Fluorescencia Basado Técnica de extensión del cebador para determinar la transcripción puntos de partida y los sitios de escisión de RNasas En Vivo

El objetivo general de este procedimiento es identificar los puntos de partida transcripcionales y los sitios de escisión de ARN in vivo de bacterias mediante una reacción de extensión de cebador fluorescente. Esto se logra cultivando primero bacterias como E. coli o S. aria, y aislando las moléculas de ARN. A continuación, el ARN se transcribe de forma inversa utilizando cebadores fluorescentes específicos y transcriptasa inversa, lo que da lugar a fragmentos de CD NA.

A continuación, se aísla el ADN o los plásmidos de las células bacterianas y se crea una escalera de secuenciación fluorescente de Sanger a partir de la plantilla de ADN utilizando un kit de secuenciación. Finalmente, los fragmentos de CDNA y las escaleras de secuenciación se separan y se detectan simultáneamente en un gel de poliacrilamida utilizando un secuenciador de gel automatizado y se comparan entre sí. En última instancia, la extensión de cebador fluorescente se utiliza para mapear los cinco extremos primarios de las moléculas de ARN hasta una resolución de una base.

La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos, como la extensión primaria basada en la raza o la radiactividad, es la rápida identificación de los cinco extremos de las moléculas de ARN, ya que la detección se produce simultáneamente durante la electroforesis. La sensibilidad es similar a las extensiones primarias basadas en la actividad roja, pero permite al personal de laboratorio utilizar este método sin necesidad de capacitación en seguridad radiológica de tasa de actividad. Hemos utilizado con éxito esta técnica de extensión primaria fluorescente para investigar los componentes de los ARN de los sistemas de toxinas y antitoxinas.

Los estafilococos que demostrarán el procedimiento serán Christopher Schuster, un estudiante graduado de mi laboratorio. Después de preparar un alto rendimiento de ARN y diseñar cebadores de acuerdo con el protocolo de texto, lleve a cabo la reacción de extensión del cebador precalentando primero el termociclador a 95 grados centígrados. Para cada muestra de ARN, mezcle los siguientes compuestos en un tubo de PCR, desnaturalice las muestras durante un minuto a 95 grados centígrados.

A continuación, coloque los tubos en hielo durante cinco minutos para hibridar los cebadores y el ARN. A continuación, configure la máquina de PCR a 47 grados centígrados. A continuación, prepare la mezcla maestra de transcripción inversa como se describe aquí.

Agregue cuatro microlitros, una mezcla maestra de transcripción inversa a cada muestra de ARN hibridado e incube los tubos durante una hora a 47 grados Celsius. Para detener la reacción, caliente las muestras a 95 grados centígrados durante dos minutos. A continuación, añade seis microlitros de tinte de carga de forma amida y guárdalo durante la noche o hasta dos semanas en la oscuridad a menos 20 grados centígrados.

Después de preparar el ADN genómico o los plásmidos, de acuerdo con el protocolo de texto, ensamble la reacción de secuenciación de Sanger mezclando 12 microlitros de aproximadamente 10 a 15 microgramos de ADN genómico o 100 a 500 nanogramos de ADN plasmídico con un microlitro de cebador marcado con fluorescencia y un microlitro de pipeta DMSO. Un microlitro de cada mezcla de secuenciación en tubos de PCR premarcados separados. A continuación, añada tres microlitros de la mezcla de cebador D-N-A-D-M-S-O a cada tubo.

Configure la máquina de PCR en el siguiente programa y ejecútela después de colocar las muestras en la máquina. Después de la ejecución, agregue seis microlitros de tinte de carga a las muestras y luego en hielo. Si se usa de inmediato o a menos 20 grados Celsius a largo plazo usando placas de 25 centímetros limpias y libres de polvo, coloque espaciadores de 0,25 milímetros en la placa de vidrio trasera y baje la placa de vidrio con muescas en la parte superior con el extremo con muescas de las placas de vidrio y los pilotos de entrada al riel hacia arriba.

Coloque los rieles de gel a ambos lados de las placas de vidrio y apriete ligeramente las perillas para fundir el gel. Combine los compuestos enumerados aquí en un vaso de precipitados con una barra de agitación y colóquelos en una placa de agitación magnética. Inmediatamente después de agregar un PS y equipo, use una jeringa de 50 mililitros para absorber la solución de acrilamida y coloque un filtro de 0,45 nanómetros en la punta.

Coloque las placas intercaladas en un ángulo de 10 a 20 grados y dispense lentamente la solución de gel entre las placas de vidrio mientras mueve continuamente la punta de la jeringa de un lado a otro. Deje de dispensar la solución de gel una vez que llegue al extremo inferior de las placas de vidrio. Con un gancho de burbujas, retire las burbujas que se hayan formado.

Luego, deslice el espaciador de bolsa de gel entre las placas de vidrio en el extremo con muescas, sumergiéndolo en la solución de gel y fijándolo fijando la placa de fundición, apriete ligeramente los tornillos del riel superior y deje que el gel se asiente durante una o dos horas. Antes de quitar la placa de fundición y el espaciador de bolsillo, use agua destilada desionizada para limpiar el bolsillo de residuos de sal y gel para hacer funcionar el gel. Deslice el soporte del tanque de compensación en los rieles de gel en las placas de vidrio frontales y apriete las perillas.

Coloque el gel en el tanque de gel inferior del generador de imágenes de gel automatizado contra la placa calefactora y fíjelo deslizando el piloto de entrada del riel en los soportes del aparato. Utilice un tampón XTBE para llenar las cámaras tampón de gel superior e inferior. A continuación, cierre la cámara intermedia inferior y utilice el cable de alimentación para conectar la cámara intermedia superior a la alimentación.

Si hay sal en la bolsa de gel, use un tampón para pipetear repetidamente la bolsa para limpiarla. A continuación, utilice la tapa del depósito intermedio superior para cerrar la cámara del depósito intermedio superior. Después de encender el generador de imágenes y la computadora e iniciar el software de recopilación de datos IR de imagen base de acuerdo con el protocolo de texto, use la configuración que se enumera aquí para configurar el control del escáner.

A continuación, haga funcionar previamente el gel vacío durante 20 minutos seleccionando voltaje activado y pulsando Enter. Mientras tanto, con una máquina de PCR, caliente la escalera de secuenciación y los productos de extensión de cebador a 90 grados centígrados durante dos minutos Antes de enfriar en hielo, detenga la electroforesis, abra el secuenciador de gel automatizado y retire la tapa superior del tanque intermedio. Luego inserte el peine de dientes de tiburón entre las placas de vidrio y con los dientes de tiburón.

Perfore ligeramente la pipeta de gel de uno a dos microlitros de los productos de extensión de cebador o secuenciar las reacciones de escalera en cada bolsa de gel. Para los bolsillos vacíos. Use tinte de carga para llenarlos para evitar un comportamiento de funcionamiento inconsistente, cierre el tanque de compensación y la puerta del secuenciador de gel.

A continuación, inicie la electroforesis seleccionando el voltaje activado para el láser, seleccione el estado de escaneo activado y pulse Intro. Una vez que la región de interés haya pasado por el láser, detenga la electroforesis como se muestra aquí. Se puede utilizar una reacción de extensión de cebador para determinar los puntos de inicio transcripcionales o TSP de las transcripciones de interés y puede ayudar a deducir las regiones promotoras.

En este ejemplo, el TSP del ARNm de MPE se identificó como G consistente con los datos publicados anteriormente. Se dedujo que los elementos promotores de menos 35 y menos 10 son T-T-G-T-A-A y T-A-G-A-C-T, y estos motivos difieren solo en las bases de cada una de sus secuencias de consenso utilizando la extensión del cebador para identificar los productos de escisión del ARNm. El mapeo de ARN de la escisión cerca del START co on por el ARN Ybi SEC two se muestra aquí cuando los ARN no están presentes o inactivos, no se forman productos de extensión de cebadores cerca del inicio co on como resultado de la actividad de los ARN.

Sin embargo, aparecen dos bandas fuertes justo aguas abajo de la capa de inicio, en esta figura se muestra un experimento fallido de extensión de cebador debido al exceso de ARN en la reacción de transcripción inversa que impide la identificación de bandas individuales. Esto demuestra que la cantidad total de ARN molde debe ajustarse a la abundancia del ARN de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo dilucidar los puntos de inicio transcripcionales y los sitios de escisión de ARN in vivo usando cebadores fluorescentes y un secuenciador de gel automatizado con algo de práctica.

Este método es rápido y fácil de realizar. Buena suerte con tus experimentos.