La evaluación de las interacciones leucocito-endotelio en condiciones de flujo en un Ex Vivo Ensayo Autoperfused Cámara Microflow
30 de diciembre de 2014
A continuación, presentamos un protocolo que permite al investigador evaluar la dinámica de reclutamiento de leucocitos ex vivo mediante la conexión de una cámara recubierta con moléculas de adhesión endoteliales derivado al sistema circulatorio de un ratón. Este método ofrece ventajas significativas ya que permite la evaluación de leucocitos en condiciones biológicas relativas.
El objetivo general de este procedimiento es crear un circuito cerrado arteriovenoso ex vivo para evaluar las interacciones de los leucocitos con las moléculas de adhesión endotelial en condiciones de flujo fisiológico. Esto se logra recubriendo primero una cámara de vidrio delgada con la molécula de adhesión endotelial de interés. En el segundo paso, los tubos de polietileno y silicona se conectan a la cámara y luego quirúrgicamente al ratón.
A continuación, la sangre de la arteria carótida se permite fluir a través del tubo. Y las interacciones posteriores de los leucocitos nativos con la cámara de vidrio recubierto se registran en tiempo real. En última instancia, los efectos de varios tratamientos sobre el desplazamiento y la velocidad de rodadura de los leucocitos a medida que interactúan con las moléculas de adhesión inmovilizadas se pueden calcular a lo largo del tiempo.
La principal ventaja de esta técnica sobre la técnica existente como el análisis por procitometría, es que con esta técnica se evalúa la interacción de los leucocitos con las moléculas endoteliales en condiciones de flujo fisiológico. El día antes del experimento, conecte un centímetro de tubo de polietileno PE 10 a una pieza de seis centímetros de tubo de silicona, seguido de cinco centímetros de tubo de polietileno. Para preparar la configuración de la tubería para el lado yugular del animal para el lado carotídeo, conecte la tubería como se acaba de demostrar con la adición de un TTU dentro del tubo de silicona de seis centímetros, aproximadamente 1,5 centímetros de distancia del tubo de polietileno de un centímetro.
A continuación, conecte un extremo de un tubo de silicona de 10 centímetros al transductor de presión e inserte el extremo T del tubo T del lado carotídeo en el otro extremo. Asegúrese de que los sitios de conexión estén apretados y sin fugas. A continuación, utilice una jeringa de un mililitro conectada a una aguja de calibre 25 para infundir cada cámara de microflujo con la proteína de recubrimiento de la superficie endotelial recién preparada de interés, y almacene las cámaras recubiertas en un tubo de 15 mililitros a cuatro grados centígrados durante la noche del día siguiente.
Para conectar el tubo yugular y carotídeo a la cámara de microflujo, conecte un tubo de silicona de un centímetro a cada lado de la cámara y luego selle las conexiones con una pequeña pieza rectangular de parámetro estirada con el tubo que se encuentra con la cámara. Utilice una jeringa para llenar la cámara y el tubo con albúmina sérica bovina al 0,1%. Y luego, después de verificar si hay fugas, incubar en la cámara durante 45 minutos.
A temperatura ambiente, cerca del final de la incubación, estabilice la cámara de microflujo en una muesca a la placa de Petri con una pequeña gota de silicona en cada muesca. A continuación, conecte los tubos yugular y carotídeo a cada lado de la cámara. Luego, mientras se seca la silicona, conecte una jeringa de bloqueo de 60 milésimas de pulgada llena de heparina al transductor de presión y pase heparina de grado 100 USP a través del tubo y la cámara hasta que no haya burbujas de aire.
Antes de conectar el ratón a la cámara de microflujo, encienda el ordenador, el microscopio y el dispositivo de registro de presión adecuado. Una vez que el software esté configurado, asegure un mouse de 10 a 12 semanas de antigüedad. En posición ventral, haga una incisión en el área del cuello con unas tijeras y luego diseccione la glándula tiroides para exponer la tráquea y los vasos.
Limpie la arteria carótida hasta que quede completamente expuesta. Teniendo cuidado de no dañar el nervio vago. A continuación, pase el pliegue de una pieza doblada de sutura por debajo de la arteria carótida y corte la sutura en el pliegue.
Por lo tanto, hay dos piezas de sutura debajo de la arteria. Enrolle cada sutura en nudos sin apretar y luego coloque las suturas para la vena yugular izquierda de la misma manera. Cuando las suturas yugulares estén en su lugar, inyecte un mililitro de heparina en el ratón ip.
Después de la inyección, apriete la sutura superior en la arteria carótida y coloque una pinza vascular lo más baja posible en la sección expuesta de la arteria. Use pinzas para sujetar la arteria por la sutura superior y luego use microtijeras finas para hacer una pequeña incisión de aproximadamente un octavo de la circunferencia de la arteria cerca de la sutura superior. Ahora inserte el tubo de la arteria carótida usando un soporte de tubo a través de la incisión hecha en la arteria y páselo por la sutura inferior.
A continuación, ata la sutura inferior seguida de la superior. Por lo tanto, la arteria se sella alrededor del tubo, haciendo varios nudos para garantizar un sellado hermético. Después de repetir el mismo procedimiento para el tubo yugular, menos la pinza del vaso, abra temporalmente la pinza del vaso en el tubo de la arteria carótida para probar el flujo.
Si no hay fugas, mueva el ratón al microscopio y conecte el tubo de la vena carotídea y yugular al tubo de la cámara de microflujo para registrar la velocidad de rodadura de los leucocitos a través de la cámara de microflujo. Suelte completamente la pinza carotídea para llenar la cámara. Permita que la sangre circule durante tres a cinco minutos para que las condiciones de flujo se estabilicen.
Mientras tanto, ajuste la platina del microscopio para que la cámara esté nivelada con el objetivo del microscopio y su borde quede paralelo a la ventana de grabación de video en la pantalla. A continuación, construya una placa de Petri con agua a temperatura ambiente y luego baje el objetivo de inmersión en agua de 10 x en la placa para que las células que fluyen a través de la cámara sean visibles, ajustando la intensidad de la luz según corresponda para simular una presión de flujo fisiológico media, ajuste la abrazadera en el tubo para que el transductor lea 30 milímetros de mercurio constantes. A continuación, pulse start para iniciar el registro tanto del tráfico de leucocitos como de la presión con el primer lapso de tiempo cerca del extremo yugular de la cámara y moviéndose contra la corriente hacia el extremo carotídeo hasta completarse.
Cuando finalice el registro, cierre la válvula en el sitio de entrada para detener el flujo sanguíneo y reemplace la cámara con una nueva cámara recubierta con una molécula de adhesión diferente si lo desea. Durante cada registro, solo se evidencian leucocitos que interactúan dentro de la cámara. Por ejemplo, en cada una de estas imágenes, las puntas de flecha blancas indican leucocitos individuales que fueron capturados por la molécula de adhesión de interés y que están rodando a lo largo de la cámara entre las otras células que fluyen libremente.
Dentro del flujo sanguíneo, se puede ver un artefacto común fuera de la cámara con las grandes esferas oscuras en todas las imágenes, lo que puede ayudar al espectador a apreciar el movimiento de los leucocitos en relación con un punto fijo. El gráfico ilustra una gráfica final de los datos. Se observó que el primer tratamiento experimental disminuía la velocidad de rodadura evidente como un desplazamiento hacia la izquierda, y el segundo tratamiento experimental aumentaba la velocidad que aparecía como un desplazamiento hacia la derecha, tanto en comparación con la velocidad de rodadura de control en combinación con este procedimiento.
Se pueden utilizar otros métodos, como el etiquetado del leucocto y vivo x Viva, para responder mejor a otras preguntas, como la contribución de la progresión de la enfermedad de ciertos subtipos de leucocitos.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para evaluar la dinámica del reclutamiento de leucocitos ex vivo mediante una cámara de microflujo conectada al sistema circulatorio de un ratón. El método permite la observación en tiempo real de las interacciones de los leucocitos con moléculas de adhesión endotelial bajo condiciones fisiológicas de flujo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunología
- Biología Vascular
Antecedentes
- El reclutamiento de leucocitos es fundamental para las respuestas inmunitarias.
- Comprender las interacciones entre leucocitos y endotelio puede orientar estrategias terapéuticas.
- Las técnicas existentes podrían no replicar con precisión las condiciones fisiológicas.
- Este protocolo tiene como objetivo abordar esas limitaciones.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la evaluación en tiempo real de la dinámica de los leucocitos.
- Evaluar los efectos de los tratamientos sobre el comportamiento de los leucocitos.
- Mejorar la comprensión de las interacciones de los leucocitos bajo condiciones de flujo.
Métodos Utilizados
- Recubrir una cámara de vidrio con moléculas de adhesión endotelial.
- Conectar la cámara al sistema circulatorio del ratón.
- Infundir sangre y registrar las interacciones de los leucocitos.
- Analizar la velocidad de rodadura y el desplazamiento de los leucocitos.
Resultados principales
- Se logró la visualización en tiempo real de las interacciones de los leucocitos.
- Se cuantificaron la velocidad de rodadura y el desplazamiento de los leucocitos.
- El método demostró ventajas frente a las técnicas tradicionales.
- Se mantuvieron con éxito las condiciones fisiológicas de flujo.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un método confiable para estudiar la dinámica de los leucocitos.
- Puede aplicarse a diversos tratamientos que afectan el comportamiento de los leucocitos.
- La técnica mejora nuestra comprensión de las respuestas inmunitarias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Estudiar las interacciones entre leucocitos y endotelio bajo condiciones fisiológicas de flujo es fundamental para reducir los riesgos asociados a dianas terapéuticas en enfermedades inflamatorias y para validar hipótesis mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Este ensayo ex vivo con cámara de microflujo autoperfundida permite la cuantificación en tiempo real de la velocidad de rodadura de los leucocitos, aportando una mayor confianza predictiva en la validación de dianas y apoyando las decisiones de avance o interrupción en programas preclínicos. Al preservar la función nativa de los leucocitos y evitar los artefactos derivados de manipulaciones ex vivo, el método mejora la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la evaluación de la expresión funcional de moléculas de adhesión leucocitaria bajo estrés cortante fisiológico.
- Valor operativo: Permite la reducción del riesgo biológico mediante la medición directa de la velocidad de rodadura leucocitaria como indicador funcional de la actividad de las moléculas de adhesión.
- Valor predictivo: Apoya la selección de proyectos al cuantificar la interacción con el blanco y los efectos mecanicistas de compuestos inmunomoduladores en un sistema relevante para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos posteriores mediante el establecimiento de perfiles de interacción de leucocitos como línea base bajo flujo controlado.
- Valor operativo: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados y reproducibles (velocidad de rodadura, desplazamiento) que permiten una evaluación confiable de compuestos en múltiples campañas.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma para probar múltiples moléculas de adhesión o candidatos terapéuticos en un entorno fisiológico consistente.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia de la enfermedad mediante el uso de leucocitos sanguíneos periféricos nativos de ratones anestesiados, preservando estados celulares similares a los in vivo.
- Valor operativo: Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al medir resultados funcionales directamente transponibles a puntos finales de microscopía intravital.
- Reducción de riesgos: Orienta decisiones de avance ajustadas al riesgo al identificar compuestos que modifican las interacciones leucocito-endoteliales bajo flujo antes de realizar estudios in vivo costosos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, permitiendo la reducción de riesgos mecanicistas antes del cribado fenotípico o de los estudios de eficacia preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar la dinámica de adhesión de leucocitos bajo flujo fisiológico, reduciendo la ambigüedad mecanicista.
- Selección: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante el recubrimiento estandarizado de cámaras y la estabilización del flujo, asegurando mediciones reproducibles de las interacciones leucocitarias.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas (velocidad de rodadura, desplazamiento) mediante el análisis con ImageJ, permitiendo comparaciones objetivas de los efectos del tratamiento en distintas condiciones experimentales.
- Investigación Traductiva: Se vincula con la continuidad preclínica al utilizar poblaciones nativas de leucocitos, preservando la relevancia fisiológica para la extrapolación a modelos de inflamación in vivo.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable para la selección de múltiples dianas o compuestos, reduciendo el desarrollo redundante de modelos y mejorando la eficiencia del flujo de trabajo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al medir el comportamiento funcional de los leucocitos bajo estrés cortante, reduciendo los falsos positivos provenientes de ensayos estáticos.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y reproducibilidad mediante condiciones de flujo controladas (30 mmHg) e imagen en tiempo real, minimizando la variabilidad entre experimentos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar conocimientos mecanicistas tempranos, reduciendo el riesgo biológico en etapas avanzadas en programas de enfermedades inflamatorias.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo al cuantificar los efectos de la modulación del objetivo, apoyando decisiones de avance basadas en datos en vías inmunomoduladoras.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía, microscopía intravital y regulación de la presión hemodinámica para mantener circuitos arteriovenosos ex vivo estables.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo un transductor de presión, un regulador de flujo Harvard Apparatus y un objetivo de inmersión en agua para la visualización de leucocitos.
- Necesita una estandarización entre equipos de los protocolos de recubrimiento de cámaras, preparación de tubos y procedimientos de heparinización para garantizar un flujo fisiológico constante.
- Implica consideraciones de adaptación al probar diferentes moléculas de adhesión endotelial o subtipos de leucocitos, lo que requiere la validación de la eficiencia y especificidad del recubrimiento.
- Las limitaciones prácticas incluyen la complejidad técnica de la canulación quirúrgica de vasos y la necesidad de modelos murinos con anestesia mantenida, lo que puede restringir el rendimiento.
