Name: Detección de In Situ Complejos proteína-proteína en la Drosophila Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprende a detectar interacciones proteína-proteína in situ en la unión neuromuscular larval de Drosophila mediante ensayo de ligadura de proximidad. Esta técnica permite visualizar complejos proteicos endógenos con resolución espacial.

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Agradecemos a la Bloomington Drosophila Stock Center para proporcionar reservas de la mosca. También agradecemos al hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco y el Dr. Lynn Cooley (Universidad de Yale) para proporcionar anticuerpos. Un agradecimiento especial a AhHyun Yoo por su ayuda en el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (Krieger), el William y Fondo de acero Isabelle Ada (Krieger), y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (Harden).

1. Cuerpo Preparación de la pared NOTA: Preparación de tercer estadio larval paredes del cuerpo (para el estudio de los NMJs que inervan los músculos de la pared corporal) se realizó como se ha descrito previamente en Brent et al 10, o Ramachandran y Budnik 11,12, pero con algunas modificaciones.. <ol><li> Disección <ol><li> Elevar las existencias de moscas y cruces a 25 ° C durante cinco o seis días, utilizando procedimientos estándar 13. </li><li> Escoja arrastrándose larvas de tercer estadio de frascos o botellas utilizando unas pinzas finas. </li><li> Lavar las larvas en una pequeña placa Petri que contenía tampón fosfato salino (PBS) para eliminar las partículas de comida. </li><li> Coloque una sola larva en un disco Sylgard y sumergirlo en unas gotas de helado de PBS. El uso de helado de PBS ayudará aturdir la larva por lo que es más fácil de manipular. A lo largo de la disección, asegúrese de que la preparación siempre se sumerge en PBS para evitar que se seque. </li><li> Coloque la larva con el lado dorsal de modo que las dos secciones traqueales son visibles bajo un microscopio de disección (Figura 2A). Usando las pinzas para agarrar un alfiler minutien, Pin de la larva hacia abajo en el extremo posterior cerca de los espiráculos (Figura 2B). Con otro pin, perforar a través de la cutícula en el extremo anterior cerca de los ganchos de la boca. Estire suavemente la larva a cabo a lo largo, entonces pin abajo (Figura 2B). </li><li> Con unas tijeras de microdisección, pellizcar el extremo posterior cerca del pasador para crear una pequeña abertura. La incisión debe ser lo suficientemente superficial sólo tiene que pasar a través de la cutícula. </li><li> La colocación de la punta de la cuchilla inferior de las tijeras en la incisión, corte a lo largo de toda la longitud de la línea media dorsal entre las dos secciones traqueales (Figura 2C). Señalar las cuchillas de la tijera ligeramente hacia arriba cuando se corta para evitar dañar los músculos de la pared ventral del cuerpo. </li><li> Hacer una pequeña incisión horizontal ligeramente anterior al puestopin colocado eriorly (Figura 2C). Haz otra incisión similares posterior ligeramente a la aguja colocada anteriormente (Figura 2C). Las incisiones deben sólo tiene que pasar a través de la cutícula. NOTA: Los tres incisiones de los pasos 1.1.7 y 1.1.8 combinados debe ser similar a un " <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px"> "Una vez terminado, es decir, una aleta izquierda y derecha en la parte dorsal del cuerpo de la larva debe ser producido. </li><li> Limpiar cuidadosamente los órganos internos con los fórceps. Añadir unas gotas contundentes de PBS ayudará a desplazar a los órganos fuera del cuerpo de la larva, por lo que es más fácil para eliminarlos. Evite meter el cuerpo de las larvas, ya que puede causar daños en los músculos de la pared corporal. </li><li> Desplegar el cuerpo larval abierta y fijar las esquinas hacia abajo (Figura 2D). Cuando fijación, estirar la pared del cuerpo, tanto horizontal como verticalmente para formar un rectángulo uniformemente tensado (see Figura 2G para la forma), teniendo cuidado de no romper los músculos de la pared del cuerpo en el proceso. </li><li> Termine de retirar cualquiera de los órganos internos restantes (Figura 2E). </li></ol></li><li> La fijación y permeabilización <ol><li> Sumerja las paredes del cuerpo clavado en varias gotas de solución de Bouin. Incubar durante 15 min en hielo. Como alternativa, utilice el 4% de paraformaldehído (PFA) como una solución fijadora alternativa; incubar durante 30 min. </li><li> Enjuague tres veces con tampón fosfato salino con Triton (PBT). </li><li> Con unas pinzas finas, retire con cuidado los pasadores y transferir las paredes del cuerpo por sus esquinas en un tubo de microcentrífuga de 0,65 ml siliconado. </li><li> Guarde las paredes del cuerpo de PBT a 4 ° C hasta el momento de PLA. Para obtener resultados óptimos, comience inmunotinción las paredes del cuerpo dentro de un día o dos de disección. NOTA: Para ahorrar en reactivos y para asegurar que todas las paredes del cuerpo son tratados por igual durante el ensayo, diferentes genotipos se pueden colocar en una solatubo. Los genotipos se pueden distinguir por el corte de las esquinas de las paredes del cuerpo de forma diferente (véase la Figura 2F para los ejemplos). </li></ol></li></ol> 2. La inmunohistoquímica NOTA: La inmunotinción de tercer instar paredes del cuerpo de las larvas se realizó como se ha descrito previamente en Brent et al 14 y Ramachandran y Budnik 11, pero con algunas modificaciones 11,14.. NOTA: Realice todos los pasos a temperatura ambiente y con agitación suave a menos que se indique lo contrario. <ol><li> Bloqueo <ol><li> Lavar las paredes del cuerpo con PBT tres veces durante 10 minutos cada uno. </li><li> Bloque con 1% albúmina de suero bovino (BSA) durante 1 hr. </li></ol></li><li> Inmunoticción <ol><li> Incubar las paredes del cuerpo con anticuerpos de ratón y primarios de conejo contra las dos proteínas de interés (diluido en 1% de BSA) durante 2 horas a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C. En este caso, utilice 1:10 de ratón anti-Dlg y 1: 250 de conejo unnti-HtsM 15,16. Los anticuerpos contra los marcadores que no se hacen en el ratón o conejo también se pueden incluir - por ejemplo, utilizar 1: 200 cabra anti-HRP para delinear las membranas neuronales. </li><li> Lavar con PBT tres veces durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar con anticuerpos secundarios conjugado con fluoróforo para detectar los marcadores (diluido en 1% de BSA) durante 2 horas a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C. Como la señal de PLA se visualizó más tarde con un fluoróforo rojo, otro fluoróforo debe ser utilizado para detectar el marcador - por ejemplo, usar 1: 200 anti-cabra conjugado con FITC para detectar el anticuerpo de cabra anti-Hrp. Debido a la utilización de los reactivos sensibles a la luz, mantener los tubos en la oscuridad desde este punto en adelante. NOTA: El kit que se utiliza para PLA permite que se realice entre los anticuerpos primarios planteadas en ratón y conejo, con la señal visualizado en el canal rojo bajo microscopía confocal. Si se desea, otros kits están disponibles que permiten que el ensayo se realiza con primaanticuerpos ry criados en otras especies, y la señal visualizaron en otros canales. </li></ol></li></ol> 3. Proximidad Ligadura Ensayo NOTA: Realice todos los pasos a temperatura ambiente y con agitación suave a menos que se indique lo contrario. <ol><li> PLA Sondas <ol><li> Lavar las paredes del cuerpo con PBT tres veces durante 10 minutos cada uno. </li><li> Incubar con sondas de PLA (dilución 1: 5 cada uno en 1% BSA) durante 2 horas a 37 ° C. En este caso, utilizar 40 l de sonda de PLA MENOS anti-ratón, 40 l de sonda de PLA anti-conejo PLUS y 120 l de BSA al 1% para asegurar la inmersión adecuado y mezcla de 5-10 paredes del cuerpo. Hasta una dilución 01:25 de las sondas de PLA todavía puede resultar en una adecuada relación señal a ruido (es decir, para este experimento). </li></ol></li><li> Ligadura <ol><li> Lavar las paredes del cuerpo con el tampón de lavado A dos veces durante 5 minutos cada uno. </li><li> Incubar con solución de ligación (dilución 1:40 de ligasa en tampón de ligación) durante 1 hr unat 37 ° C. En este caso, utilizar 5 l de ligasa, 40 l de tampón de ligación y 5 155 l de agua de alta pureza para garantizar la inmersión adecuado y mezcla de 5-10 paredes del cuerpo. </li></ol></li><li> Amplificación <ol><li> Lavar las paredes del cuerpo con el tampón de lavado A dos veces durante 2 minutos cada uno. </li><li> Incubar con solución de amplificación (1:80 dilución de la polimerasa en tampón de amplificación) durante 2 horas a 37 ° C. En este caso, utilizar 2,5 l de polimerasa, 40 l de tampón de amplificación 5 y 157,5 l de agua de alta pureza para garantizar la inmersión adecuado y mezcla de 5-10 paredes del cuerpo. </li></ol></li><li> Preparación de la Imagen <ol><li> Lavar las paredes del cuerpo con el tampón de lavado B dos veces durante 10 minutos cada uno. </li><li> Lavar con 0,01x Wash Buffer B una vez durante 1 min. </li><li> Equilibrar en unas pocas gotas de solución de montaje por lo menos 30 min antes del montaje, o almacenar durante la noche a 4 ° C. </li><li> Con unas pinzas finas, transferir cuidadosamente las paredes del cuerpo en un portaobjetos plataforma wITH sus cutículas hacia abajo. Coloque las paredes del cuerpo en filas y en la misma orientación dentro de una o dos gotas de medio de montaje. Coloque un 22 mm x 40 mm cubreobjetos sobre la preparación con cuidado de no generar burbujas de aire, y luego sellar la diapositiva con esmalte de uñas transparente. </li><li> Guarde las diapositivas de la oscuridad a -20 ° C hasta el momento de la imagen confocal. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Woods, D. F., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discs-large+tumor+suppressor+gene+of+Drosophila+encodes+a+guanylate+kinase+homolog+localized+at+septate+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions.</a> Cell. 66, 451-464 (1991).</li>
<li>Yamanaka, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Lgl%2FDlg%2FScribble+in+the+regulation+of+epithelial+junction%2C+polarity+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth.</a> Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).</li>
<li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble%2FDlg%2FLgl+polarity+module%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).</li>
<li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13, 823-835 (1994).</li>
<li>Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+proteins+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).</li>
<li>Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+as+a+model+for+scaffold+complexes+at+glutamatergic+synapses%3A+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations.</a> J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).</li>
<li>Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adducin%3A+structure%2C+function+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Adducin: structure, function and regulation.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+adducin+regulates+Dlg+phosphorylation+and+targeting+of+Dlg+to+the+synapse+and+epithelial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane.</a> Dev Biol. 357, 392-403 (2011).</li>
<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+staining+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li>
<li>Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ovhts+polyprotein+is+cleaved+to+produce+fusome+and+ring+canal+proteins+required+for+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis.</a> Development. 134, 703-712 (2007).</li>
<li>Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hts%2FAdducin+controls+synaptic+elaboration+and+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination.</a> Neuron. 69, 1114-1131 (2011).</li>
<li>Spradling, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project%3A+Single+P-element+insertions+mutating+25%25+of+vital+Drosophila+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153, 135-177 (1999).</li>
<li>Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+p21-Activated+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biology of the p21-Activated Kinases.</a> Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).</li>
<li>Bahri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+leading+edge+during+dorsal+closure+as+a+model+for+epithelial+plasticity%3A+Pak+is+required+for+recruitment+of+the+Scribble+complex+and+septate+junction+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation.</a> Development. 137, 2023-2032 (2010).</li>
<li>Albin, S. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+structural+and+functional+synapse+development%3A+postsynaptic+p21-activated+kinase+independently+specifies+glutamate+receptor+abundance+and+postsynaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology.</a> J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).</li>
<li>Koles, K., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+neuromuscular+junction+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in neuromuscular junction development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li>
<li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Wnt%2C+wingless%2C+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111, 319-330 (2002).</li>
<li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays%3A+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li>
<li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA%2C+a+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maglione, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+forest+tree+by+tree%3A+super-resolution+light+microscopy+meets+the+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences.</a> Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-regulated+Drosophila+adducin+is+a+determinant+of+synaptic+plasticity+in+a+complex+with+Dlg+and+PIP2+at+the+larval+neuromuscular+junction%0A++%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Open%22%5BJournal%5D)">Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction
 .</a> Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este informe demuestra cómo PLA se puede aplicar a la Drosophila larval NMJ. El ensayo se realizó en preparaciones de músculo de la pared corporal de larvas para el propósito de la detección de interacciones proteína-proteína endógenos presentes en la NMJ. Con esta técnica, Dlg y Hts se muestran a estar en estrecha proximidad entre sí, y por lo tanto existir en un complejo, específicamente en la región postsináptica 27. En apoyo de este resultado, un estudio previo ha proporcionado pruebas de su asoc...

Drosophila discos grandes (DLG) es un miembro conservada de la guanilato quinasa de la familia asociada a la membrana de andamios proteínas que ayudan a orquestar el ensamblaje de complejos de proteínas grandes en sitios específicos de la membrana plasmática. Originalmente identificado como una proteína supresora de tumores, Dlg sirve como un determinante importante de la polaridad epitelial 1,2,3 apicobasal. Dlg también sirve como un módulo de andamio importante en la unión neuromuscular (NMJ) de las neuronas motoras glutamatérgicas durante el desarrollo larvario 4. Dlg juega diversos papeles en la larval NMJ, y su pleiotropism se basa en su capacidad para asociarse con múltiples proteínas de 5,6. Una de estas proteínas es shao Hu-li tai (HTS), un homólogo de los mamíferos adducins que principalmente se han descrito en lo que respecta a sus funciones en la regulación de la actina-espectrina citoesqueleto 7. Previamente se ha demostrado que Dlg y Hts pueden formar un complejo con el uno al otro sobre la base de in vitro </em&gt; experimentos de co-inmunoprecipitación que participe toda adultos lisados ​​mosca 8. Una deficiencia de estos resultados, sin embargo, es que no indican donde este complejo formas. Con el uso de inmunohistoquímica, se observan las distribuciones de Dlg y Hts a superponerse en la membrana postsináptica de NMJs larvas, pero son en un complejo en esta región 8? Como se muestra recientemente y se detalla más adelante aquí, ligadura de ensayo de proximidad (PLA) se utiliza para buscar una en asociación situ entre Dlg y Hts específicamente en el larval NMJ 27. PLA es una técnica relativamente nueva se utiliza principalmente en las células y el tejido cultural que puede detectar interacciones proteína-proteína in situ 9. En este ensayo, los anticuerpos primarios contra las dos proteínas de interés se detectan con un par de anticuerpos secundarios específicos de especie, denominados sondas de PLA, que están conjugados a oligonucleótidos (Figura 1A, B). Si la proteína de doss están muy cerca entre sí (es decir, dentro de unas pocas decenas de nanómetros), la distancia entre las sondas PLA adjuntos puede salvarse a través de la hibridación de dos oligonucleótidos de conectores adicionales (Figura 1C). En esta conformación, los extremos libres de los oligonucleótidos de conector son lo suficientemente cerca para hacer contacto uno con otro, y una molécula de ADN circular cerrado se pueden formar sobre la ligadura en situ (Figura 1D). La molécula de ADN circular sirve como una plantilla para in situ amplificación por círculo rodante, que se prepara por uno de los oligonucleótidos conjugados con las sondas PLA (Figura 1E). Las secuencias dentro de la amplificado, producto de ADN resultante concatemeric entonces se pueden visualizar con, sondas de oligonucleótido complementario marcado con fluorescencia (Figura 1f). Dado que el ADN amplificado permanece unida a una de las sondas de PLA, la localización subcelular de la interacción proteína-proteína withitejido na puede determinarse fácilmente. Varios métodos se usan comúnmente para detectar interacciones proteína-proteína incluyendo técnicas in vitro tales como co-inmunoprecipitación, ensayos de pull-down y la levadura de dos híbridos, y en técnicas in vivo tales como Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) y bimolecular de fluorescencia de Complementación ( BiFC). Un error de las técnicas in vitro es que no se identifican donde la interacción se produce de manera endógena, mientras que la mencionada en técnicas in vivo implican la expresión de proteínas de fusión artificial que puede no reflejar el comportamiento natural de sus homólogos endógenos. Una ventaja importante de PLA es que es capaz de determinar dentro de un tejido la localización subcelular de interactores de proteínas endógenas que se encuentran en estrecha proximidad entre sí y probablemente formando un complejo, con el grado de cercanía requerido para generar una señal comparable a FRET y BiFC. PLA puede detectar interacciones con alta especificidad y sensibilidad debido al acoplamiento de reconocimiento de anticuerpos y la amplificación de ADN. Por lo tanto, el ensayo puede generar, señales luminosas discretas en forma de puntos lagrimales que revelan la posición exacta de la interacción. Además, los antígenos apenas visibles pueden ser detectados. Finalmente, PLA es una técnica relativamente sencilla de realizar, y ya no tiene que un procedimiento inmunohistoquímico estándar para completar. Por lo tanto, PLA ofrece una ventaja técnica sobre otros ensayos de interacción proteína-proteína que a menudo se ven afectadas con largos tiempos de preparación y amplia solución de problemas. Este protocolo se muestra cómo PLA se puede aplicar a la Drosophila larval NMJ para el propósito de la detección de interacciones proteína-proteína endógenos in situ. Aquí, el PLA se realiza en preparaciones de músculo de la pared corporal larvarios donde se muestran Dlg y Hts de existir de hecho en un complejo en la región postsináptica de NMJs. PLA no se ha utilizado previamente para estudiar la larval NMJ, y existen en la actualidad sólo un puñado de trabajos publicados que han utilizado este ensayo en el tejido Drosophila. Se espera que una mayor exposición de PLA a la comunidad de Drosophila se traducirá en el aumento de su uso como una herramienta adicional para complementar otros ensayos de interacción proteína-proteína más comúnmente utilizados,.

<table><tbody><tr><td>Pinzas (finas #5)</td><td>Almedic</td><td>A10-704</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Disc</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Mezcle la base de elastómero y el agente de curado en una proporción de 10:1. Duración de 30 min. Vierta en un molde (por ejemplo use una placa de cultivo celular de 12 pocillos). Deje curar durante al menos 24 horas. Adherir a la tapa de una placa de Petri de 60 x 15 mm al diseccionar.</td></tr><tr><td>Pines minuciosos (0.0125&nbsp; mm de diámetro de la punta)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de microdisección (ultrafinas)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td></td><td></td> de plataforma <td>Pegue dos cubreobjetos de 22 x 22 mm2 en un portaobjetos de microscopio con esmalte de uñas transparente, dejando un < Espacio entre ellos de 20 mm para el montaje de la muestra.</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>hts01103</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>10989</td><td>El stock se reequilibró sobre un equilibrador de GFP para que los mutantes homocigotos puedan seleccionarse en función de la ausencia de señal de GFP.</td></tr><tr><td>1x PBS (solución salina tamponada con fosfato): 3&nbsp; mM NaH2PO4, 7&nbsp; mM Na2HPO4, 130&nbsp; mM NaCl, pH 7.0</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4 (Laboratorios Caledon - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Solución de Bouin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA (Paraformaldehído): 4% PFA en 1x PBS</td><td></td><td></td><td>PFA (Ciencia de la Anaquimia - 66194-300). Consulte doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 para obtener instrucciones sobre cómo hacer la solución.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>1x PBT (solución salina tamponada con fosfato con Triton): 1x PBS con 0.01% Triton</td><td></td><td></td><td>Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td></tr><tr><td>1% BSA (Albúmina sérica bovina): 1% BSA en 1x PBT</td><td></td><td></td><td>BSA (Bioshop Canada - ALB001). Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>ratón anti-Dlg (Discos grandes)</td><td>Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas</td><td>4F3</td><td>Úselo en una dilución 1:10 en BSA al 1%.</td></tr><tr><td>conejo anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td><td></td><td></td><td>Proporcionado por la Dra. Lynn Cooley (Universidad de Yale). Úselo en una dilución de 1:250 en BSA al 1%.</td></tr><tr><td>conejo anti-Pak (quinasa activada por p21)</td><td></td><td></td><td>Proporcionado por el Dr. Nicholas Harden (Universidad Simon Fraser). Úselo en una dilución de 1:500 en BSA al 1%.</td></tr><tr><td>ratón anti-Wg (sin alas)</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>4D4</td><td>Uso en una dilución 1:5 en BSA al 1%.</td></tr><tr><td>cabra anti-Hrp (Peroxidasa de rábano picante)</td><td>Jackson &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>Úselo en una dilución de 1:200 en BSA al 1%.</td></tr><tr><td>burro conjugado FITC anti-cabra</td><td>Jackson&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ImmunoResearch</td><td>705-095-003</td><td>Úselo en una dilución de 1:200 en BSA al 1%.</td></tr><tr><td>Duolink Sonda PLA In Situ anti-ratón MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Sonda PLA In Situ anti-conejo PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Reactivos de Detección In Situ Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>1x Tampón de lavado A: 0.01&nbsp; M Tris, 0.15&nbsp; M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td></tr><tr><td>1x Tampón de lavado B: 0.2&nbsp; M Tris, 0.1&nbsp; M NaCl, pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Laboratorios Caledon - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>0.01x Tampón de lavado B: 2&nbsp; mM Tris, 1&nbsp; mM NaCl, pH 7.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td></tr><tr><td>Medio de montaje in situ Duolink con DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr></tbody></table>

detección de in situ complejos proteína-proteína en la drosophila larval unión neuromuscular usando proximidad ligadura ensayo

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discos grandes (Dlg) es un miembro conservado de la familia de las guanilato quinasas asociadas a la membrana, y sirve como una importante proteína de andamiaje en la unión neuromuscular de las larvas (NMJ) en Drosophila. Estudios previos han demostrado que la distribución postsináptica de Dlg en la NMJ larvaria se superpone con la de Hu-li tai shao (Hts), un homólogo de las aducinas de los mamíferos. Además, se observa que Dlg y Hts forman un complejo entre sí sobre la base de experimentos de coinmunoprecipitación con lisados de moscas adultas completas. Sin embargo, debido a la naturaleza de estos experimentos, se desconocía si este complejo existía específicamente en el NMJ durante el desarrollo de las larvas.
El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) es una técnica recientemente desarrollada que se utiliza principalmente en cultivos celulares y de tejidos y que puede detectar interacciones proteína-proteína in situ. En este ensayo, las muestras se incuban con anticuerpos primarios contra las dos proteínas de interés mediante procedimientos inmunohistoquímicos estándar. A continuación, los anticuerpos primarios se detectan con un par especialmente diseñado de anticuerpos secundarios conjugados con oligonucleótidos, denominados sondas PLA, que sólo pueden utilizarse para generar una señal cuando las dos sondas se han unido muy cerca una de la otra. Así, se pueden visualizar las proteínas que están en un complejo. Aquí, se demuestra cómo se puede utilizar el PLA para detectar interacciones proteína-proteína in situ en la NMJ larvaria de Drosophila. La técnica se realiza en preparaciones musculares de la pared corporal de las larvas para mostrar que existe un complejo entre Dlg y Hts en la región postsináptica de las NMJ.

En los de tipo salvaje tercer instar NMJs larvales, Dlg es predominantemente encontrar en la membrana postsináptica de boutons glutamatérgicos tipo I, con niveles de inmunorreactividad Dlg siendo más pronunciada en boutons tipo Ib que el tipo es boutons (Figura 3) 4. Hts está presente en todo el músculo sino que se concentra en la región postsináptica con Hts niveles de inmunorreactividad aparece igual en ambos tipo I boutons, y también se encuentra presinápticamente (Figura 3A ')</st...

Este protocolo demuestra cómo la proximidad Ligadura ensayo se puede usar para detectar in situ en las interacciones proteína-proteína en la unión neuromuscular Drosophila larval. Con esta técnica, los discos grandes y Hu-li shao tai se muestra para formar un complejo en la región postsináptica, una asociación identificado previamente a través de co-inmunoprecipitación.

Detección de In Situ Complejos proteína-proteína en la Drosophila Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

El objetivo general del siguiente experimento es detectar la localización subcelular de las interacciones proteicas endógenas en la larva de drosophila NMJ. Esto se logra mediante la realización de inmunofluorescencia utilizando un par de anticuerpos secundarios conjugados con oligonucleótidos denominados sondas PLA, que se unen a los anticuerpos primarios contra las dos proteínas de interés. A continuación, se cierra la brecha entre las sondas de PLA mediante la hibridación de los dos oligonucleótidos conectores.Solo cuando las dos proteínas están muy cerca una de la otra y se forma una molécula de ADN circular cerrada mediante ligadura in situ, se realiza una amplificación de círculo rodante in situ para amplificar secuencias dentro de la molécula de ADN circular cerrada, que posteriormente se detectan con oligonucleótidos complementarios marcados con fluorescencia. Por lo tanto, la señal fluorescente resultante generada por cada producto de amplificación es fácilmente visible como un punto brillante distinto cuando se observa mediante microscopía confocal. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos existentes, como la precipitación híbrida E dos y la amenaza, es que el PLA es capaz de detectar dentro del tejido la localización subcelular de proteínas endógenas que se localizan muy cerca unas de otras y que probablemente formen un complejo.Aunque este método proporciona información sobre las redes de interacción proteína-proteína que ocurren específicamente en de larva y mj. También se puede aplicar a otros sistemas jolo. Sugerir los tejidos epiteliales en embriones y discos imaginales.La demostración del procedimiento estará a cargo de hel yu y Ha king, dos técnicos de nuestro laboratorio. Después de incubar cultivos de Drosophila a 25 grados centígrados durante cinco o seis días, use pinzas finas para recoger las larvas del tercer estadio rastreras de los viales o botellas para lavar las larvas. Transfiéralos a una pequeña placa de Petri que contenga PBS.Luego, coloque una de las larvas lavadas en un disco de cigarro S y sumérjala en varias gotas de PBS helada para atrofiarla, lo que facilita su manipulación. Coloque las larvas con el lado dorsal hacia arriba de modo que las dos huellas traqueales sean visibles bajo un microscopio de disección. Luego, usando las pinzas para agarrar un alfiler de mnuchin, sujete las larvas en el extremo posterior cerca de las espirales con otro alfiler, perfore la cutícula en el extremo anterior cerca de los ganchos bucales y estire suavemente las larvas a lo largo antes de sujetarlas.A continuación, usando micro disección, las tijeras pellizcan el extremo posterior cerca del alfiler para crear una pequeña abertura, la incisión debe ser lo suficientemente superficial como para pasar a través de la cutícula. Luego, colocando la punta de la hoja inferior de las tijeras en la incisión, y mientras apunta las hojas de las tijeras ligeramente hacia arriba para evitar dañar los músculos subyacentes, corte a lo largo de toda la línea media dorsal entre las dos tractos traqueales. Ahora haz una pequeña incisión horizontal justo a través de la cutícula, ligeramente anterior al clavo colocado posteriormente.A continuación, haga otra incisión similar ligeramente posterior al clavo colocado anteriormente. Después de agregar unas gotas contundentes de PBS al cuerpo de la larva, use las pinzas para limpiar cuidadosamente los órganos internos. Evite pinchar el cuerpo de la larva, ya que esto causará daño al cuerpo.Los músculos de la pared despliegan el cuerpo de la larva y, para sujetar las esquinas, estiran la pared del cuerpo tanto horizontal como verticalmente para formar un rectángulo uniformemente tensado. Tenga cuidado de no desgarrar los músculos de la pared corporal en el proceso de fijación del tejido. Sumerja las paredes del cuerpo clavadas en varias gotas de solución de boan e incube en hielo durante 15 minutos después de la fijación.Use PBT para enjuagar el pañuelo tres veces. A continuación, para ahorrar en reactivos y garantizar que todas las paredes del cuerpo se traten por igual durante el ensayo. Corta las esquinas de cada genotipo de manera diferente para distinguirlos.Y después de quitar los pasadores con pinzas finas, colóquelos todos en el mismo tubo de microcentrífuga siliconado de 0,65 mililitros. Para permear el tejido, use PBT para lavar las paredes del cuerpo tres veces durante 10 minutos cada una. Después de retirar el lavado final, agregue 1%BSA para bloquear las muestras e incubar durante una hora.Junto a la inmunotinción, las paredes del cuerpo añaden anticuerpos primarios de ratón y conejo contra las dos proteínas de interés e incuban durante dos horas. En este caso, se utiliza de uno a 10 ratones anti DLG y de uno a 250 conejos anti HTS al 1%BSA. También se pueden añadir anticuerpos contra marcadores después de la incubación.Use PBT para lavar las paredes del cuerpo tres veces durante 10 minutos cada una. A continuación, añada anticuerpos secundarios marcados con flúor cuatro contra cualquier marcador en 1%BSA, e incube en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante la noche a la mañana siguiente. Use PBT para lavar las paredes del cuerpo tres veces durante 10 minutos cada una.Para comenzar el ensayo, se diluya de uno a cinco en al menos 200 microlitros. Volumen total de la sonda de PLA, anti ratón minus y PLA probe anti conejo plus en 1%BSA a las paredes del cuerpo incubar durante dos horas a 37 grados centígrados después de usar el tampón de lavado A para lavar las paredes del cuerpo dos veces durante cinco minutos cada una a una dilución de uno a 40 de ligasa en solución de ligasa, incubar durante una hora a 37 grados centígrados después de la incubación. Utilice el tampón de lavado A para lavar las paredes del cuerpo dos veces durante dos minutos cada una antes de añadir una dilución de 1 a 80 de polimerasa en la solución de amplificación.Incubar durante dos horas a 37 grados centígrados para preparar las muestras para la obtención de imágenes. Use el tampón de lavado B para lavar las paredes del cuerpo dos veces durante 10 minutos cada una. A continuación, utilice una dilución de 100 veces el tampón de lavado B para realizar un lavado final durante un minuto.Equilibre las paredes del cuerpo con unas gotas de solución de montaje durante al menos 30 minutos con pinzas finas. Transfiera con cuidado las paredes del cuerpo a un tobogán de plataforma con el espacio entre las cutículas hacia abajo. Colóquelos en filas en la misma orientación dentro de una o dos gotas de la solución de montaje.Coloque un cubreobjetos de 22 milímetros por 40 milímetros sobre la preparación, teniendo cuidado de no generar burbujas de aire. Luego, usa esmalte de uñas transparente para sellar el portaobjetos. Guarde los portaobjetos a menos 20 grados centígrados hasta que estén listos para la obtención de imágenes confocal.Como se muestra aquí en las larvas de tipo salvaje, la DLG se encuentra predominantemente en la membrana postsináptica del bhuton glutamatérgico de tipo uno, con niveles más pronunciados en el tipo uno B que en el tipo uno S bs bs HTS se encuentra en todo el músculo, pero se concentra en la membrana postsináptica con niveles iguales en ambos Bhuton tipo uno, DLG y HTS se superponen en gran medida en la región postsináptica para determinar si DLG y HTS existen en un complejo. En el N-M-J-P-L-A se realizó con anticuerpos anti DLG y anti HTS como se ve aquí. La señal de PLA entre las dos proteínas se observa específicamente en el tipo salvaje NMJ, la señal se localiza principalmente circunferencialmente a la membrana presináptica marcada por HRP.Por lo tanto, DLG y HTS están muy cerca y probablemente forman un complejo en la región postsináptica. El resultado es específico como un control negativo que involucra mutantes HTS que carecen. La inmunorreactividad de HTS no muestra ninguna señal de PLA observable, las vistas de alto aumento de la bns muestran que la inmunorreactividad de DLG y HTS se superponen macroscópicamente en la membrana postsináptica.Por el contrario, el PLA entre las dos proteínas da como resultado PUNCTA discreto, lo que indica que solo un subconjunto del total de proteínas DLG y HTS están en complejo una vez dominadas. Esta técnica no tarda más que un procedimiento inmunohistoquímico estándar en completarse. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se usa el PLA para detectar la localización subcelular de la interacción proteína-proteína endógena que ocurre en la larva NMJ.

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aquí se muestra cómo utilizar la ligadura de ensayo de proximidad (PLA), con una combinación de anticuerpos para visualizar la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización en células fijadas. Esta técnica nos permitió seguir la acumulación nuclear de endógeno BMP activa de efectos complejos y cuantificar sus niveles en el tiempo en BMP4 estimulación.

La detección de señalización de Efectos Complejos de aguas abajo de BMP4 uso In situ PLA, un ensayo de la ligadura de proximidad

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

Este video describe el ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína en células de nematodos. La proximidad de las proteínas de interés genera la plantilla circular de ADN con la ayuda de una sonda de PLA unida a un anticuerpo secundario. La sonda se amplifica aún más utilizando la solución de amplificación, que produce un ADN monocatenario largo seguido de la hibridación de la sonda detectora, lo que permite la localización de las interacciones...

Ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína

Este video demuestra la visualización de las interacciones proteína-proteína en la unión neuromuscular (NMJ) de Drosophila utilizando el Ensayo de Ligadura de Proximidad (PLA). Después de aislar las paredes del cuerpo, las proteínas que interactúan se prueban con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios conjugados con PLA. La proximidad de las proteínas que interactúan facilita la ligadura de las sondas con oligonucleótidos conectores, formando ADN circular, que luego se amplifica...

Detección de interacciones proteína-proteína en larvas de Drosophila mediante un ensayo de ligadura de proximidad

A continuación, describimos un procedimiento para visualizar y cuantificar con alta sensibilidad las interacciones endógenas entre el retículo endoplasmático y las mitocondrias en las células fijadas. El protocolo cuenta con una optimizada en el ensayo de ligamiento por proximidad situ la orientación del inositol receptor / proteína 1,4,5-trifosfato regulada por glucosa 75 / D compleja canal de aniones / ciclofilina dependiente de la tensión en la interfase membrana de la mitocondria asociada.

Estudio del retículo endoplasmático y las mitocondrias por Interacciones<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidad ligadura de ensayo en células fijadas

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

Aquí, mostramos cómo hacer un análisis de proximidad de la ligadura (PLA) visualizar heterodimerization MST1/MST2 en células fijas con alta sensibilidad.

Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

DetectSyn es un ensayo fluorescente rápido e imparcial que mide los cambios en el número relativo de sinapsis (compromiso pre y postsináptico) en todos los tratamientos o estados de enfermedad. Esta técnica utiliza una técnica de ligadura de proximidad que se puede utilizar tanto en neuronas cultivadas como en tejido fijo.

DetectSyn: un método fluorescente rápido e imparcial para detectar cambios en la densidad de la sinapsis

Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

Aprende a detectar interacciones proteína-proteína in situ en la unión neuromuscular larval de Drosophila mediante ensayo de ligadura de proximidad. Esta técnica permite visualizar complejos proteicos endógenos con resolución espacial.

Detección de In Situ Complejos proteína-proteína en la Drosophila Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

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