Microscopía Electrónica de Alta Resolución de la Helicobacter pylori Cag secreción tipo IV Sistema Pili Producido en condiciones variables de Hierro disponibilidad

El procedimiento visualiza la hiperproducción de pii del sistema de secreción CAG tipo cuatro, que ocurre en condiciones de limitación de hierro, primer cultivo de h pylori en condiciones de limitación de hierro. El segundo paso es el cocultivo de h pylori con células epiteliales gástricas. A continuación, procese las muestras de cocultivo para microscopía electrónica de barrido.

En última instancia, la microscopía electrónica de barrido de alta resolución, tal como se utiliza para mostrar un aumento de la producción de ojos pi del sistema de secreción CAG tipo cuatro en condiciones de limitación de hierro. La técnica de este manuscrito es importante para las enfermedades relacionadas con el H. pylori, como el cáncer gástrico, porque el sistema de secreción CAG tipo cuatro se asocia con un mayor riesgo de resultados negativos de la enfermedad. Por lo tanto, una mejor comprensión de la regulación de esta importante superficie bacteriana.

Orgánulo podría revelar nuevos objetivos quimioterapéuticos Y la ventaja de la microscopía electrónica de barrido de alta resolución frente a los métodos existentes, como la microscopía fluorescente, es que se puede visualizar la píldora de secreción de tipo cuatro individual. Las personas nuevas en este método de microscopía electrónica tienen problemas con el procedimiento, específicamente con la química húmeda, ya que requiere una sincronización cuidadosa y una mano delicada sobre la sangre. Crecen placas de agar.

H Pylori PMs, bacteria S one y su mutante isogénico CAG e, que carece de un sistema de secreción de tipo cuatro que funcione. Inocular cultivos y caldo Ella modificado suplementado con colesterol para que crezca durante la noche. A continuación, siembre una célula epitelial gástrica humana GS en cubreobjetos tratados con polilisina en placas de 12 pocillos para diferentes condiciones de disponibilidad de hierro.

Diluir el h pylori a una densidad óptica 600 de 0,3 en caldo bru modificado solo. Medios que contienen 100 micro molares de cloruro de hierro, 200 micromolares del cucharón quelante de hierro sintético o 200 micro de cucharón más 200 micro molares de cultivo de cloruro de hierro. Las muestras, durante cuatro horas, centrifugan ahora las bacterias a 1000 Gs y Resus suspende los pellets en un volumen igual de caldo bru fresco modificado suplementado con colesterol.

Mide la densidad bacteriana. A continuación, infecte las células epiteliales con el h pylori en una multiplicidad de infección de 20 a uno. Realice diluciones en serie y coloque las células bacterianas en placas de agar sangre.

Para evaluar la viabilidad de las células bacterianas, coloque los cultivos compartidos en la incubadora de cultivos celulares durante cuatro horas. Decantar el sobrenadante a partir de los cocultivos h pylori I y a GS. Lave suavemente las células adherentes tres veces con tampón de coato de sodio molar de 0,05 molares.

A continuación, fije las muestras durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente. A continuación, lave las muestras tres veces con tampón de caato de sodio molar 0,05. Para una fijación secundaria, agregue tetróxido de osmio al 0,1% en tampón de coato de sodio 0,05 molar en dos pasos de fijación secuenciales de 10 minutos.

Luego, después de tres lavados, deshidratar las muestras con mayores concentraciones de etanol. Coloque las muestras en una máquina secadora de puntos críticos, luego llene la cámara con dióxido de carbono líquido. El etanol se purga de la cámara y la cámara se llena de nuevo con dióxido de carbono líquido.

Luego, la muestra se lleva al punto crítico de 31.1 grados Celsius y 1073 PSI, ahora monte los deslizamientos de la cubierta en talones de muestra SEM de aluminio y pinte una línea delgada de plata coloidal en el borde de la muestra para la conexión a tierra. Durante la obtención de imágenes SEM, utilizando una máquina de recubrimiento por pulverización catódica, recubra las muestras con cinco nanómetros de paladio dorado para aumentar la señal de electrones secundarios de la muestra y el efecto de borde. Examine las muestras con una imagen de microscopio electrónico de barrido con pistola de emisión de campo en un modo de alto vacío a una distancia de trabajo de cinco a 10 milímetros.

Ajuste el voltaje de aceleración a cinco kilovoltios. A continuación, establezca el tamaño del punto entre dos y 2,5. Ahora incline la muestra entre 15 y 25 grados para lograr una mejor vista de la interfaz huésped-patógeno para una visualización de gran aumento.

Priorice la obtención de imágenes de las bacterias adheridas a los bordes de las células epiteliales para las bacterias que calientan la vida de PI enriquecidas en las interacciones huésped-patógeno. Abra los archivos de micrografía en el software de imagen J. Identifique pi li como estructuras que se forman entre la célula bacteriana y la célula huésped con un ancho uniforme de 10 a 13 nanómetros y una longitud de 60 a 150 nanómetros.

Calibre la herramienta de medición dibujando una línea con la herramienta de línea recta y luego haciendo clic en la pestaña analizar del menú desplegable. Seleccione establecer escala e introduzca el valor de la barra de ampliación en distancia conocida y establezca la unidad de longitud en nanómetros. A continuación, haga clic en Aceptar.

Ahora use una herramienta de línea recta para dibujar sobre la longitud o el ancho de los pilotos y luego presione el control M para medir cada piloto y registrar los valores medidos en un programa de hoja de cálculo. Utilice los parámetros de longitud y anchura previamente establecidos para descartar las características que no se ajustan al perfil del sistema de secreción CAG tipo cuatro. A continuación, cuantifique el número de PI I en función de los valores que están dentro del rango, analizado estadísticamente, una cuantificación del PI LI utilizando una prueba T de Student de dos colas.

En este experimento, H. pylori se cultivó en condiciones de depleción de hierro utilizando el quelante sintético dip parital a concentraciones que no inhiben significativamente el crecimiento. Las bacterias produjeron numerosos PII del sistema de secreción CAG tipo cuatro cuando se cultivaron conjuntamente con células gástricas humanas. Por el contrario, cuando está presente una fuente exógena de hierro nutriente, se reprime la formación de PII del sistema de secreción CAG tipo cuatro.

La cuantificación de la PII en la interfaz huésped-patógeno revela que en condiciones de restricción de hierro, H pylori exhibe un aumento del doble en el sistema de secreción CAG tipo cuatro PI ojo, el porcentaje de células pileadas aumenta en un 11% en comparación con las células cultivadas en medio solo. Curiosamente, aunque la actividad del sistema de secreción CAG tipo cuatro medida por la secreción de IL ocho del huésped se incrementa en condiciones de restricción de hierro y se reprime en condiciones de disponibilidad excesiva de hierro, las dimensiones de PI LI permanecen consistentes en todas las condiciones de disponibilidad de hierro. De acuerdo con la participación del sistema de secreción CAG tipo cuatro, la disponibilidad de hierro no cambia la biogénesis de PI LI en la superficie de un mutante CAG e después de su desarrollo.

Esta técnica SEM allanó el camino para que los investigadores dentro del campo del sistema de secreción CAG tipo cuatro exploraran la localización de proteínas. Con respecto a las almohadas del sistema de secreción tipo CAG cuatro. Recientemente se ha descubierto que la proteína efectora CAG a se localiza en la punta de la píldora de secreción tipo cuatro.