Análisis rápido y robusto de Celular y Molecular Polarización Inducida por Chemokine Señalización

El objetivo del siguiente procedimiento es cuantificar rápida y automáticamente los cambios en la morfología celular y la localización subcelular de proteínas específicas de interés en un gran número de células en respuesta a un estímulo particular. Esto se logra estimulando primero las células T con los tipos de quimioterapia de interés. En el segundo paso, las células se marcan con fluorescencia y luego se analizan mediante citometría de flujo por imágenes.

En el paso final, se puede evaluar el número de linfocitos morfológicamente polarizados y la cantidad de segregación de los marcadores fluorescentes en función de la ubicación y la intensidad de los píxeles para cada tinción, dependiendo de la máscara elegida. En última instancia, esta tecnología de citometría de flujo de imágenes se puede utilizar para cuantificar de forma rápida y robusta los cambios morfológicos de los linfocitos después de la estimulación con quimiocinas, así como la ubicación de proteínas específicas de interés dentro de las células polarizadas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía, es que un gran número de células pueden ser procesadas repetidamente y analizadas automáticamente, asegurando un análisis estadísticamente sólido de los cambios morfológicos y la distribución de proteínas.

En los linfocitos T estimulados por quimiocinas, la estimulación de las células T de tipo Boche comienza lavando cinco veces el centro de las cinco células por condición experimental en HBSS caliente suplementado con 10 milimolares HEPs centrífuga durante cinco minutos a 340 veces G.At temperatura ambiente, retire el supinato y vuelva a suspender los gránulos en 0,3 mililitros de HBSS caliente la pieza por tubo. A continuación, transfiera las suspensiones de las células a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue de 10 a 500 nanogramos por mililitro de quimiocina a cada tubo y luego voltee los tubos varias veces para mezclar.

Incubar las células en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de ocho a 10 minutos, detenga la polarización con 0,3 mililitros de paraldehído tibio al 2% suplementado con 10 milimolares. Él guisantes.

A continuación, mezcle los tubos con más volteo e incube durante otros cinco minutos a 37 grados centígrados para teñir las células para el análisis de inmunofluorescencia. A continuación, transfiera las células T estimuladas a los tubos de citometría de flujo correspondientes. Llene los tubos completamente con tampón para tinciones.

A continuación, gire las células y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de suero de ternera fetal al 5% en PBS. Ahora agregue cinco microlitros de ZI N-T-H-L-A-A-B-C a cada tubo. Vórdelas e incuba las células durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad al final de la incubación.

Lavar las células dos veces y luego incubarlas en 500 microlitros de 1% de formaldehído. Después de 10 minutos, lave las células con más tampón de tinción y luego llene los tubos completamente con tampón de permeación. Después de lavar las células dos veces en el tampón de permeación, dejó los tubos para eliminar el supinato y luego los vórtice para disociar los gránulos de la célula.

Ahora tiñe las muestras con cero coma 25 microgramos por mililitro, trixi para lomo, vórtalas e incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, al final del período de incubación, lave las células en tampón de permeación. De nuevo, resus.

Suspenda los gránulos en 200 microlitros de PBS y luego transfiera las células a tubos de microcentrífuga individuales para determinar el porcentaje de células T polarizadas después de la estimulación con quimiocinas. Primero encienda el citómetro de flujo de imágenes y deje que se calibre de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dibuje histogramas que cuantifiquen los valores de gradiente RMS a partir de la población enfocada seleccionada en el degradado RMS.

El histograma delinea la población de células individuales en un histograma del área una vez que el tubo de microcentrífuga se ha insertado en la máquina, ajusta la marcha de potencia del láser en células individuales y adquiere 5.000 linfocitos T. En el software de análisis de ideas. Abra los archivos adquiridos, luego cree un histograma que muestre el valor RMS del gradiente para las imágenes de campo claro obtenidas para cada celda individual, dibujando una puerta en las celdas, exhibiendo un valor de gradiente RMS superior a 57.

En el menú de análisis, cree una nueva máscara llamada erode M1 dos a partir de la máscara de morfología en las imágenes de campo claro M cero uno erosionado de dos píxeles. A continuación, en el menú de características de análisis, cree una nueva entidad del área calculada en la máscara de erosión M1 dos a partir de las celdas creadas en la puerta anterior. Abra un histograma que muestre el área de las celdas Con esta máscara recién creada, dibuje una puerta en las celdas T individuales, excluyendo las cuentas de calibración y los desechos en el área pequeña, así como los dobletes en el área grande.

A continuación, abra a. bot que consiste en el máximo bruto en la tinción H-L-A-A-B-C en función del píxel máximo bruto en la tinción Phin en el menú de máscaras de análisis trasero a la nueva máscara llamada erosión M dos dos de la máscara de morfología de las células de tinción H-L-A-A-B-C erosionadas de dos píxeles. A continuación, en el menú de características de análisis, cree una nueva característica que consista en el parámetro de circularidad calculado sobre la erosión, M, dos, dos.

A continuación, cree otro histograma para informar de los valores de la entidad de circularidad de las celdas previamente controladas. A continuación, se observa la forma del histograma para las células no estimuladas, el ágata RO para las células polarizadas, comenzando en el valor de circularidad más bajo hasta el valor límite de circularidad donde se trazan la mayoría de las células no estimuladas para evaluar la polarización de la tinción de actina dentro de las células. Además de un histograma para la similitud de detalles brillantes, R tres valores para comparar el H-L-A-A-B-C y el foid en la tinción.

A continuación, se utiliza la misma estrategia de compuerta que se acaba de demostrar, más un AG en las células no estimuladas para la tinción segregada no colocalizada. El panel de estadísticas muestra el porcentaje de células T con tinción de actina polarizada aquí. Se muestran ejemplos de linfocitos T estimulados por CCL 19 que caen en la puerta de las células polarizadas o no polarizadas.

Se pueden observar claramente diferencias en la morfología entre ambas subpoblaciones. La estrategia de compuerta recién demostrada también se puede utilizar para trazar el porcentaje de células que caen en la puerta polarizada en ausencia de presencia de CCL 19. Como se esperaba, está claro que la estimulación con quimiocinas aumenta el porcentaje de células T polarizadas.

También se puede trazar el índice de circularidad medio de toda la población celular obtenido en ambas condiciones. De hecho, la estimulación de CCL 19 provoca una caída en este índice. Sin embargo, como solo la mitad de las células están polarizadas, el cambio en el índice de circularidad medio observado tras la estimulación de CCL 19 es pequeño.

En este experimento, las células T fueron seccionadas con GFP junto con plásmidos que codifican para los mutantes negativos dominantes del complejo de polaridad par seis. PKC zeta. El histograma de las células no transfectadas permitió una activación específica para las células T positivas para GFP relevantes, lo que indica que se ha transfectado una pequeña fracción de toda la población de células.

A continuación, se cuantificó el grado de polarización morfológica de estas células transfectadas midiendo únicamente el índice de circularidad de las células GFP positivas y una marcha adicional para las células T. Se crearon valores bajos de circularidad para estimar el porcentaje de celdas polarizadas en cada condición tomada. En conjunto, estos datos demuestran que la interrupción de la función de la vía de señalización PK CZ par seis inhibe la polarización de las células T inducida por las quimiocinas CCL 19 y c Xcl 12.

En línea con los hallazgos previos. Al intentar este procedimiento, es muy importante trabajar siempre a 37 grados centígrados durante todo el paso de estimulación de la insolución y la posterior fijación para asegurar una polarización morfológica fuerte y confiable de los linfocitos.