Optimización de unión de las células madre mesenquimales humanas en poli (ε-caprolactona) electrohiladas Hilos

En este procedimiento, los andamios PCL electrohilados se configuran de diferentes maneras para determinar una configuración óptima de siembra de celdas. En primer lugar, los andamios estériles se colocan en las diferentes configuraciones que se están investigando, incluidos los insertos de cultivo celular, los canales y los recipientes rotativos del biorreactor. Una vez en su lugar, se siembra un número conocido de células en el andamio y luego se dejan sin perturbar durante 20 minutos.

Luego, todas las muestras se trasladan cuidadosamente a una incubadora, se configuran al 5% de dióxido de carbono y a 37 grados centígrados, y se someten a condiciones estáticas o dinámicas antes de horas. Después de este tiempo de cultivo, el número de células que se han adherido al andamio se determina mediante un ensayo de ADN para cuantificar la cantidad de células en el medio del andamio y las fracciones del pozo. En última instancia, esto se logra cuantificando el ADN presente en el andamio, el pocillo y en los medios circundantes para ver la unión de las células a los andamios se utiliza microscopía electrónica de barrido o SEM.

Tuvimos la idea de esta investigación cuando supimos que nuestros andamios no cubrían toda la base de la placa del pocillo, lo que significaba que existía la posibilidad de que no todas las celdas estuvieran en contacto con el andamio y, por lo tanto, pudieran adherirse. Para comenzar, configure los insertos de cultivo celular bajo el flujo de la lámina abriendo los insertos de cultivo celular estériles de seis pocillos y separando los anillos más cortos con dientes de los cuerpos anillados más anchos. A continuación, toma el anillo con los dientes apuntando hacia arriba y coloca uno de los andamios de cuatro centímetros sobre el centro del anillo, asegurándote de que se superponga en ambos lados.

Tome el cuerpo anillado y colóquelo sobre el anillo de dientes y el andamio. Luego empuje hacia abajo, asegurándose de que el andamio permanezca en su posición y quede a través del centro del cultivo celular. Insertar. Coloque el inserto de cultivo celular con andamio en el pocillo de una placa de unión baja de seis pocillos y agregue 10 mililitros de medio de cultivo al andamio.

A continuación, coloque los comederos de politetrafluoroetileno en placas de Petri individuales y añada 10 mililitros de medios de cultivo al comedero. Con pinzas, coloque uno de los andamios de tres centímetros en el canal, asegurándose de que su longitud quede paralela al borde más largo del canal. Para configurar el recipiente del biorreactor bajo el flujo de lámina, dispense 10 mililitros de solución salina estéril tamponada con fosfato o PBS a través del puerto principal del recipiente del biorreactor.

Después de 10 minutos, retire el PBS y reemplácelo con ocho mililitros de medio de cultivo con pinzas. Inserte uno de los andamios de tres centímetros en el recipiente a través del puerto principal. A continuación, posa fuera del puerto principal.

Después de realizar el recuento de células madre mesenquimales humanas como se describe en el protocolo de texto, aspire el medio del tubo de centrífuga dejando la célula y reemplácelo con el volumen de medio calculado. Resus suspende las celdas y los medios para una mezcla uniforme. Con una pipeta Gilson P 200, dispense lentamente 200 microlitros de suspensión celular en cada andamio pasando la punta de la pipeta a lo largo del andamio y por debajo de la superficie del líquido del medio.

Déjelo reposar durante 20 minutos, o los recipientes del biorreactor dispensarán 200 microlitros de la suspensión celular a través del puerto principal. Rellene los dos mililitros restantes de medio de cultivo por los puertos de la jeringa para obtener un volumen total de 10 mililitros. A continuación, transfiera los recipientes del biorreactor al biorreactor de recipiente giratorio y configúrelo para que gire.

A nueve RPM, transfiera las placas de pocillos con insertos y canales de cultivo celular a la placa agitadora y configúrelo para que gire a 30 RPM en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius o al cultivo estático. Transfiera las placas de pocillos con los insertos y canales de cultivo celular al estante de una incubadora de cultivo celular. Fijado a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Después de cuatro horas, retire las muestras de la incubadora y colóquelas bajo el flujo de lámina. A continuación, retire las fracciones de medios de todas las muestras y colóquelas en tubos de centrífuga etiquetados por separado. Después de la centrifugación durante cinco minutos a 241 veces G, retire el supinato antes de agregar tres mililitros de vórtice tampón de lisis, la solución para romper la célula de pellets los andamios contenidos dentro de los insertos de cultivo celular Primero, libere el andamio cortando el andamio cerca del borde de los insertos con un andamio.

Luego, con pinzas, retire los andamios y colóquelos en tubos de centrífuga que contengan tres mililitros de tampón de lisis. Luego agregue tres mililitros de tampón de lisis a cada receptáculo de andamio y raspe la superficie. Retire el tampón de lisis y colóquelo en tubos de centrífuga etiquetados por separado.

Agite cada tubo de centrífuga durante aproximadamente un minuto para asegurar una agitación suficiente y fomentar la lisis de la membrana celular. En una placa negra de 96 pocillos, agregue 100 microlitros de tampón de lisis para cada medio de andamio de fracción de muestra, y luego, en la oscuridad, agregue 100 microlitros de solución de ADN celular a todos los pocillos que contengan tampón de lisis y mezcle. Incluya suavemente los pocillos con tampón de lisis que no contenga ADN y solución de ADN celular para proporcionar un control negativo y positivo de la placa de pocillos.

Usando un lector de placas de fluorescencia, mida la absorbancia de los pocillos a una excitación de 485 nanómetros y una emisión de 520 nanómetros. Compare los datos con la curva estándar generada a partir de los estándares de ADN según las instrucciones del fabricante para realizar la fijación SEM. Después de cuatro horas de incubación, retire todos los andamios de sus receptáculos y colóquelos dentro de pocillos separados de una nueva placa de seis pocillos y un flujo de lámina.

A continuación, lave los andamios dos veces con PBS a cada uno. Pues añada dos mililitros de glutaraldehído al 1,5% en PBS para asegurar una cobertura completa en el andamio. Deje la placa durante un mínimo de 30 minutos a cuatro grados centígrados para la fijación de la celda.

Retire la solución fijadora y lave los andamios dos veces con PBS. Luego transfiera los andamios a una nueva placa de pozo para deshidratarlos con concentraciones crecientes de etanol en agua destilada, comenzando con 50% de etanol seguido de 70% y luego 90% para cada concentración. Sumerja completamente los andamios en solución y déjelos actuar durante tres minutos antes de desechar la solución y repetir.

Una vez deshidratados los andamios en etanol al 100% sumergiendo completamente los andamios en solución y dejándolos actuar durante cinco minutos, desechar la solución y repetir el secado químico de los andamios. Usando HMDS dentro de una vitrina de gases. Sumerja los andamios en HMDS y déjelos actuar durante cinco minutos antes de retirar el HMDS después de repetir una vez.

Retire el HMDS y deje que los andamios se sequen. A continuación, monte los andamios en talones de SEM disponibles en el mercado para facilitar la visualización dentro de la capa de SEM, las muestras con una capa de observador de oro durante dos minutos para garantizar una cobertura fina y uniforme. Finalmente, coloque las muestras dentro del SEM y visualice los andamios asentados en la celda utilizando un haz de electrones de bóveda de electrones de cinco kilos.

Los resultados destacan la ubicación de las celdas después de cuatro horas después de la siembra para cada configuración experimental investigada. Esta figura muestra el porcentaje de celdas que se han adherido a la superficie del andamio durante este tiempo en el que se investigaron todas las configuraciones de siembra. El porcentaje de adherencia celular es relativamente bajo, pero la mayor adherencia celular para los andamios sostenidos dentro de los insertos de cultivo celular y agitados a 30 RPM.

La adherencia más baja fue para los andamios mantenidos dentro de los insertos de cultivo celular y mantenidos en condiciones estáticas. Había un gran número de células presentes dentro de la fracción de medios, sobre todo para el cultivo celular. Los insertos sostenidos dentro de placas de unión bajas al 50% y los recipientes giratorios al 51%Los andamios sostenidos dentro de los canales mostraron un mayor número de celdas presentes dentro del propio soporte.

48% para agitador de canal y 50% para escaneo estático de canal. La electromicroscopía permitió una evaluación visual de los andamios sembrados en las células. Las imágenes representativas destacaron una presencia limitada de células en la superficie fibrosa, independientemente de la configuración de la siembra.

Sin embargo, un mayor número de células y aglomerados celulares estaban presentes en los andamios sostenidos dentro de los insertos de cultivo celular y agitados a 30 RP M. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de que sembrar un número conocido de células no necesariamente equivale a que tantas células se adhieran realmente al andamio, especialmente para los andamios que no cubren toda la base de las placas silvestres. Para andamios como estos, se recomienda que primero se optimicen las diferentes configuraciones de siembra de celdas para maximizar la unión inicial de la celda al andamio.