Name: Microscopía Electrónica de Alta Resolución de la Helicobacter pylori Cag secreción tipo IV Sistema Pili Producido en condiciones variables de Hierro disponibilidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprende a visualizar el sistema de secreción tipo IV Cag de Helicobacter pylori mediante microscopía electrónica de alta resolución. Este método revela cómo la disponibilidad de hierro regula la producción de pili bacterianos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por el Premio de Desarrollo Profesional del Departamento de Asuntos de Veteranos 1IK2BX001701 y el UL1TR000445 de premios CTSA del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales. Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales o los Institutos Nacionales de Salud. Los experimentos de microscopía electrónica de barrido se realizaron en parte mediante el uso del recurso compartido de imágenes celulares de VUMC, respaldado por las subvenciones de los NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 y EY08126.

1. H. Crecimiento pylori en distintas situaciones de disponibilidad de hierro y co-cultivo con células gástricas epiteliales humanas <ol><li> Seleccione H. PMSS1 pylori cepa para estos estudios debido a que tiene una isla de patogenicidad cag intacta y expresa un sistema de secreción de tipo IV funcionamiento. También utilizar un mutante cagE isogénica (PMSSI Δ jaula) como un control negativo. Crecer las bacterias en placas de TSA suplementadas con 5% de sangre de oveja (placas de agar sangre) durante 24 horas a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2. NOTA: Preparar reactivos y ensamblar materiales como se indica en la Tabla de Materiales y Equipos. Las concentraciones finales de cada reactivo se enumeran entre paréntesis. </li><li> Raspe las bacterias de la placa utilizando un aplicador con punta de algodón estéril e inocular en caldo brucella modificado preparado a partir de los componentes (ver Materiales y Equipos tabla) y se completará con el colesterol. Incubar durante una noche a 37 culturas° C en aire ambiente, complementado con 5% de CO 2 con agitación a 200 revoluciones por minuto (rpm). NOTA: El colesterol se utiliza en lugar de suero bovino fetal debido al hecho de que el suero es complejo; que contiene numerosas fuentes de hierro de nutrientes tales como heme que provoca variabilidad en los resultados. </li><li> En el día de cultivo bacteriano, semilla de células epiteliales gástricas humanas AGS (ATCC CRL-1739) sobre cubreobjetos tratados con poli-D-lisina en placas de 12 pocillos (alrededor de 1 x 10 5 células por pocillo). </li><li> El día siguiente, diluir cultivos bacterianos a una DO600 de 0,3 en caldo Brucella modificado solo o suplementado con 100 mM FeCl 3, 200 dipiridilo mu M (un quelante de hierro sintético), o 200 mM dipiridilo más 250 M FeCl 3. Incubar estos cultivos durante 4 horas a 37 ° C en aire ambiente, complementado con 5% de CO 2 con agitación a 200 rpm. </li><li> Bacterias centrifugar a 1000 xg para recoger las células y eliminar los sobrenadantes antes de resuspender in un volumen igual de caldo de Brucella modificado fresco suplementado con colesterol. Medida DO600 del cultivo (OD600 = 1,0 = 5,5 x 10 8 células / ml) y añadir las bacterias a las células epiteliales en una multiplicidad de infección (MOI) de 20: 1. Realizar diluciones en serie y las células bacterianas de la placa sobre placas de agar de sangre para evaluar la viabilidad celular bacteriana. </li><li> Incubar H. células epiteliales gástricas humanas pylori y AGS co-cultivos de 4 horas a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2 en condiciones estáticas antes de realizar la microscopía electrónica de barrido (SEM) de preparación de muestras. </li></ol> 2. Preparación de muestras para SEM Visualice H. pylori CagA-T4SS Pili <ol><li> Retire H. pylori y co-cultivos AGS de la incubadora y decantar el sobrenadante de cultivo (a ahorrar para la IL-8 ELISA). Lavar suavemente tres veces con 0,05 M tampón de cacodilato de sodio (pH 7,4). Fijar las muestras durante 2-4 horas a temperatura ambiente en una solución de 2,0% de paraformaldehído, 2.5% De glutaraldehído, y tampón de cacodilato de sodio 0,05 M. Después de la fijación primaria, lavar las muestras tres veces con tampón de cacodilato de sodio 0,05 M. </li><li> Realizar fijación secundaria usando 0,1% de tetróxido de osmio en tampón de cacodilato de sodio 0,05 M secuencial en dos pasos 10 min de fijación. Después de la fijación secundaria, lavar las muestras tres veces con tampón de cacodilato de sodio 0,05 M. </li><li> Después de la fijación primaria y secundaria, deshidratar muestras por lavado secuencial con concentraciones crecientes de etanol según la Tabla 1. </li><li> Después de la deshidratación de etanol, realizar tres lavados secuenciales de dióxido de carbono líquido. A continuación, las muestras secas en un punto crítico utilizando una máquina secadora de punto crítico a una temperatura de 31,1 ° C y la presión de 1,073 psi. </li><li> Monte cubreobjetos en aluminio SEM talones de la muestra y la pintura con una línea delgada de plata coloidal en el borde de la muestra para lograr la conexión a tierra apropiada y evitar la carga durante la proyección de imagen SEM. </li><li> Muestras Coat con 5 nm deoro-paladio usando una máquina de capa por pulverización catódica para aumentar la señal de electrones secundarios de la muestra y efecto de borde. </li></ol> 3. Los parámetros de imagen para análisis de alta resolución de SEM <ol><li> Ver muestras con una emisión de campo Pistola microscopio electrónico de barrido (FEG-SEM). </li><li> Image en un modo de alto vacío a una distancia de trabajo de 5-10 mm. </li><li> Ajuste el voltaje de aceleración a 5 kV. </li><li> Establecer tamaño de punto a 2-2,5. </li><li> Incline la muestra entre 15-25 grados para conseguir una mejor vista de la interfaz de huésped-patógeno. </li><li> Dar prioridad a la formación de imágenes bacterias adheridas a los bordes de las células epiteliales para la visualización de gran aumento, ya que estas áreas de interacción huésped-patógeno se enriquecen para las bacterias de formación de pili. </li></ol> 4. Los análisis estadísticos para Evaluar Pili cuantificaciones <ol><li> Analizar H. pili pylori Cag-T4SS utilizando el software ImageJ para cuantificar número de pili / célula, así como por ciento de células que presentan el piliated phenotype según las instrucciones de abajo. </li><li> Micrografía archivos abiertos en el software ImageJ. Identificar pili como estructuras formadas entre la célula bacteriana y la célula huésped, con anchura uniforme (10-13 nm) y la longitud (60-150 nm). NOTA: La estructura pilus está presente en cepas bacterianas WT, pero ausente en las cepas isogénicas tales como cepas mutantes Δ jaula, que albergan una inactivación en el gen que codifica la ATPasa importante que el conjunto de la secreción de tipo IV poderes pilus. </li><li> Calibrar la herramienta de medición dibujando una línea con la herramienta de línea recta y luego hacer clic en la pestaña &quot;Analizar&quot;. Seleccione &quot;Escala de Ajuste&quot; en el menú desplegable e introduzca el valor de la barra de ampliación en el cuadro denominado &quot;distancia conocida&quot; y establecer la unidad de longitud en el valor adecuado (nm). Haga clic en &quot;Aceptar&quot;. </li><li> Mida pili Cag-T4SS utilizando la herramienta de línea recta para dibujar sobre la longitud o anchura del pilus y luego presione &quot;Ctrl-M&quot; para medir cada pilus. Observar un cuadro de diálogo con los valores medidos. Anote estos valores o copiar y pegar en un programa de hoja de cálculo. </li><li> Utilice la longitud y el ancho de los parámetros previamente establecidos 24, hacen caso omiso de las características que no se ajustan al perfil de Cag-T4SS. Entonces cuantificar el número de pili sobre la base de los valores que están dentro de los puntos de corte 10-13 nm de anchura y 60-150 nm de longitud. </li><li> Analizar la cuantificación de pili estadísticamente por la prueba t de Student de dos colas utilizando el software GraphPad Prism. </li></ol> 5. Opcional: Evaluación de la IL-8 secreción que se correlaciona con Pilus Producción <ol><li> El uso de sobrenadantes de la Etapa 2.1, realizar una IL-8 ELISA según las instrucciones del fabricante con el kit (véase Materiales y Equipo Tabla). </li><li> Analizar la IL-8 secretada por las células huésped y calcular el porcentaje de inducción de IL-8 con respecto a WT PMSS1 crecido en medio solo. Realizar el análisis estadístico utilizando dos colas la prueba t de Student utilizando GraphPad Prisma asíftware. </li></ol>

<ol><li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).</li>
<li>Sycuro, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+crosslinking+relaxation+promotes+Helicobacter+pylori%27s+helical+shape+and+stomach+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization.</a> Cell. 141 (5), 822-833 (2010).</li>
<li>Kodaman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Helicobacter+pylori+coevolution+shapes+the+risk+of+gastric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).</li>
<li>Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cag-pathogenicity+island+encoded+type+IV+secretion+system+in+Helicobacter+pylori+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis.</a> FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).</li>
<li>Fischer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+molecular+mode+of+action+of+the+Helicobacter+pylori+Cag+type+IV+secretion+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus.</a> FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).</li>
<li>Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+Helicobacter+pylori+CagA+into+gastric+epithelial+cells+by+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion.</a> Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).</li>
<li>Bourzac, K., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-host+cell+interactions+mediated+by+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion.</a> Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).</li>
<li>Bronte-Tinkew, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+cytoxin-associated+gene+A+activates+the+signal+transducer+and+activator+of+transcription+3+pathway+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo.</a> Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).</li>
<li>Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+Helicobacter+pylori+triggered+by+contact+with+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Infect.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells.</a> Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17(2012).</li>
<li>Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+sheathed+surface+organelle+of+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system.</a> Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).</li>
<li>Cover, T. L., Peek, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet%2C+microbial+virulence+and+Helicobacter+pylori+induced+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer.</a> Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).</li>
<li>Queiroz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+gastric+IL-1%CE%B2+concentration+and+iron+deficiency+parameters+in+Helicobacter+pylori+infected+children%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased gastric IL-1β concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children.</a> PLoS One. 8 (2), 57420(2013).</li>
<li>Harris, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-associated+hypochlorhydria+and+development+of+iron+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency.</a> J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).</li>
<li>Noto, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+deficiency+accelerates+Helicobacter+pylori-induced+carcinogenesis+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans.</a> J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).</li>
<li>Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M. Jr, Amieva, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+perturbs+iron+trafficking+in+the+epithelium+to+grow+on+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface.</a> PLoS Pathog. 7 (5), (2011).</li>
<li>Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dissection+of+the+Helicobacter+pylori+Fur+regulatory+circuit+by+genome-wide+location+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis.</a> J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).</li>
<li>Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+Helicobacter+pylori+Fur-regulated+promoters+reveals+a+Fur+box+core+sequence+and+novel+Fur-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes.</a> Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).</li>
<li>Cassat, J. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Iron in infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).</li>
<li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).</li>
<li>Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+iron+starvation+response+in+Bordatella+pertussis+provides+new+insights+into+siderophore+utilization+and+virulence+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression.</a> J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).</li>
<li>Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+factors+associated+with+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori factors associated with disease development.</a> Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).</li>
<li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li>
<li>Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+host+iron+utilization+mechanisms+of+Helicobacter+pylori+revealed+with+iron-deficient+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media.</a> Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).</li>
<li>Shaffer, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+exploits+a+unique+repertoire+of+type+IV+secretion+system+components+for+pilus+assembly+at+the+bacteria-host+cell+interface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface.</a> PLoS Pathog. 7 (9), (2011).</li>
<li>Barrozo, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+plasticity+in+the+type+IV+secretion+system+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori.</a> PLoS Pathog. 9 (2), (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El hierro es un micronutriente esencial para la mayoría de las formas de vida, incluyendo los patógenos bacterianos. En un esfuerzo para restringir la viabilidad de los microorganismos invasores, los huéspedes vertebrados secuestran hierro de nutrientes en un proceso conocido como &quot;inmunidad nutricional&quot; 18. En respuesta a esto, los patógenos bacterianos han evolucionado para utilizar el hierro como una molécula de señalización global para percibir su entorno y regular la elaboración de característi...

La infección por H. pylori es un factor de riesgo significativo para el cáncer gástrico1. Sin embargo, los resultados de las enfermedades varían y dependen de numerosos factores, como la genética del huésped, la diversidad genética de las cepas de H. pylori y elementos ambientales como la dieta del huésped11. Informes previos han establecido que existe una correlación entre la infección por H. pylori, la deficiencia de hierro (medida por la disminución de las concentraciones de ferritina y hemoglobina en sangre) y el aumento de la producción de citocinas proinflamatorias, incluida la secreción de IL-8, que en última instancia conduce a una mayor progresión de la enfermedad gástrica12. La infección aguda por H. pylori también se asocia con hipoclorhidria, que afecta la capacidad del huésped para absorber el nutriente hierro y, en última instancia, conduce a cambios en la homeostasis del hierro13. Estos hallazgos clínicos sugieren que la disponibilidad de hierro dentro del nicho gástico podría ser un factor importante en el resultado de la enfermedad. De hecho, modelos animales de infección por H. pylori han demostrado que el bajo consumo de hierro en la dieta exacerba la enfermedad gástrica14. Los niveles reducidos de hierro en estos animales requieren que H. pylori induzca una respuesta de adquisición de hierro con el fin de obtener el hierro necesario para la replicación bacteriana. H. pylori tiene la capacidad de perturbar el tráfico de hierro dentro de las células huésped para facilitar la replicación bacteriana de una manera dependiente de15. Curiosamente, se ha demostrado que la isla de patogenicidad cag está regulada por el factor de transcripción Fur16,17 que responde al hierro. Además, las cepas de Cag+ se asocian con un aumento de la inflamación y enfermedades gástricas como el cáncer1. Estos hallazgos respaldan un modelo en el que H. pylori altera la expresión de Cag-T4SS en un esfuerzo por obtener hierro de las células huésped que residen en un entorno sin hierro, lo que resulta en resultados de enfermedad exacerbados. 
Dos factores que aumentan la inflamación y la morbilidad son la expresión de Cag y la baja ingesta de hierro en la dieta. Estos hechos apoyan la hipótesis de que la disminución de la disponibilidad de hierro aumenta la producción de Cag-T4SS pili en la interfaz patógeno del huésped, lo que resulta en una peor enfermedad gástrica11-14. El objetivo del método proporcionado en este manuscrito es establecer el papel del micronutriente hierro en la regulación de la biogénesis del pilus Cag-T4SS. En trabajos anteriores, utilizamos dos enfoques para observar un aumento dependiente del hierro en la expresión de Cag-T4SS. En primer lugar, se analizaron las cepas de producción de animales mantenidos con dietas altas y bajas en hierro y se reveló que las cepas de producción de la dieta baja en hierro produjeron más pili de Cag-T4SS que las cepas de la dieta alta en hierro14. En segundo lugar, el cultivo de la cepa 7.13 de H. pylori in vitro en condiciones repletas de hierro dio lugar a una reducción de la formación de pili, mientras que las células cultivadas en presencia de un quelante de hierro produjeron significativamente más pili. 
Hemos continuado investigando la regulación dependiente del hierro del fenotipo Cag-T4SS pili y ofrecemos el siguiente protocolo optimizado y resultados representativos realizados con una cepa adicional de Helicobacter pylori, PMSS1. La justificación detrás del desarrollo de esta técnica fue correlacionar el aumento de la actividad de Cag-T4SS en condiciones de limitación de hierro con una mayor formación de pilus Cag-T4SS. La implicación y el uso más amplios de esta técnica proporcionarán condiciones de cultivo optimizadas que resultarán en una producción elevada del pili Cag-T4SS. Este ensayo será útil para los investigadores que buscan determinar la composición y la arquitectura del Cag-T4SS mediante el enriquecimiento de esta importante característica de la superficie bacteriana. La preparación y visualización de la muestra por microscopía electrónica de pistola de emisión de campo tiene numerosas ventajas sobre técnicas alternativas como los métodos de microscopía óptica para visualizar el Cag-T4SS y será apropiada para los investigadores interesados en estudiar la regulación de este orgánulo10.

<table><tbody><tr>Caldo <td></td><td></td><td></td><td>de brucella modificado</td></tr><tr><td>Peptona de caseína (10 g/L)</td><td>Sigma</td><td>70172</td><td></td></tr><tr><td>Digestión péptica de tejido animal (10 g/L)</td><td>Sigma</td><td>70174</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura (2 g/L)</td><td>Sigma</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa (1 g/L)</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (5 g/L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol (250X) (4 ml/L)</td><td>Life Technologies</td><td>12531018 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>férrico (100 o 250 uM)</td><td>Sigma</td><td>157740-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dipiridyl (200 uM)</td><td>Sigma</td><td>D216305-100G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td>modificado</tr><tr><td>RPMI+HEPES (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>22400-121</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino ( 100 ml/L)</td><td>Life Technologies</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Preparación de Microscopía Electrónica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (2,0% acuoso)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehído (2,5% acuoso)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de sodio (0,05 M)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio (0,1% acuoso)</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (absoluto)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Pintura de plata coloidal</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>Talones de muestras SEM</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>75220</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Thermo Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr>Evaluación <td></td><td></td><td></td><td>de secreciones de IL-8</td></tr><tr><td>Quantikine IL-8 kit ELISA</td><td>R& Sistemas D</td><td>D8000C</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopía electrónica de alta resolución de la helicobacter pylori cag secreción tipo iv sistema pili producido en condiciones variables de hierro disponibilidad

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori es una bacteria gramnegativa de forma helicoidal que coloniza el nicho gástrico humano de la mitad de la población humana1,2. H. pylori es la principal causa de cáncer gástrico, la segunda causa de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo3. Un factor de virulencia que se ha asociado con un mayor riesgo de enfermedad gástrica es la isla de patogenicidad Cag, una región de 40 kb dentro del cromosoma de H. pylori que codifica un sistema de secreción de tipo IV y la molécula efectora afín,4,5. El Cag-T4SS es responsable de la translocación de y peptidoglicano a las células epiteliales del huésped5,6. La actividad del Cag-T4SS da lugar a numerosos cambios en la biología de la célula huésped, incluida la regulación positiva de la expresión de citocinas, la activación de vías proinflamatorias, la remodelación del citoesqueleto y la inducción de redes de señalización celular oncogénica5-8. El Cag-T4SS es una máquina macromolecular compuesta por componentes de subensamblaje que abarcan la membrana interna y externa y se extienden hacia afuera desde la célula hacia el espacio extracelular. La porción extracelular del Cag-T4SS se conoce como "pilus"5. Numerosos estudios han demostrado que los pili Cag-T4SS se forman en la interfaz huésped-patógeno9,10. Sin embargo, las características ambientales que regulan la biogénesis de este importante orgánulo siguen siendo en gran medida oscuras. Recientemente, reportamos que las condiciones de baja disponibilidad de hierro aumentaron la actividad de Cag-T4SS y la biogénesis del pilus. Aquí presentamos un protocolo optimizado para cultivar H. pylori en diferentes condiciones de disponibilidad de hierro antes del co-cultivo con células epiteliales gástricas humanas. Además, presentamos el protocolo completo para la visualización del fenotipo hiperpiliado exhibido en condiciones restringidas de hierro mediante análisis de microscopía electrónica de barrido de alta resolución.

En este informe, hemos demostrado que las condiciones de variación de la disponibilidad de hierro tienen la capacidad de modular H. pylori CagA-T4SS biogénesis pilus en la interfaz de patógenos de acogida. Cuando se cultivan en medio solo, H. pylori forma un promedio de 3 pili / célula. Cuando H. pylori se cultiva en condiciones de agotar hierro (utilizando el dipiridilo quelante sintético) que son sub-inhibidor al crecimiento bacteriano (Figura 1), las bacterias producen nume...

Aquí describimos un método para visualizar el orgánulo bacteriano oncogénico conocido como el Sistema de Secreción Cag Tipo IV (Cag-T4SS). Encontramos que el Cag-T4SS se produce diferencialmente en la superficie de H. pylori en respuesta a diferentes condiciones de disponibilidad de hierro.

Microscopía Electrónica de Alta Resolución de la Helicobacter pylori Cag secreción tipo IV Sistema Pili Producido en condiciones variables de Hierro disponibilidad

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

El procedimiento visualiza la hiperproducción de pii del sistema de secreción CAG tipo cuatro, que ocurre en condiciones de limitación de hierro, primer cultivo de h pylori en condiciones de limitación de hierro. El segundo paso es el cocultivo de h pylori con células epiteliales gástricas. A continuación, procese las muestras de cocultivo para microscopía electrónica de barrido.En última instancia, la microscopía electrónica de barrido de alta resolución, tal como se utiliza para mostrar un aumento de la producción de ojos pi del sistema de secreción CAG tipo cuatro en condiciones de limitación de hierro. La técnica de este manuscrito es importante para las enfermedades relacionadas con el H. pylori, como el cáncer gástrico, porque el sistema de secreción CAG tipo cuatro se asocia con un mayor riesgo de resultados negativos de la enfermedad. Por lo tanto, una mejor comprensión de la regulación de esta importante superficie bacteriana.Orgánulo podría revelar nuevos objetivos quimioterapéuticos Y la ventaja de la microscopía electrónica de barrido de alta resolución frente a los métodos existentes, como la microscopía fluorescente, es que se puede visualizar la píldora de secreción de tipo cuatro individual. Las personas nuevas en este método de microscopía electrónica tienen problemas con el procedimiento, específicamente con la química húmeda, ya que requiere una sincronización cuidadosa y una mano delicada sobre la sangre. Crecen placas de agar.H Pylori PMs, bacteria S one y su mutante isogénico CAG e, que carece de un sistema de secreción de tipo cuatro que funcione. Inocular cultivos y caldo Ella modificado suplementado con colesterol para que crezca durante la noche. A continuación, siembre una célula epitelial gástrica humana GS en cubreobjetos tratados con polilisina en placas de 12 pocillos para diferentes condiciones de disponibilidad de hierro.Diluir el h pylori a una densidad óptica 600 de 0,3 en caldo bru modificado solo. Medios que contienen 100 micro molares de cloruro de hierro, 200 micromolares del cucharón quelante de hierro sintético o 200 micro de cucharón más 200 micro molares de cultivo de cloruro de hierro. Las muestras, durante cuatro horas, centrifugan ahora las bacterias a 1000 Gs y Resus suspende los pellets en un volumen igual de caldo bru fresco modificado suplementado con colesterol.Mide la densidad bacteriana. A continuación, infecte las células epiteliales con el h pylori en una multiplicidad de infección de 20 a uno. Realice diluciones en serie y coloque las células bacterianas en placas de agar sangre.Para evaluar la viabilidad de las células bacterianas, coloque los cultivos compartidos en la incubadora de cultivos celulares durante cuatro horas. Decantar el sobrenadante a partir de los cocultivos h pylori I y a GS. Lave suavemente las células adherentes tres veces con tampón de coato de sodio molar de 0,05 molares.A continuación, fije las muestras durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente. A continuación, lave las muestras tres veces con tampón de caato de sodio molar 0,05. Para una fijación secundaria, agregue tetróxido de osmio al 0,1% en tampón de coato de sodio 0,05 molar en dos pasos de fijación secuenciales de 10 minutos.Luego, después de tres lavados, deshidratar las muestras con mayores concentraciones de etanol. Coloque las muestras en una máquina secadora de puntos críticos, luego llene la cámara con dióxido de carbono líquido. El etanol se purga de la cámara y la cámara se llena de nuevo con dióxido de carbono líquido.Luego, la muestra se lleva al punto crítico de 31.1 grados Celsius y 1073 PSI, ahora monte los deslizamientos de la cubierta en talones de muestra SEM de aluminio y pinte una línea delgada de plata coloidal en el borde de la muestra para la conexión a tierra. Durante la obtención de imágenes SEM, utilizando una máquina de recubrimiento por pulverización catódica, recubra las muestras con cinco nanómetros de paladio dorado para aumentar la señal de electrones secundarios de la muestra y el efecto de borde. Examine las muestras con una imagen de microscopio electrónico de barrido con pistola de emisión de campo en un modo de alto vacío a una distancia de trabajo de cinco a 10 milímetros.Ajuste el voltaje de aceleración a cinco kilovoltios. A continuación, establezca el tamaño del punto entre dos y 2,5. Ahora incline la muestra entre 15 y 25 grados para lograr una mejor vista de la interfaz huésped-patógeno para una visualización de gran aumento.Priorice la obtención de imágenes de las bacterias adheridas a los bordes de las células epiteliales para las bacterias que calientan la vida de PI enriquecidas en las interacciones huésped-patógeno. Abra los archivos de micrografía en el software de imagen J. Identifique pi li como estructuras que se forman entre la célula bacteriana y la célula huésped con un ancho uniforme de 10 a 13 nanómetros y una longitud de 60 a 150 nanómetros.Calibre la herramienta de medición dibujando una línea con la herramienta de línea recta y luego haciendo clic en la pestaña analizar del menú desplegable. Seleccione establecer escala e introduzca el valor de la barra de ampliación en distancia conocida y establezca la unidad de longitud en nanómetros. A continuación, haga clic en Aceptar.Ahora use una herramienta de línea recta para dibujar sobre la longitud o el ancho de los pilotos y luego presione el control M para medir cada piloto y registrar los valores medidos en un programa de hoja de cálculo. Utilice los parámetros de longitud y anchura previamente establecidos para descartar las características que no se ajustan al perfil del sistema de secreción CAG tipo cuatro. A continuación, cuantifique el número de PI I en función de los valores que están dentro del rango, analizado estadísticamente, una cuantificación del PI LI utilizando una prueba T de Student de dos colas.En este experimento, H. pylori se cultivó en condiciones de depleción de hierro utilizando el quelante sintético dip parital a concentraciones que no inhiben significativamente el crecimiento. Las bacterias produjeron numerosos PII del sistema de secreción CAG tipo cuatro cuando se cultivaron conjuntamente con células gástricas humanas. Por el contrario, cuando está presente una fuente exógena de hierro nutriente, se reprime la formación de PII del sistema de secreción CAG tipo cuatro.La cuantificación de la PII en la interfaz huésped-patógeno revela que en condiciones de restricción de hierro, H pylori exhibe un aumento del doble en el sistema de secreción CAG tipo cuatro PI ojo, el porcentaje de células pileadas aumenta en un 11% en comparación con las células cultivadas en medio solo. Curiosamente, aunque la actividad del sistema de secreción CAG tipo cuatro medida por la secreción de IL ocho del huésped se incrementa en condiciones de restricción de hierro y se reprime en condiciones de disponibilidad excesiva de hierro, las dimensiones de PI LI permanecen consistentes en todas las condiciones de disponibilidad de hierro. De acuerdo con la participación del sistema de secreción CAG tipo cuatro, la disponibilidad de hierro no cambia la biogénesis de PI LI en la superficie de un mutante CAG e después de su desarrollo.Esta técnica SEM allanó el camino para que los investigadores dentro del campo del sistema de secreción CAG tipo cuatro exploraran la localización de proteínas. Con respecto a las almohadas del sistema de secreción tipo CAG cuatro. Recientemente se ha descubierto que la proteína efectora CAG a se localiza en la punta de la píldora de secreción tipo cuatro.

high-resolution-electron-microscopy-helicobacter-pylori-cag-type-iv

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El diseño de un operón que codifica sintético tanto el aparato secretor y los monómeros estructurales de fibras curli se describe. La sobreproducción de estos amiloides y polímeros adherentes permite una ganancia apreciable de adhesión de...

Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

Este artículo ilustra el uso del etiquetado de radio de persecución de pulsos en combinación con la fotoreticulación específica del sitio para monitorear las interacciones entre una proteína de interés y otros factores en E. coli. A diferencia de los métodos tradicionales de reticulación química, este enfoque genera "instantáneas" de alta resolución de una vía de ensamblaje ordenada en una célula viva.

Monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio

Este artículo presenta un protocolo para el procesamiento de imágenes cryo-EM utilizando la suite de software SPHIRE. El presente protocolo se puede aplicar para casi todos los proyectos EM de partículas individuales que apuntan a la resolución casi atómica.

Análisis de una sola partícula de alta resolución a partir de imágenes de crosmicroscopía electrónica usando SPHIRE

Ratones representan un modelo inestimable en vivo para el estudio de la infección y las enfermedades causadas por microorganismos gastrointestinales. Aquí, describimos los métodos utilizados para estudiar la colonización bacteriana y cambios histopatológicos en modelos de ratón de Helicobacter pylori-relacionados con la enfermedad.

Modelos de ratón de la infección por Helicobacter y patologías gástricas

Se presenta un instrumento y métodos para la preparación de volúmenes nanoliter-tamaño de la muestra para microscopía electrónica de transmisión. No se requieren, evitando las consecuencias perjudiciales que esto puede tener para las proteínas, significativamente reducir la pérdida de muestra y que permite el análisis de lisado de proteómica visual única célula pasos papel-blotting.

Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión

Mycobacterium tuberculosis muestra un aumento de la producción y liberación de vesículas extracelulares en respuesta a condiciones bajas de hierro. Este trabajo detalla un protocolo para generar condiciones de hierro bajas y métodos para la purificación y caracterización de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas en respuesta a la deficiencia de hierro.

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas por hierro

La imagen de células bacterianas es un enfoque de biología de sistemas emergentes centrado en la definición de procesos estáticos y dinámicos que dictan la función de grandes máquinas macromoleculares. Aquí, la integración de imágenes cuantitativas de células vivas y tomografía crioelectrónica se utiliza para estudiar la arquitectura y las funciones del sistema de secreción de legionela pneumophila tipo IV.

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

La determinación de la estructura de complejos macromoleculares utilizando crioEM se ha convertido en rutina para ciertas clases de proteínas y complejos. Aquí, se resume esta tubería (preparación de muestras, detección, adquisición y procesamiento de datos) y los lectores se dirigen hacia recursos y variables más detallados que pueden alterarse en el caso de especímenes más desafiantes.

Microscopía crioelectrónica de partícula única: de la muestra a la estructura

Los mapas crio-EM de alta resolución de macromoléculas también se pueden lograr mediante el uso de microscopios TEM de 200 kV. Este protocolo muestra las mejores prácticas para establecer alineaciones ópticas precisas, esquemas de adquisición de datos y selección de áreas de imágenes que son esenciales para la recopilación exitosa de conjuntos de datos de alta resolución utilizando un TEM de 200 kV.

Recopilación rutinaria de conjuntos de datos crio-EM de alta resolución utilizando un microscopio electrónico de transmisión de 200 KV

El protocolo describe un método de alto rendimiento para la determinación de estructuras de proteínas de membrana con la crio-tomografía electrónica y procesamiento de imágenes 3D. Que cubre los detalles de la preparación de muestras, la recopilación de datos, procesamiento e interpretación de datos, y concluye con la producción de un objetivo representante para la aproximación, la pandemia del VIH-1 glicoproteína de la envoltura. Estos procedimientos de cálculo han sido diseñados de una manera...

Determinación de estructuras moleculares de glicoproteínas de la envoltura del VIH con Cryo-tomografía electrónica y automatizada promedio Sub-tomografía

Aprende a visualizar el sistema de secreción tipo IV Cag de Helicobacter pylori mediante microscopía electrónica de alta resolución. Este método revela cómo la disponibilidad de hierro regula la producción de pili bacterianos.

Microscopía Electrónica de Alta Resolución de la Helicobacter pylori Cag secreción tipo IV Sistema Pili Producido en condiciones variables de Hierro disponibilidad (Video) | JoVE Journal

Microscopía Electrónica de Alta Resolución de la Helicobacter pylori Cag secreción tipo IV Sistema Pili Producido en condiciones variables de Hierro disponibilidad

Explorar más videos