Name: Fluorescencia Basado Técnica de extensión del cebador para determinar la transcripción puntos de partida y los sitios de escisión de RNasas En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprende a identificar puntos de inicio de transcripción y sitios de escisión de ARN en bacterias mediante extensión de cebadores fluorescente. Este método utiliza secuenciación automatizada para mapear extremos 5' con alta resolución.

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Agradecemos a Anne Wochele por su ayuda en el laboratorio y a Vera Augsburger por su ayuda con el secuenciador de gel automatizado. Agradecemos a la Deutsche Forschungsgemeinschaft la financiación de las subvenciones BE4038/2 y BE4038/5 dentro de los "programas prioritarios" SPP1316 y SPP1617.

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<li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+MazF-bs+%28EndoA%29+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence%2C+UACAU%2C+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+interferases%2C+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li>
<li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+MazFSa%2C+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li>
<li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li>
<li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ompA+5%27+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li>
<li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li>
<li>Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.%2C+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.%3A+Three+New+Coagulase-Negative%2C+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.</li>
<li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li>
<li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar que presente un conflicto de intereses.

Extensión del cebador fluorescente es un método sencillo y rápido para determinar los extremos 5 &#39;de los ARN, ya sea para TSP- o identificación procesamiento del ARN secundaria. Debido a la utilización de cebadores fluorescentes, las reacciones se pueden configurar y ejecutar sin las precauciones de seguridad adicionales (a diferencia de en el caso de cebadores marcados radiactivamente). Como las muestras son detectados por fluorescencia, que pueden obtenerse imágenes, mientras que la electroforesis está en progreso...

La extensión del cebador 1 es un método molecular para determinar los extremos 5 'de moléculas de ARN específicas hasta una resolución una base. La ventaja de otros métodos tales como 5'-RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc) es el tiempo de respuesta rápido y la capacidad de analizar fácilmente una mezcla de diferentes longitudes de moléculas de ARN. Este método funciona sometiendo moléculas de ARN para revertir reacciones de transcripción utilizando cebadores fluorescentes específicas, generando fragmentos de ADNc de ciertas longitudes. Estas moléculas de ADNc se ejecutan junto tradicionales reacciones de secuenciación Sanger 2 en geles de poliacrilamida desnaturalizantes y pueden ser detectados por su fluorescencia debido a la utilización de cebadores marcados con fluorescencia. Las longitudes de los fragmentos de ADNc se evalúan por comparación con la escalera de secuenciación, lo que permite el mapeo de los extremos 5 'de ARN. Tradicionalmente, las reacciones de extensión de cebadores se utilizan en combinacióncon isótopos radioactivos para detectar moléculas de ADNc de películas de rayos X. Debido a los peligros de salud, problemas de eliminación de residuos y la facilidad de manejo, nuevos protocolos utilizan la fluorescencia para la detección de la extensión del cebador con secuenciadores automatizados, aunque su sensibilidad es ligeramente inferior. El uso de cebadores marcados con fluorescencia, el procedimiento marcado radiactivo recurrentes se puede omitir, como cebadores fluorescentes son estables durante un largo tiempo (más de un año en nuestras manos). El método se describe aquí utiliza un secuenciador automatizado de gel, pero con ligeras modificaciones, secuenciadores capilares puede también ser utilizado para la separación y detección de cDNA 3. La naturaleza paralela de análisis en gel hace que sea posible detectar incluso una pequeña cantidad de escisión de ARN o de procesamiento. Otra ventaja es la alta resolución de este método, como terminal de división o transformación de una sola base puede ser detectado. En lo que se refiere a la detección de la escisión de ARN o el procesamiento, typically dos diferentes tipos de extensiones de imprimación se distinguen. En un caso, el tratamiento enzimático se realiza in vitro usando ARN purificado y enzima purificada, mientras que en el otro caso, el procesamiento se realiza in vivo y el ARN resultante se purifica. En ambos casos, el ARN se somete a una extensión del cebador lleva a cabo in vitro, sin embargo, dependiendo de la fuente de ARN, ya sea el método se llama una extensión del cebador vivo in vitro o in. En el protocolo que presentamos aquí, nos centramos únicamente en la extensión del cebador en vivo, debido a la facilidad de uso (no hay proteínas purificadas necesario) y la posibilidad de determinar los puntos de partida de la transcripción y procesamiento a la vez. Sin embargo, in vitro extensiones de cebadores son, en principio, establecer la misma manera y este protocolo pueden servir como punto de partida. El método ilustrado aquí se puede aplicar a muchas especies bacterianas mientras que son susceptibles de altopreparación pureza y alto rendimiento de los ácidos nucleicos. La investigación en nuestro laboratorio se centra en el alcance de la regulación de la toxina-antitoxina (TA) sistemas de 4,5, un campo en el que se utiliza ampliamente el método de extensión del cebador. TA-sistemas son pequeños elementos genéticos presentes en los genomas de procariotas que constan de una proteína tóxica estable y endógena activa y una proteína o ARN antitoxina en su mayoría inestables que contrarresta la toxicidad 6,7. Actividad de la toxina a veces se ejerce mediante la inhibición de la replicación, síntesis de la pared celular u otros mecanismos, pero más a menudo por la actividad de RNasa 8,9. Típicamente, la especificidad de RNasa se determina mediante la realización de diferentes pruebas, uno de los cuales es el método de extensión del cebador. Reacciones de extensión de cebador son muy adecuados para esta aplicación, como una mezcla de fragmentos de longitud escindidos y completo se puede analizar de forma simultánea para determinar sus extremos 5 '. Usando una mezcla de in vitro e in vivo extensiones de cebadores, latoxina RNasa escisión específica, por ejemplo, la especificidad de secuencia se puede determinar 10-13. <img alt="Extensión de cebadores, aislamiento de ARN, síntesis de ADNc, secuenciación de Sanger, diagrama de electroforesis en gel." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Descripción general del procedimiento de extensión del cebador. Los cultivos bacterianos se incubaron y tratados de acuerdo con las necesidades experimentales. El ARN total se extrajo de las células, se trató con DNasa I para eliminar las trazas de ADN y se sometieron a una reacción de transcripción inversa usando cebadores fluorescentes específicos diana de ADN rendimiento de ADNc. El ADN genómico o plásmidos se extrajeron y posteriormente utilizarse para reacciones de secuenciación Sanger fluorescentes para la comparación de tamaño con los fragmentos de ADNc. Productos de extensión del cebador se ejecutan junto a los productos de secuenciación de Sanger en un gel de poliacrilamida desnaturalizante de urea y se analizaron con un láser automatizado y el microscopio. La base de la secuencia que se alinea con la banda de ADNc es la last base del extremo 5 'de ADNc (flecha azul). Más información en Fekete, et al. 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> Una visión general de todo el procedimiento de extensión del cebador se puede encontrar en la Figura 1. Brevemente, las células bacterianas se cultivan, cosechado, el sedimento de células se lisaron y el ARN extraído. ARN purificado se trata a continuación con DNasa I para eliminar trazas de moléculas de ADN que podrían actuar como plantillas para la transcriptasa inversa. Cebadores fluorescentes específicos se añaden a la ARN, hibridado a la región de interés y posteriormente a transcripción inversa, lo que resulta en ADN complementario monocatenario (ADNc). Una escalera de secuenciación se crea mediante secuenciación Sanger tradicional empleando cebadores fluorescentes y se separó en un gel de poliacrilamida desnaturalizante junto de los fragmentos de ADNc de extensión del cebador. La resultantegel se analizó mediante la comparación de las bandas fluorescentes, lo que permite la identificación de los extremos 5 'de interés. Puntos de partida de la transcripción y sitios de procesamiento son luego evaluados individualmente por comparación de secuencias.

<table><tbody><tr><td>AMV Transcriptasa Inversa (20-25 U/&micro; l)</td> <td>NEB / Roche</td><td>NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I (libre de RNasa)</td><td>Ambion (tecnologías de vida)</td><td>AM2222</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 Instrumento&nbsp;</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Imprimaciones marcadas con fluorescencia</td><td>Biomers</td><td>n/a</td><td>5' DY-681 modificación de " ordinario" Oligonucleótidos de ADN. Los tintes compatibles, como el LICOR IRDye 700/800, también están disponibles en otros proveedores, como IDTdna.</td></tr><tr><td>Secuenciador Li-Cor 4200 incl. ImagIR Software de recopilación de datos</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>Producto descatalogado</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit de preparación de plásmidos</td><td>QIAGEN</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>RapidGel-XL-40% Concentrado</td><td>USB</td><td>US75863</td><td></td></tr><tr><td>TAMPÓN DE ALMACENAMIENTO DE ARN</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Aqua-P/C/I</td><td>Carl Roth</td><td>X985.3</td><td>Alternativa: " Ácido-fenol: cloroformo, pH 4.5 (con IAA, 125:24:1)" de Ambion (AM9720)</td></tr><tr><td>SUPERase&bull; En el kit</td> de secuenciación del ciclo de cebado marcado con fluorescencia AM2696 Inhibidor de RNasa <td>Ambion (tecnologías de vida)</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sequenase con fluorescencia con 7-deaza-dGTP</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2538</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>reactivo life technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia/Perlas de sílice 0,1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencia basado técnica de extensión del cebador para determinar la transcripción puntos de partida y los sitios de escisión de rnasas en vivo

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

Fluorescencia de extensión del cebador basado (FPE) es un método molecular para determinar los puntos de partida de la transcripción o sitios de procesamiento de moléculas de ARN. Esto se consigue mediante la transcripción inversa del ARN de interés usando cebadores marcados con fluorescencia específicos y el análisis posterior de los fragmentos de ADNc resultantes mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida. Simultáneamente, una reacción tradicional de secuenciación de Sanger se ejecuta en el gel para mapear los extremos de los fragmentos de ADNc a sus bases correspondientes exactas. En contraste con 5&#39;-RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc), donde el producto debe ser clonado y secuenciado múltiples candidatos, la mayor parte de fragmentos de ADNc generados por la extensión del cebador se puede detectar simultáneamente en una carrera gel. Además, todo el procedimiento (de la transcripción inversa para el análisis final de los resultados) se puede completar en un día laborable. Mediante el uso de cebadores marcados con fluorescencia, el uso de isótopos radiactivos peligrosos reactivos marcadosse pueden evitar y los tiempos de procesamiento se reducen como productos pueden ser detectados durante el procedimiento de electroforesis. En el siguiente protocolo, se describe un método de extensión de cebador fluorescente in vivo para detectar de forma fiable y rápida los extremos 5 &#39;de los ARN para deducir puntos de partida de la transcripción y sitios de procesamiento del ARN (por ejemplo, por componentes del sistema toxina-antitoxina) en S. aureus, E. coli y otras bacterias.

Como se representa en la figura 6, una reacción de extensión del cebador se puede utilizar para determinar los puntos de partida de la transcripción de las transcripciones de interés y puede ayudar a deducir regiones promotoras (normalmente identificado por -10 y -35 elementos). El fragmento de ADNc más alta (más larga) representa el extremo 5 'del ARNm y por lo tanto se puede asignar fácilmente cuando se compara con la escalera de secuenciación. <img alt="inicio de transcrip...

Describimos aquí un método de extensión de cebadores basado en fluorescencia para determinar los puntos de partida transcripcionales a partir de transcripciones bacterianas y el procesamiento de ARN in vivo utilizando un secuenciador de gel automatizado.

Fluorescencia Basado Técnica de extensión del cebador para determinar la transcripción puntos de partida y los sitios de escisión de RNasas En Vivo

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar los puntos de partida transcripcionales y los sitios de escisión de ARN in vivo de bacterias mediante una reacción de extensión de cebador fluorescente. Esto se logra cultivando primero bacterias como E. coli o S. aria, y aislando las moléculas de ARN. A continuación, el ARN se transcribe de forma inversa utilizando cebadores fluorescentes específicos y transcriptasa inversa, lo que da lugar a fragmentos de CD NA.A continuación, se aísla el ADN o los plásmidos de las células bacterianas y se crea una escalera de secuenciación fluorescente de Sanger a partir de la plantilla de ADN utilizando un kit de secuenciación. Finalmente, los fragmentos de CDNA y las escaleras de secuenciación se separan y se detectan simultáneamente en un gel de poliacrilamida utilizando un secuenciador de gel automatizado y se comparan entre sí. En última instancia, la extensión de cebador fluorescente se utiliza para mapear los cinco extremos primarios de las moléculas de ARN hasta una resolución de una base.La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos, como la extensión primaria basada en la raza o la radiactividad, es la rápida identificación de los cinco extremos de las moléculas de ARN, ya que la detección se produce simultáneamente durante la electroforesis. La sensibilidad es similar a las extensiones primarias basadas en la actividad roja, pero permite al personal de laboratorio utilizar este método sin necesidad de capacitación en seguridad radiológica de tasa de actividad. Hemos utilizado con éxito esta técnica de extensión primaria fluorescente para investigar los componentes de los ARN de los sistemas de toxinas y antitoxinas.Los estafilococos que demostrarán el procedimiento serán Christopher Schuster, un estudiante graduado de mi laboratorio. Después de preparar un alto rendimiento de ARN y diseñar cebadores de acuerdo con el protocolo de texto, lleve a cabo la reacción de extensión del cebador precalentando primero el termociclador a 95 grados centígrados. Para cada muestra de ARN, mezcle los siguientes compuestos en un tubo de PCR, desnaturalice las muestras durante un minuto a 95 grados centígrados.A continuación, coloque los tubos en hielo durante cinco minutos para hibridar los cebadores y el ARN. A continuación, configure la máquina de PCR a 47 grados centígrados. A continuación, prepare la mezcla maestra de transcripción inversa como se describe aquí.Agregue cuatro microlitros, una mezcla maestra de transcripción inversa a cada muestra de ARN hibridado e incube los tubos durante una hora a 47 grados Celsius. Para detener la reacción, caliente las muestras a 95 grados centígrados durante dos minutos. A continuación, añade seis microlitros de tinte de carga de forma amida y guárdalo durante la noche o hasta dos semanas en la oscuridad a menos 20 grados centígrados.Después de preparar el ADN genómico o los plásmidos, de acuerdo con el protocolo de texto, ensamble la reacción de secuenciación de Sanger mezclando 12 microlitros de aproximadamente 10 a 15 microgramos de ADN genómico o 100 a 500 nanogramos de ADN plasmídico con un microlitro de cebador marcado con fluorescencia y un microlitro de pipeta DMSO. Un microlitro de cada mezcla de secuenciación en tubos de PCR premarcados separados. A continuación, añada tres microlitros de la mezcla de cebador D-N-A-D-M-S-O a cada tubo.Configure la máquina de PCR en el siguiente programa y ejecútela después de colocar las muestras en la máquina. Después de la ejecución, agregue seis microlitros de tinte de carga a las muestras y luego en hielo. Si se usa de inmediato o a menos 20 grados Celsius a largo plazo usando placas de 25 centímetros limpias y libres de polvo, coloque espaciadores de 0,25 milímetros en la placa de vidrio trasera y baje la placa de vidrio con muescas en la parte superior con el extremo con muescas de las placas de vidrio y los pilotos de entrada al riel hacia arriba.Coloque los rieles de gel a ambos lados de las placas de vidrio y apriete ligeramente las perillas para fundir el gel. Combine los compuestos enumerados aquí en un vaso de precipitados con una barra de agitación y colóquelos en una placa de agitación magnética. Inmediatamente después de agregar un PS y equipo, use una jeringa de 50 mililitros para absorber la solución de acrilamida y coloque un filtro de 0,45 nanómetros en la punta.Coloque las placas intercaladas en un ángulo de 10 a 20 grados y dispense lentamente la solución de gel entre las placas de vidrio mientras mueve continuamente la punta de la jeringa de un lado a otro. Deje de dispensar la solución de gel una vez que llegue al extremo inferior de las placas de vidrio. Con un gancho de burbujas, retire las burbujas que se hayan formado.Luego, deslice el espaciador de bolsa de gel entre las placas de vidrio en el extremo con muescas, sumergiéndolo en la solución de gel y fijándolo fijando la placa de fundición, apriete ligeramente los tornillos del riel superior y deje que el gel se asiente durante una o dos horas. Antes de quitar la placa de fundición y el espaciador de bolsillo, use agua destilada desionizada para limpiar el bolsillo de residuos de sal y gel para hacer funcionar el gel. Deslice el soporte del tanque de compensación en los rieles de gel en las placas de vidrio frontales y apriete las perillas.Coloque el gel en el tanque de gel inferior del generador de imágenes de gel automatizado contra la placa calefactora y fíjelo deslizando el piloto de entrada del riel en los soportes del aparato. Utilice un tampón XTBE para llenar las cámaras tampón de gel superior e inferior. A continuación, cierre la cámara intermedia inferior y utilice el cable de alimentación para conectar la cámara intermedia superior a la alimentación.Si hay sal en la bolsa de gel, use un tampón para pipetear repetidamente la bolsa para limpiarla. A continuación, utilice la tapa del depósito intermedio superior para cerrar la cámara del depósito intermedio superior. Después de encender el generador de imágenes y la computadora e iniciar el software de recopilación de datos IR de imagen base de acuerdo con el protocolo de texto, use la configuración que se enumera aquí para configurar el control del escáner.A continuación, haga funcionar previamente el gel vacío durante 20 minutos seleccionando voltaje activado y pulsando Enter. Mientras tanto, con una máquina de PCR, caliente la escalera de secuenciación y los productos de extensión de cebador a 90 grados centígrados durante dos minutos Antes de enfriar en hielo, detenga la electroforesis, abra el secuenciador de gel automatizado y retire la tapa superior del tanque intermedio. Luego inserte el peine de dientes de tiburón entre las placas de vidrio y con los dientes de tiburón.Perfore ligeramente la pipeta de gel de uno a dos microlitros de los productos de extensión de cebador o secuenciar las reacciones de escalera en cada bolsa de gel. Para los bolsillos vacíos. Use tinte de carga para llenarlos para evitar un comportamiento de funcionamiento inconsistente, cierre el tanque de compensación y la puerta del secuenciador de gel.A continuación, inicie la electroforesis seleccionando el voltaje activado para el láser, seleccione el estado de escaneo activado y pulse Intro. Una vez que la región de interés haya pasado por el láser, detenga la electroforesis como se muestra aquí. Se puede utilizar una reacción de extensión de cebador para determinar los puntos de inicio transcripcionales o TSP de las transcripciones de interés y puede ayudar a deducir las regiones promotoras.En este ejemplo, el TSP del ARNm de MPE se identificó como G consistente con los datos publicados anteriormente. Se dedujo que los elementos promotores de menos 35 y menos 10 son T-T-G-T-A-A y T-A-G-A-C-T, y estos motivos difieren solo en las bases de cada una de sus secuencias de consenso utilizando la extensión del cebador para identificar los productos de escisión del ARNm. El mapeo de ARN de la escisión cerca del START co on por el ARN Ybi SEC two se muestra aquí cuando los ARN no están presentes o inactivos, no se forman productos de extensión de cebadores cerca del inicio co on como resultado de la actividad de los ARN.Sin embargo, aparecen dos bandas fuertes justo aguas abajo de la capa de inicio, en esta figura se muestra un experimento fallido de extensión de cebador debido al exceso de ARN en la reacción de transcripción inversa que impide la identificación de bandas individuales. Esto demuestra que la cantidad total de ARN molde debe ajustarse a la abundancia del ARN de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo dilucidar los puntos de inicio transcripcionales y los sitios de escisión de ARN in vivo usando cebadores fluorescentes y un secuenciador de gel automatizado con algo de práctica.Este método es rápido y fácil de realizar. Buena suerte con tus experimentos.

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Se describen los métodos de photobleaching incluyendo recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) y la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP) para controlar la dinámica de la cromatina de proteínas en células madre embrionarias (ES) las células. Dinámica de la cromatina proteína, que es considerado como uno de los medios para estudiar la plasticidad de la cromatina, es mayor en las células pluripotentes.

Photobleaching ensayos (FRAP y FLIP) para medir la dinámica de la cromatina de proteínas en células vivas madre embrionarias

Recientemente hemos informado de un nuevo enfoque para la generación de sondas fluorogénicos DNAzyme que se pueden aplicar para crear un simple, "mezclar y leer" ensayo de inmunofluorescencia para la detección de bacterias. Estas sondas de ADN especiales catalizar la escisión de un cromóforo modificado con ADN-ARN sustrato quimérico en la presencia de la mezcla bruta extracelular (CEM), producida por una bacteria específica, con lo que la traducción de detección de bacterias en la generación de...

La detección de bacterias mediante ADNzimas fluorogénicos

Las exonucleasas desempeñan un papel fundamental para garantizar la estabilidad del genoma. La pérdida de la función de la exonucleasa WRN provoca un envejecimiento prematuro. El estudio de los sustratos y otros requisitos de la nucleasa in vitro puede ayudar a dilucidar su papel in vivo. Aquí demostramos un ensayo rápido y reproducible basado en fluorescencia para medir su actividad nucleasa.

Un ensayo de exonucleasa basado en fluorescencia para caracterizar DmWRNexo, ortólogo de la exonucleasa WRN progeroide humana, y su aplicación a otras nucleasas

Ratiometric balizas bimoleculares (RBMBs) se pueden utilizar para los transcritos de ARN de ingeniería imagen individuales en las células vivas. Aquí se describe la preparación y purificación de RBMBs, entrega de RBMBs en las células mediante formación de microporos y la imagen fluorescente de transcritos de ARN individuales en tiempo real.

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

En este trabajo proporcionamos un flujo de trabajo experimental de cómo se pueden identificar y validar experimentalmente los potenciadores activos.

Predicción y validación de los elementos reguladores de genes activados durante ácido retinoico inducida por la diferenciación de células madre embrionarias

Aquí, describimos el conjunto de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II (Pol II) que requieren sólo ADN sintético corto y oligonucleótidos de ARN y Pol II purificado. Estos complejos son útiles para estudiar los mecanismos subyacentes al procesamiento co-transcripcional de transcripciones asociadas con el complejo de elongación Pol II.

Complejos de alargamiento de ARN polimerasa artificial II para disecar eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional

La hibridación in situ de fluorescencia de ARN de molécula única (smFISH) es un método para cuantificar con precisión los niveles y la localización de ARN específicos a nivel de una sola célula. Aquí, informamos nuestros protocolos de laboratorio validados para el procesamiento de bancos húmedos, imágenes y análisis de imágenes para la cuantificación de células individuales de ARN específicos.

Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

Las metiltransferasas de ADN son posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Aquí, se presenta un protocolo para evaluar moléculas pequeñas para la inhibición de la metiltransferasa de ADN. Este ensayo utiliza una endonucleasa para acoplar la metilación del ADN a la generación de fluorescencia y permite monitorear la actividad enzimática en tiempo real.

Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

Este estudio presenta un ensayo FRET radiométrico simple y fácil de usar para la detección y evaluación cuantitativa de la actividad de la ADNasa, y demuestra su aplicación en el análisis de una nucleasa débil.

Evaluación de la actividad de la ADNasa mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia radiométrica

Este protocolo mide cuantitativamente la estabilidad y la vida media de ARN potenciadores intergénicos e intragénicos en células madre embrionarias de ratón mediante tratamiento con Actinomicina D, RT-qPCR y análisis de regresión no lineal. Se incorporan estrategias de normalización específicas por posición para modelar con precisión la dinámica de desintegración del ARNe de manera dependiente del contexto.

Evaluación cuantitativa optimizada de la estabilidad del ARN potenciador en células madre embrionarias de ratón

Aprende a identificar puntos de inicio de transcripción y sitios de escisión de ARN en bacterias mediante extensión de cebadores fluorescente. Este método utiliza secuenciación automatizada para mapear extremos 5' con alta resolución.

Fluorescencia Basado Técnica de extensión del cebador para determinar la transcripción puntos de partida y los sitios de escisión de RNasas En Vivo (Video) | JoVE Journal

Fluorescencia Basado Técnica de extensión del cebador para determinar la transcripción puntos de partida y los sitios de escisión de RNasas En Vivo

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