la proliferación de linfocitos por reducción a la mitad de serie de la intensidad de fluorescencia del colorante vital CFSE se ha vuelto más comúnmente utilizado en ensayos inmunológicos como el colorante es más establey uniformemente incorporados en las células, fácilmente detectado por citometría de flujo, y es no radiactivo 11. El ensayo también tiene la capacidad de evaluar el número de divisiones celulares. Una ventaja importante de usar este ensayo en los estudios de virus del Nilo Occidental es que la fijación de las células infectadas con 1-2% PFA podría inactivar WNV 12, lo que permitirá la adquisición de muestras con un citómetro de flujo en un laboratorio BL2. A continuación, se utilizó un procedimiento de tinción intracelular de citoquinas modificado (ICS) para estudiar el papel de MyD88 de señalización en la regulación de las respuestas de células T específicas de VNO en ratones mutantes infectados NS4B-P38G. En este ensayo, los esplenocitos aislados de ratones infectados fueron tratados in vitro con péptidos específicos del WNV. Brefeldina A se añadió a retener las citoquinas dentro de la célula. Después de 5 horas de incubación, las células se recogieron, se lavaron y se tiñeron para subconjuntos de células T. Las células fueron fijadas en PFA, permeabilizaron y se tiñeron para el interferón (IFN) -γ y se analizaron por citometría de flujo.Como con otro ensayo basado en citometría de flujo, una vez que las células se tratan con la fijación y permeabilización de amortiguación que contiene PFA, muestras infectadas pueden ser transferidos a un laboratorio BL2 para su posterior procesamiento y análisis. En varios estudios publicados, hemos utilizado ICS para medir las funciones efectoras de células T en ratones infectados con el VNO 13,14. Aunque está bien establecido, una desventaja importante de este ensayo es que el procedimiento es muy largo y podría ser más tiempo cuando se realiza dentro de las instalaciones BL3. Aquí, un método basado en ICS tubo de microcentrífuga se demostró que era más factible, más fácil de proceder y consume menos tiempo cuando se realiza dentro de un laboratorio BL3.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>calentar a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>perlas magnéticas anti-CD11c</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>seguir el fabricante' s instrucciones</td></tr><tr><td>anti-CD4 perlas magnéticas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-248</td><td>seguir las instrucciones del fabricante s instrucciones</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Residuo de OVA 323-339</td><td>Genscript Corporation</td><td>RP10610</td><td></td></tr><tr><td>Péptidos</td><td>Proinmunes</td><td>PC0AD-D</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A solución</td><td>BD Bioscience</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc Blocker</td><td>e-Bioscience</td><td>14-0161-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td> <td>conjugado con APCe-Bioscience</td><td>17-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>CD8 conjugado por FITC</td><td>e-Bioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Solución de fijación/permeabilización</td><td>BD-Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de permeabilización/lavado</td><td>BD-Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>anti-IFN&gamma;-PE</td><td>e-Bioscience</td><td>12-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo Accuri</td><td>BD Biociencia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el análisis in vitro de la respuesta inmune celular myd88 mediada por el virus del nilo occidental cepa mutante infección

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Un virus atenuado del Nilo Occidental (VNO), una no estructural (NS) 4B-P38G mutante, inducida por citoquinas superior innata y respuestas de células T que la de tipo salvaje WNV en ratones. Recientemente, factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) de señalización ha demostrado ser importante para el cebado de células T inicial y el desarrollo de células T de memoria durante WNV NS4B-P38G infección mutante. En este estudio, dos métodos basados ​​en citometría de flujo-- un ensayo in vitro de células T en el cebado y una tinción intracelular de citoquinas (ICS) - se utilizaron para evaluar las células dendríticas (DCs) y funciones de células T. En el ensayo de cebado de células T, la proliferación celular se analizó mediante citometría de flujo después de co-cultivo de DCs de ambos grupos de ratones con carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) - marcado células T CD4 + de ratones transgénicos otii. Este enfoque proporciona una determinación exacta del porcentaje de proliferación de células T CD4 + con mejorado significativamente la sensibilidad general que la tradiciónal ensayos con reactivos radiactivos. Un sistema de tubo de microcentrífuga se utilizó en ambos procedimientos de cultivo celular y tinción de citocinas del protocolo ICS. En comparación con el sistema tradicional basado en la placa de cultivo tisular, este procedimiento modificado fue más fácil de realizar en el nivel de bioseguridad (BL) 3 instalaciones. Por otra parte, las células infectadas WNV- fueron tratados con paraformaldehido en ambos ensayos, lo que permitió su posterior análisis fuera de las instalaciones BL3. En general, estos ensayos inmunológicos in vitro se pueden utilizar para evaluar de manera eficiente las respuestas inmunes mediadas por células durante la infección WNV.

En el ensayo de células T de cebado, las células T CD4 + CFSE etiquetados fueron cultivadas con DCs purificados a partir del mutante infectados de tipo salvaje NS4B-P38G y MyD88 - / - ratones en la presencia o ausencia de péptidos OVA. Células T marcadas cultivadas solas con o sin OVA se utilizaron para 5 días como controles negativos. Como se muestra en la Figura 1A, las células T totales fueron cerrada para el análisis de la intensidad de fluorescencia en el canal FL1. El marcado...

Se utilizaron dos métodos basados en citometría de flujo: un ensayo de cebado de células T in vitro y una tinción de citocinas intracelulares para medir la capacidad de presentación de antígenos de las células dendríticas y las respuestas de las células T específicas de antígeno a una infección mutante por el virus del Nilo Occidental en ratones.

El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

El objetivo general de este estudio es introducir dos ensayos inmunológicos basados en citometría de flujo para medir la respuesta inmunitaria mediada por células a la infección por el virus del Nilo Occidental en células dendríticas de ensayo de cebado de células T in vitro, o dcs purificadas a partir de ratones infectados con el virus West Nll. Un cocultivo con linfocitos T marcados con CFSE vírgenes purificados a partir de dos ratones transgénicos OT en presencia de péptido óvulo. A continuación, se analiza la respuesta a la proliferación de las células T mediante citometría de flujo en un laboratorio de nivel dos de bioseguridad en el ensayo de tinción de citocinas intracelulares modificado Citos PLE de ratones infectados con el virus del Nilo Occidental, A estimulado ex vivo con péptidos específicos del Nilo Occidental en un tubo de microcentrífuga y luego el sostén de la célula para la producción de citocinas intracelulares y se analiza en el tubo mediante citometría de flujo en el laboratorio de nivel dos de bioseguridad.En última instancia, estos métodos se pueden utilizar para examinar el papel de vías de señalización específicas en la activación de células T en animales infectados por el virus del Nilo Occidental, y reducen significativamente el tiempo de rendimiento dentro de las instalaciones de nivel tres de bioseguridad. Aunque este método puede proporcionar información sobre la inmunidad celular del virus N occidental, también se puede aplicar a otros patógenos de nivel tres de bioseguridad para el ensayo de cebado de células T in vitro. Comience por aislar células dendríticas esplénicas de ratones salvajes tipo C 57 negro seis A, mis ratones D ocho ocho knockout inoculados con el virus del Nilo Occidental y controle los animales no infectados con perlas magnéticas anti CD 11 C de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Luego, para aislar las células T, homogeneizar el bazo diseccionado de un ratón OT dos con los extremos esmerilados de dos portaobjetos, transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros, luego agregar medio RPMI hasta un volumen final de 40 mililitros. Deje que las células se asienten durante cinco minutos y luego transfiera 30 mililitros de la sustancia naciente a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, utilice un kit de aislamiento de células T CD cuatro positivas de acuerdo con las instrucciones del fabricante para clasificar las células T CD cuatro positivas y luego transfiera las células recolectadas a un tubo cónico de 50 mililitros seguido de dos lavados en PBS Después del segundo lavado, incube las células en PBS con 0,5% de albúmina sérica bovina a la vez cien de las seis células por mililitro y 0,5 micromolares por mililitro de CFSE a 37 grados centígrados protegidos A partir de la luz después de 10 minutos, incubar las células en cinco mililitros de medio frío completo en hielo durante cinco minutos.Luego, después de otro lavado de PBS, fije 0,2 veces 10 a las seis células T positivas CD cuatro marcadas con CFSE en PFA al 2% y determine el nivel basal de expresión de CFSE de la célula T mediante citometría de flujo. Vuelva a suspender el resto de las células marcadas con CFSE, incompletas, medianas, y luego cultive dos veces 10 a las cinco purificadas o dos células T CD cuatro positivas solas o con dos veces 10 a las cuatro purificadas de tipo salvaje o mis D ocho ocho dc knockout en una placa de 24 pocillos con o sin un microgramo por mililitro sobre el residuo 3 23 3 39 en un mililitro de medio completo por pocillo a 37 grados centígrados después de cinco días, recoja las células y lávelas dos veces en tampón de hechos y fije los gránulos en 0,25 mililitros de 2% de PFA e inmediatamente vórtice las muestras para la adquisición de datos de citometría de flujo. Haga doble clic en el software de citometría de flujo y seleccione los canales de cero a 200.000 en dispersión directa y de cero a 200.000 en dispersión lateral para generar un gráfico de densidad.A continuación, cree una compuerta en los pozos vivos para analizar la intensidad fluorescente del CFSE. Abra el histograma para el canal FL one y adquiera 20.000 eventos en la población controlada. A continuación, coloque un marcador en las muestras para el OT de dos células cultivadas solas.Adquiera datos para el cocultivo de dos células OT con el tipo salvaje o mis D ocho ocho dcs knockout de manera similar para el ensayo de tinción de citocinas intracelulares. Después de generar una suspensión de una sola célula a partir de bazos recolectados del virus del Nilo Occidental, los ratones infectados en los puntos de tiempo apropiados cuentan las células y luego las diluyen con medio completo a una concentración de 2,5 veces el ciento de las seis células por mililitro. A continuación, Eloqua introduce un mililitro de los citos en un micro tubo centridireccional de 1,5 mililitros.Y luego, para estimular las ocho células T positivas CD, agregue 10 microlitros de péptidos específicos occidentales recién diluidos seguidos de un microlitro de feld. En una solución, mezcle las suspensiones celulares con cuidado y luego haga dos agujeros en la tapa del tubo con una aguja de calibre 18 e incube las células a 37 grados Celsius durante cinco horas. Después de transferir las celdas a un nuevo tubo de micro centrífuga y girarlas hacia abajo después de un lavado un mililitro de tampón de fax, vuelva a suspender el segundo pellet en 120 microlitros de tampón de fax.A continuación, bloquee los sitios de unión inespecíficos con el bloque FC y marque los tubos con los anticuerpos experimentales y de control adecuados, como se indica en la tabla. A continuación, incubar las células en tampón de fijación y permeación y luego transferir las células a un nivel de bioseguridad al laboratorio para su marcaje con anticuerpos de control o anti interferón gamma de acuerdo con la tabla. Para medir la producción de citocinas intracelulares, configure un diagrama de dispersión hacia adelante y hacia adelante como se acaba de demostrar, y luego compuerta las células vivas usando los tubos de compensación para ajustar los voltajes según sea necesario.Cree un diagrama de puntos para mostrar los datos recopilados para las células CD ocho positivas frente a las células CD ocho positivas frente a las células CD cuatro positivas frente a las células interferón gamma positivas y adquiera 50.000 eventos para la población cerrada de cada muestra. En este experimento, se comprimieron las células C totales para determinar la tasa de proliferación de células T basales. A falta de co-cultura con dcs.Cuando las células T se cocultivaron con DC aisladas de animales infectados con el virus del Nilo Occidental, las células T positivas para CFSE exhibieron una proliferación del 87% de células T marcadas con CFSE Cocultivo con DCS de mis ratones D 88 knockout en presencia de una tasa de proliferación del 74,5%, lo que sugiere que la deficiencia en la vía de señalización my D 88 conduce a una alteración de la capacidad de presentación de antígenos por parte de las DCS durante un West null mutante infección por virus. Los porcentajes de linfocitos T esplénicos CD cuatro positivos para interferón gamma positivo y CD ocho positivos para interferón gamma positivos aislados de ratones salvajes infectados con el virus del Nilo Occidental en esta cifra representativa fueron del 0,4% y el 1,7% respectivamente. Mientras que los porcentajes de linfocitos T esplénicos dobles positivos aislados del virus del Nilo Occidental infectados con mi D, ocho ocho ratones knockout fueron solo del 0,2% y del 0,6%, se realizaron análisis similares con citos aislados de ratones no infectados, sin que se observaran diferencias en el porcentaje de células T de poblaciones dobles positivas entre los dos grupos.Además, las poblaciones únicas positivas de los linfocitos T CD cuatro positivos y CD ocho positivos de los ratones de tipo salvaje infectados fueron el 21% y el 13,3% del total de citos SP cerrados, mientras que se determinó que eran solo el 15,9% y el 11,2% de los citos D ocho ocho SP knockout en comparación con los grupos infectados, las respuestas de las células T CD cuatro positivas y CD ocho positivas se redujeron en los ratones I D 88 knockout comparados al grupo de tipo salvaje en el octavo día después de la infección por el virus del caracol del oeste mutante. En resumen, la señalización de my D eight eight está involucrada en la activación inicial de las células T de ambas poblaciones y contribuye a las respuestas positivas de las células T CD cuatro en una etapa posterior de la infección. La citometría de la gripe basada en la primasa de células T in vitro que utilizan dos células T OT marcadas con CFSE proporciona una determinación más precisa del porcentaje de células T CD4 positivas en proliferación con una sensibilidad general significativamente mejorada que los protocolos estándar actuales.El tubo de micro campo, ICS Math tercero, no requiere ningún instrumento especial, lo que ofrece una opción más económica y más flexible para los investigadores.

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Immunology and Infection

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