Name: Análisis rápido y robusto de Celular y Molecular Polarización Inducida por Chemokine Señalización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprende a cuantificar cambios morfológicos y localización proteica en linfocitos T mediante citometría de flujo con imagen. Este protocolo permite analizar grandes poblaciones celulares de forma rápida y robusta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen enormemente Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert y Louise Rimbault del Fondo para el Cochin Imaging. Este trabajo fue apoyado por el INSERM, CNRS y la Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).

1. Preparación de los linfocitos T <ol><li> Preparar ratón primaria o células T humanas como se describe 10,11. </li><li> Cultivar las células T humanas en medio completo RPMI con 10% de suero humano AB a una densidad de 2 - 3 x 10 6 células / ml. NOTA: El uso de suero de ternera fetal (FCS) en lugar de suero humano puede provocar la polarización espontánea de una gran fracción de células T humanas en cultivo. Mantener estas células en cultivo durante 4 - 5 días, y otro proceso en cualquier momento durante este período. </li><li> Mantener las células T de ratón en medio completo RPMI suplementado con 10% de FCS a una densidad celular similar. Utilice inmediatamente o al día siguiente, después de un cultivo O / N a 37 ° C en presencia de 10 ng / ml IL7. </li><li> Cultivar la línea celular T CEM humana en RPMI completo suplementado con 10% de FCS. </li></ol> 2. Estimulación de quimioquinas <ol><li> Lave 5 x 10 5 células por condición experimental en medio HBSS caliente suplementado con 10 mM Hepes. Para algunos experimentos, co-transfectar células T humanas primarias el día anterior con 2 g pmaxGFP y 8 g pcDNA3.1 + (vector vacío, control), PKCζ quinasa muerta, o plásmidos PAR6 N-terminales. </li><li> Resuspender el sedimento celular en medio cálido HBSS-Hepes (usar 0.3 ml x número de condiciones experimentales). </li><li> Distribuir las células en 1,5 ml tubos de microcentrífuga. NOTA: Por lo tanto, un tubo que corresponde a una sola condición experimental contendrá 5 x 10 5 células en 0,3 ml de medio HBSS-Hepes. Para algunos experimentos, añadir 500 nM latrunculina A o vehículo (DMSO) y se incuban las células durante 30 min antes de la estimulación de quimiocinas. </li><li> Añadir de 10 a 500 ng / ml o CCL19 de quimioquinas CXCL12 en cada tubo. NOTA: Utilizamos generalmente 10-200 quimiocina ng / ml para las células T humanas. CEM células no expresan el receptor CCR7 que une CCL19. Por lo tanto, las células CEM sólo serán capaces de responder a una estimulación CXCL12. Por otra parte, utilizar concentraciones más altas de quimioquinas (300-500 ng / ml) para polarizar las células T de ratón. </li><li> Voltear los tubos varias veces e incubar en un 37 ° C baño de agua durante 8 o 10 minutos para que las células T primarias o CEM, respectivamente. </li><li> Detener el proceso de polarización mediante la adición a cada tubo 0,3 ml de una solución caliente que contiene 2% de paraformaldehído (PFA) y Hepes 10 mM en PBS. Voltear los tubos y los incuban a 37 ° C durante 5 min. </li></ol> 3. Las tinciones <ol><li> Transferencia de las células de los tubos de microcentrífuga a citometría de flujo tubos. </li><li> Llenar completamente los tubos con una solución de RT que contiene 1% de albúmina de suero bovino (BSA), EDTA 0,5 mM y Hepes 10 mM en PBS. </li><li> Centrifugar los tubos a 460 g durante 4 min. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de una solución a TA que contiene 5% de FCS en PBS. </li><li> Añadir 5 l de FITC-anti-HLA-ABC en cada tubo, vórtice, y los incuban durante 30 min a RT, lejos de la luz. </li><li> Lavar las células una vez con PBS que contiene 5% de FCS, unand una vez con PBS solo. </li><li> En RT: añadir 500 l 1% PFA, incubar durante 10 min, a continuación, lavar las células con una solución que contiene 1% de BSA, EDTA 0,5 mM y HEPES 10 mM en PBS. </li><li> Descartar el sobrenadante, llenar los tubos completamente con una solución de PBS que contenía 0,2% de BSA, 0,1% de saponina, EDTA 0,5 mM y Hepes 10 mM (tampón de permeabilización). </li><li> Lavar las células dos veces en este medio. </li><li> Voltear los tubos para eliminar el medio y Vortex a disociar el sedimento celular. </li><li> Añadir 0,25 g / ml TRITC-faloidina y / o una dilución 1: 100 de anticuerpo anti-P-ERM a cada tubo, vórtice ellos y se incuba durante 30 min a TA. </li><li> Lavar las células con el tampón de permeabilización. Incubar con un anticuerpo secundario fluorescente si es necesario. </li><li> Resuspender las células en 200 l de PBS y transferirlas a tubos de microcentrífuga. NOTA: Las células están listas para la adquisición. Alternativamente, mientras se mantiene un volumen máximo total de 200 l por tubo, añadir concentrado PFA a una final 1%concentración con el fin de preservar las tinciones si las células no están para ser usados ​​el mismo día para su posterior procesamiento. </li></ol> 4. Las imágenes Adquisición y Análisis <ol><li> Encienda el aparato (véase la Tabla de específico Reactivos / Equipo) y se deja calibrar sí de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: El software INSPIRE se utilizó con un objetivo de 40X (0,75 NA). El software IDEAS 3,0 se utilizó para todos los cuantificaciones reportados. </li><li> Preparar una serie de ventanas de adquisición que se pueden guardar en una plantilla para futuros experimentos. Dibuja histogramas que cuantifican los valores de gradiente de RMS. De la población &quot;In Focus&quot;, seleccionado en el RMS histograma gradiente, delimitar la población &quot;célula única&quot; en un histograma de la Zona. Una vez que el tubo de microcentrífuga se ha insertado en la máquina, ajustar la potencia del láser, la puerta en las células individuales y adquirir 5000 T linfocitos. </li><li> En las Ideas blandosware, abra el archivo de adquisición y crear un histograma que mostrará el valor del valor RMS gradiente de imágenes de campo claro (Canal 1) obtenida para cada célula individual. Dibuja una puerta en el histograma gradiente RMS que considera células que presentan RMS valor de gradiente anterior 57. NOTA: El gradiente de RMS permite tener en cuenta en el análisis sólo los linfocitos T que están en el plano focal. Hemos determinado empíricamente que las células individuales que presentan un valor de gradiente RMS superior a 57 están en el plano focal, y se pueden considerar con precisión. </li><li> En el menú Análisis / Máscaras, crear una nueva máscara, llamado Erode (M01,2) de la máscara de la morfología en las imágenes de campo claro M01, erosionadas de 2 píxeles. Luego, en el Análisis / menú Características, crear una nueva característica de la zona, calculado sobre la máscara Erode (M01,2). Desde las celdas seleccionadas en la puerta anterior, abra un histograma que muestra el Área de células usando esta máscara de nueva creación. La morfología de las máscaras que están disponibles por: NOTApor defecto son mucho más grandes que el tamaño real de la célula. Por lo tanto, es más preciso para erosionar que hasta 2 píxeles. </li><li> Dibuja una puerta en las células T individuales, con exclusión de las microesferas y escombros (pequeña área) y los dobletes (grandes Area). Ajuste esta puerta en cada adquisición. NOTA: Las variaciones en el tamaño de la celda afectará a la posición de la puerta. Como las células T de ratón son más pequeños que las células T humanas que son ellos mismos más pequeño que las células CEM, el área de cada tipo de célula será proporcional a su tamaño. </li><li> Teniendo en cuenta las células individuales, en foco que fueron cerrada en los pasos anteriores, abrir un gráfico de puntos que consiste en el Raw Max Pixel en la tinción de HLA-ABC (Canal 2, eje x) como una función de la Raw Max Pixel en la faloidina tinción (Canal 4, eje y). Crear una puerta para excluir los eventos fluorescentes sin teñir o saturados. Abra dos histogramas que muestran la cruda Max Pixel para HLA-ABC (Canal 2) y phalloidin (Canal 4) coloraciones. </li><li> En el Análisis / menú Máscaras, createa nueva máscara, llamado Erode (M02,2) de la máscara de la morfología de las células HLA-ABC manchados (Canal 2), erosionadas de 2 píxeles. Luego, en el Análisis / menú Características, crear una nueva característica que consiste en el parámetro de circularidad, calculado sobre la Erode (M02,2). NOTA: Este parámetro mide la desviación de la forma de la célula de un círculo. Por lo tanto, una célula T perfectamente redonda tendrá un valor alto circularidad mientras que las células polarizadas alargadas exhibirá un bajo índice de circularidad. </li><li> Posteriormente, crear otro histograma que reportar los valores de la función de circularidad de las células previamente cerradas. Utilice este histograma para trazar directamente la distribución de un individuo, población de células de enfoque de acuerdo con el valor de la circularidad para cada celda individual. </li><li> En cuanto a la forma del histograma para las células no estimuladas, dibujar una puerta para células polarizadas, a partir del valor circularidad más bajo hasta el valor límite de la circularidad donde la mayoría de las células no estimuladasse trazan. Mire la pantalla de estadísticas para el porcentaje de células polarizadas entre la población cerrada (% Recinto). NOTA: Hemos establecido esta puerta para los valores de índice de circularidad siguientes 13. </li><li> Con el fin de mirar a la polarización de la tinción de actina en las células, trazar un histograma para el Detalle Bright valor de similitud R3, comparando la tinción de HLA-ABC (canal 2) y la tinción faloidina (Canal 4). NOTA: Cuanto más grande sea el valor de esta característica, el más superpone las dos coloraciones son. </li><li> Usando la misma estrategia de gating como antes, trazar una puerta en las células no estimuladas para la tinción segregada que muestra el porcentaje de células con tinción de actina polarizada. </li><li> Cuando se haya completado, el porcentaje de células que muestran una segregación en la distribución de la MHC de clase I y tinciones con faloidina, el porcentaje de células polarizadas junto con los valores medios de los índices de la circularidad y la similitud de todas las células ± SD se muestran en la corresppaneles estadísticas onding. </li></ol>

<ol><li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chemokines+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li>
<li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li>
<li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li>
<li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li>
<li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta%3A+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li>
<li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li>
<li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li>
<li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+T+cell+shape%2C+motility%2C+and+sensitivity+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409(2007).</li>
<li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen+specific+CD4%2B+T+cells+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Usando una tecnología reciente del flujo de imágenes citometría, una estrategia rápida e informativo gating para analizar los eventos celulares y moleculares inducidos por la estimulación de quimiocinas se presenta. De un solo experimento, se pueden obtener dos tipos principales de información: los cambios en la morfología celular inducida por la estimulación de quimioquinas y la distribución subcelular de proteínas diferentes durante el proceso de polarización. Curiosamente, también se proporciona evidencia de la posib...

Las quimioquinas son pequeñas proteínas solubles que atraen a las células a ubicaciones especializados 1. Por lo tanto, participan en la correcta posición de las células en los tejidos, una función crucial en el desarrollo y la fisiología. El sistema inmunológico no es una excepción a esta regla, ya que se basa en la acción de muchos tipos de células diferentes que actúan en concierto para montar una respuesta inmune efectiva. Mediante el control de la ubicación específica de un tipo de célula inmune en un estado dado, quimiocinas son pre-requerido antes de antígenos extraños pueden ser detectados y neutralizados. En los linfocitos T, en particular, las quimioquinas se unen a receptores específicos de la superficie que, tras el acoplamiento, provocan muchas señales intracelulares (altura de calcio, la fosforilación de ERK, la activación de Rho GTPasas, el aumento de las integrinas de afinidad y alteraciones del citoesqueleto) que favorecen la motilidad celular T 2,3. A nivel celular, se puede observar alteraciones morfológicas provocados a la estimulación de quimiocina.Estos cambios en las formas de células son especialmente dramática en las células T: células T en reposo tienen una morfología redonda de cordón cuando se viaja en el torrente sanguíneo. Sin embargo, la detección de la presencia de quimiocinas en sitios de inflamación o en la proximidad de los órganos linfoides se va a cambiar la forma de las células T que ahora adoptar una morfología típica de &quot;espejo de mano&quot; que consiste en una forma bipolar: un borde de ataque en la parte delantera y un borde de salida, o urópodo, en la parte posterior 4. Además, los componentes intracelulares pueden segregar en estas dos regiones opuestas de una célula T polarizada para sostener la migración. Por ejemplo, los filamentos de actina de polimerización aumenta tras la estimulación de quimiocina 5 y actina polimerizada se acumula en la parte delantera de una célula T polarizada 2. Por otro lado, varias proteínas, tales como proteínas fosforiladas de la Ezrin-radixina-Moesin (ERM) de la familia que unen la membrana plasmática a la cortical del citoesqueleto de actina F, re-localizar en el urópodo de polarizadoLas células T 6. Curiosamente, nosotros y otros han demostrado que se requiere este proceso de polarización para la migración de células T. De hecho, cualquier tratamiento que interfiere con polarización inhibir la motilidad celular. Por ejemplo, la inhibición de la actividad de los miembros de la proteína atípica quinasas C (PKC) de la familia, la polarización celular y PKCζ PKCι bloques de T y su proceso de escaneo migratorio de las células dendríticas 7. Polarización de las células T también está regulada por Rho GTPasas. Hemos demostrado que la modulación de la actividad de RhoA por la proteína Fam65b descrito recientemente interfiere con los cambios en la morfología de células T y su capacidad para migrar en un ensayo Transwell 6. Como la polarización es un paso requisito previo para la motilidad celular, por lo que es crucial para poder cuantificar como una lectura principal de las respuestas a quimiocinas. Alteraciones de la forma de la célula se midieron previamente manualmente 8. Sin embargo, este tipo de cuantificación es muy lento, de modo que por lo general sólo unos pocosdecenas de células se toman en cuenta. Aquí, un nuevo método se presenta para cuantificar rápidamente el grado de alteraciones de la forma de los linfocitos T expuestos a quimioquinas estimulación. Un flujo de imágenes citometría de la tecnología (véase la Tabla de reactivos específicos / Equipment) se utiliza, que combina las ventajas de un citómetro de flujo y un microscopio 9 para cuantificar de manera eficiente la cantidad de células polarizadas en diferentes condiciones de estimulación de quimioquinas. Además de la cuantificación de las alteraciones morfológicas que uno puede medir la firmeza con esta tecnología, también es posible evaluar los cambios en la localización subcelular de algunas proteínas sobre la señalización de quimiocinas.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Suero humano AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Precalentar para inactivar el complemento.</td></tr><tr><td>Suero fetal de pantorrilla</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Precalentar para inactivar el complemento.</td></tr><tr><td>Kit de nucleofactor de células T humanas</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Warm in 37 &deg; C Baño de agua antes de usar.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Las alícuotas se descongelan en hielo antes de añadir la quimiocina a las células.</td></tr><tr>Las alícuotas <td>humanas CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>se descongelan en hielo antes de agregar la quimiocina a las células.</td></tr><tr>Las alícuotas <td>humanas CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>se descongelan en hielo antes de agregar la quimiocina a las células. Esta quimiocina también se puede usar en células T de ratón.</td></tr><tr><td>Ciencias de la microscopía electrónica de</td> <td>PFA</td><td>157-8-100</td><td>Esta es una solución de PFA al 8% en agua. Mezcle volumen a volumen con 2x PBS para obtener una solución de PFA al 4% en PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC</td> clon <td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>B9.12.1</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-P-ERM</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStreamx Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis rápido y robusto de celular y molecular polarización inducida por chemokine señalización

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Las células responden a la estimulación de quimiocinas por la pérdida de su forma redonda en un proceso llamado polarización, y mediante la alteración de la localización subcelular de muchas proteínas. Las técnicas clásicas de imágenes se han utilizado para estudiar estos fenómenos. Sin embargo, se requiere la adquisición manual de de muchas células, seguido de tiempo cuantificación de la morfología y la co-localización de la tinción de decenas de células. Aquí, un método rápido y potente se describe para estudiar estos fenómenos en muestras compuestas por varios miles de células por medio de un flujo de imágenes citometría de tecnología que combina las ventajas de un microscopio con los de un citómetro. El uso de linfocitos T estimulados con CCL19 y tinción para las moléculas MHC de clase I y actina filamentosa, una estrategia gating se presenta para medir simultáneamente el grado de alteraciones de la forma y el grado de co-localización de los marcadores que se ven afectados por la señalización de CCL19. Por otra parte, esta estrategia gating nos permitió OBSERVe la segregación de actina filamentosa (en el frente) y fosforilados proteínas Ezrin-radixina-Moesin (fosfo-ERM) (en la parte trasera) en las células T polarizadas después CXCL12 estimulación. Esta técnica también es útil para observar el efecto de bloqueo en la polarización de dos elementos diferentes: la inhibición de la polimerización de la actina por un inhibidor farmacológico y expresión de mutantes de la / PKC atípicas vía de señalización Par6. De este modo, se muestra evidencia de que esta técnica es útil para analizar tanto las alteraciones morfológicas y redistribuciones de proteínas.

El primer ejemplo elegido aquí se refiere al uso de linfocitos T primarias humanas estimuladas con CCL19. Sin embargo, la misma estrategia se puede utilizar con las células T de ratón primario, líneas de células T o cualquier otro tipo de células sensibles a la estimulación de quimiocina. La estrategia gating que aquí se presenta incluye una serie de ventanas que se seleccionan los eventos enfocados, entonces las células individuales. Por último, la gama de intensidad de fluorescencia se sigue aquí como un ejemplo en do...

La señalización de quimiocinas provoca marcadas alteraciones de la morfología celular y algunas redistribuciones importantes de las proteínas intracelulares. Aquí, se proporciona un protocolo rápido y detallado para estudiar estos eventos.

Análisis rápido y robusto de Celular y Molecular Polarización Inducida por Chemokine Señalización

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

El objetivo del siguiente procedimiento es cuantificar rápida y automáticamente los cambios en la morfología celular y la localización subcelular de proteínas específicas de interés en un gran número de células en respuesta a un estímulo particular. Esto se logra estimulando primero las células T con los tipos de quimioterapia de interés. En el segundo paso, las células se marcan con fluorescencia y luego se analizan mediante citometría de flujo por imágenes.En el paso final, se puede evaluar el número de linfocitos morfológicamente polarizados y la cantidad de segregación de los marcadores fluorescentes en función de la ubicación y la intensidad de los píxeles para cada tinción, dependiendo de la máscara elegida. En última instancia, esta tecnología de citometría de flujo de imágenes se puede utilizar para cuantificar de forma rápida y robusta los cambios morfológicos de los linfocitos después de la estimulación con quimiocinas, así como la ubicación de proteínas específicas de interés dentro de las células polarizadas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía, es que un gran número de células pueden ser procesadas repetidamente y analizadas automáticamente, asegurando un análisis estadísticamente sólido de los cambios morfológicos y la distribución de proteínas.En los linfocitos T estimulados por quimiocinas, la estimulación de las células T de tipo Boche comienza lavando cinco veces el centro de las cinco células por condición experimental en HBSS caliente suplementado con 10 milimolares HEPs centrífuga durante cinco minutos a 340 veces G.At temperatura ambiente, retire el supinato y vuelva a suspender los gránulos en 0,3 mililitros de HBSS caliente la pieza por tubo. A continuación, transfiera las suspensiones de las células a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue de 10 a 500 nanogramos por mililitro de quimiocina a cada tubo y luego voltee los tubos varias veces para mezclar.Incubar las células en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de ocho a 10 minutos, detenga la polarización con 0,3 mililitros de paraldehído tibio al 2% suplementado con 10 milimolares. Él guisantes.A continuación, mezcle los tubos con más volteo e incube durante otros cinco minutos a 37 grados centígrados para teñir las células para el análisis de inmunofluorescencia. A continuación, transfiera las células T estimuladas a los tubos de citometría de flujo correspondientes. Llene los tubos completamente con tampón para tinciones.A continuación, gire las células y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de suero de ternera fetal al 5% en PBS. Ahora agregue cinco microlitros de ZI N-T-H-L-A-A-B-C a cada tubo. Vórdelas e incuba las células durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad al final de la incubación.Lavar las células dos veces y luego incubarlas en 500 microlitros de 1% de formaldehído. Después de 10 minutos, lave las células con más tampón de tinción y luego llene los tubos completamente con tampón de permeación. Después de lavar las células dos veces en el tampón de permeación, dejó los tubos para eliminar el supinato y luego los vórtice para disociar los gránulos de la célula.Ahora tiñe las muestras con cero coma 25 microgramos por mililitro, trixi para lomo, vórtalas e incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, al final del período de incubación, lave las células en tampón de permeación. De nuevo, resus.Suspenda los gránulos en 200 microlitros de PBS y luego transfiera las células a tubos de microcentrífuga individuales para determinar el porcentaje de células T polarizadas después de la estimulación con quimiocinas. Primero encienda el citómetro de flujo de imágenes y deje que se calibre de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dibuje histogramas que cuantifiquen los valores de gradiente RMS a partir de la población enfocada seleccionada en el degradado RMS.El histograma delinea la población de células individuales en un histograma del área una vez que el tubo de microcentrífuga se ha insertado en la máquina, ajusta la marcha de potencia del láser en células individuales y adquiere 5.000 linfocitos T. En el software de análisis de ideas. Abra los archivos adquiridos, luego cree un histograma que muestre el valor RMS del gradiente para las imágenes de campo claro obtenidas para cada celda individual, dibujando una puerta en las celdas, exhibiendo un valor de gradiente RMS superior a 57.En el menú de análisis, cree una nueva máscara llamada erode M1 dos a partir de la máscara de morfología en las imágenes de campo claro M cero uno erosionado de dos píxeles. A continuación, en el menú de características de análisis, cree una nueva entidad del área calculada en la máscara de erosión M1 dos a partir de las celdas creadas en la puerta anterior. Abra un histograma que muestre el área de las celdas Con esta máscara recién creada, dibuje una puerta en las celdas T individuales, excluyendo las cuentas de calibración y los desechos en el área pequeña, así como los dobletes en el área grande.A continuación, abra a. bot que consiste en el máximo bruto en la tinción H-L-A-A-B-C en función del píxel máximo bruto en la tinción Phin en el menú de máscaras de análisis trasero a la nueva máscara llamada erosión M dos dos de la máscara de morfología de las células de tinción H-L-A-A-B-C erosionadas de dos píxeles. A continuación, en el menú de características de análisis, cree una nueva característica que consista en el parámetro de circularidad calculado sobre la erosión, M, dos, dos.A continuación, cree otro histograma para informar de los valores de la entidad de circularidad de las celdas previamente controladas. A continuación, se observa la forma del histograma para las células no estimuladas, el ágata RO para las células polarizadas, comenzando en el valor de circularidad más bajo hasta el valor límite de circularidad donde se trazan la mayoría de las células no estimuladas para evaluar la polarización de la tinción de actina dentro de las células. Además de un histograma para la similitud de detalles brillantes, R tres valores para comparar el H-L-A-A-B-C y el foid en la tinción.A continuación, se utiliza la misma estrategia de compuerta que se acaba de demostrar, más un AG en las células no estimuladas para la tinción segregada no colocalizada. El panel de estadísticas muestra el porcentaje de células T con tinción de actina polarizada aquí. Se muestran ejemplos de linfocitos T estimulados por CCL 19 que caen en la puerta de las células polarizadas o no polarizadas.Se pueden observar claramente diferencias en la morfología entre ambas subpoblaciones. La estrategia de compuerta recién demostrada también se puede utilizar para trazar el porcentaje de células que caen en la puerta polarizada en ausencia de presencia de CCL 19. Como se esperaba, está claro que la estimulación con quimiocinas aumenta el porcentaje de células T polarizadas.También se puede trazar el índice de circularidad medio de toda la población celular obtenido en ambas condiciones. De hecho, la estimulación de CCL 19 provoca una caída en este índice. Sin embargo, como solo la mitad de las células están polarizadas, el cambio en el índice de circularidad medio observado tras la estimulación de CCL 19 es pequeño.En este experimento, las células T fueron seccionadas con GFP junto con plásmidos que codifican para los mutantes negativos dominantes del complejo de polaridad par seis. PKC zeta. El histograma de las células no transfectadas permitió una activación específica para las células T positivas para GFP relevantes, lo que indica que se ha transfectado una pequeña fracción de toda la población de células.A continuación, se cuantificó el grado de polarización morfológica de estas células transfectadas midiendo únicamente el índice de circularidad de las células GFP positivas y una marcha adicional para las células T. Se crearon valores bajos de circularidad para estimar el porcentaje de celdas polarizadas en cada condición tomada. En conjunto, estos datos demuestran que la interrupción de la función de la vía de señalización PK CZ par seis inhibe la polarización de las células T inducida por las quimiocinas CCL 19 y c Xcl 12.En línea con los hallazgos previos. Al intentar este procedimiento, es muy importante trabajar siempre a 37 grados centígrados durante todo el paso de estimulación de la insolución y la posterior fijación para asegurar una polarización morfológica fuerte y confiable de los linfocitos.

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

A continuación, describimos los métodos detallados en vivo de imágenes de células para la investigación de la quimiotaxis. Se presenta fluorescencia microscópica métodos para controlar la dinámica espacio-temporal de los eventos de señalización en las células que migran. La medición de la señalización de eventos nos permite entender mejor cómo una red de señalización de GPCR logra gradiente de detección de factores quimiotácticos y los controles de la migración direccional de las células...

Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum</em

Este video muestra el ensayo de quimiotaxis de neutrófilos utilizando un método todo en chip. El método permite el aislamiento directo de neutrófilos de la sangre total mediante selección inmunomagnética negativa seguida de un ensayo de quimiotaxis en un chip microfluídico.

Un método basado en chips microfluídicos para el análisis rápido de quimiotaxis de neutrófilos utilizando sangre total

Se presenta una forma de obtener nuevos conocimientos sobre la complejidad de la respuesta inflamatoria cerebral. Describimos protocolos basados en inmunofluorescencia seguidos de análisis confocal tridimensional para investigar el patrón de coexpresión de marcadores fenotípicos de microglía/macrófagos en un modelo murino de isquemia focal.

Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury

A nivel subcelular, los eventos de señalización son modulados dinámicamente por señales de desarrollo y ambientales. Aquí describimos un protocolo que emplea el sistema de expresión transitoria del tabaco para monitorear la interacción dinámica proteína-proteína y para revelar la organización espacial de la transducción de señales en células vegetales.

La formación de imágenes reorganización espacial de una vía de señalización MAPK Usando el sistema de expresión transitoria del Tabaco

ensayos de quimiotaxis visuales son esenciales para una mejor comprensión de cómo las células eucariotas controlar la migración de células direccional quimioatrayente mediada. A continuación, se describen los métodos detallados para: 1) en tiempo real, monitoreo de alta resolución de múltiples ensayos de quimiotaxis, y 2) visualizar simultáneamente el gradiente quimioatrayente y la dinámica espacio-temporal de los acontecimientos en las células HL60 neutrófilos como señalización.

Imaging G acoplados a proteínas mediada por el receptor de quimiotaxis y sus eventos de señalización en células HL60 neutrófilos como

Este artículo proporciona el método detallado de realizar un ensayo rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando el aislamiento de neutrófilos a bordo de la sangre entera y la prueba de quimiotaxis en un único chip microfluídico.

Un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Aquí describimos los métodos para evaluar la respuesta celular al estímulo mecánico agudo. En el análisis de microscopía, examinamos localización de biosensores marcada con fluorescencia Tras estimulación breve con esquileo del flujo. También probamos la activación de diversas proteínas de interés en respuesta a la estimulación mecánica aguda bioquímicamente.

Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda

Presentamos un protocolo para obtener firmas de Proteómica de macrófagos humanos y aplicar esto a la determinación del impacto de un ambiente de poco oxígeno en polarización de macrófagos.

Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno

Describimos un método para construir dispositivos para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares. Este dispositivo permite el análisis de las respuestas celulares a señales solubles en microambientes 3D con degradados de quimioattractant definidos. Los organoides son mejores que las células individuales en la detección de entradas ruidosas débiles.

Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant

Para probar el efecto de una quimiocina en el reclutamiento in vivo de macrófagos, se utilizó toda la hibridación in situ del monte para detectar la expresión ectópica de la quimiocina, y se utilizó inmunomanchado para etiquetar los macrófagos. Las imágenes en vivo se utilizaron para la observación en tiempo real de la migración de macrófagos.

Un modelo de expresión de chemocina ectópico para probar el reclutamiento de macrófagos in Vivo

Aprende a cuantificar cambios morfológicos y localización proteica en linfocitos T mediante citometría de flujo con imagen. Este protocolo permite analizar grandes poblaciones celulares de forma rápida y robusta.

Análisis rápido y robusto de Celular y Molecular Polarización Inducida por Chemokine Señalización

Explorar más videos