El uso de nucleótidos Stopped-Flow Fluorescencia y etiquetadas para Analizar el Ciclo de Facturación ATP de Kinesins

El objetivo general de este procedimiento es medir la cinética de la unión y disociación de nucleótidos durante el ciclo de recambio A TP de una kinesina. Esto se logra preparando primero la proteína kinesina, ya sea libre de nucleótido o cargada con nucleótido marcado con fluorescencia. A continuación, la kinesina preparada se mezcla con el nucleótido utilizando un fluorímetro de flujo detenido y se observa el cambio en la fluorescencia asociado con la unión o disociación del nucleótido marcado con fluorescencia.

Luego, el cambio en la fluorescencia se ajusta a una función exponencial para obtener una constante de velocidad. Por último, las constantes de tasa medidas se descentralizan y las constantes de tasa se atribuyen a transiciones particulares del ciclo de rotación A TP. En última instancia, la combinación de nucleótido marcado con fluorescencia y fluorescencia de flujo detenido se utiliza para medir la cinética de la unión y disociación de nucleótidos.

CIN Para demostrar el procedimiento, Jennifer Patel y Hannah Belch, una estudiante de posgrado de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. Después de determinar la intensidad de fluorescencia de la kinesina tras la unión del nucleótido marcado por el hombre, como se describe en el protocolo de texto, a una solución de hasta 20 micromolares de kinesina en tampón libre de magnesio a un milimolar de EDTA y un milimolar de DTT, incubar la solución durante 15 minutos a 25 grados Celsius, configurar una columna de filtración de gel G 25 SX de flujo por gravedad y equilibrar con al menos tres volúmenes de columna de magnesio libre búfer. A continuación, cargue la solución de essin en la columna para separar los nucleótidos libres y el EDTA de la kinesina.

Repare un tubo colector agregando un volumen de solución de cloruro de magnesio de 100 milimolares al tubo vacío, de modo que la concentración final de cloruro de magnesio sea de un milimolar. Después de la recolección de la solución de kinesina, el uso de un tampón libre de magnesio adecuado eluye rápidamente la kinesina. La presencia de cloruro de magnesio en el tubo de recolección ayuda a estabilizar la kinesina inmediatamente después de Ian de la columna, almacene la kinesina en hielo y úsela dentro de una o dos horas.

Mientras tanto, prepara a un hombre una serie de concentración de TP. Elija el rango de concentraciones de acuerdo con la concentración disponible de kinesina. Para cada concentración de mant, un TP prepare una concentración adecuada de kinesina de tal manera que el nucleótido marcado con el hombre tenga un exceso molar de cinco a diez veces mayor que los sitios de unión del nucleótido de kinesina.

Ajuste la longitud de onda de excitación en el fluorímetro de flujo detenido a 365 nanómetros y la longitud de onda de emisión por encima de 400 nanómetros con un filtro de paso largo. A continuación, comenzando con la concentración más baja de Manta TP, use el fluorímetro de flujo detenido para mezclar el Manta TP y la kinesina libre de nucleótidos en una proporción de volumen a volumen de uno a uno. Usando la siguiente fórmula, ajuste el cambio en la medida de intensidad de fluorescencia para enseñar la concentración de mant A TP a una función exponencial, más una línea de pendiente negativa constante para tener en cuenta el fotoblanqueo del grupo mant.

A partir de estos ajustes, determine una constante de velocidad en cada concentración de manto. A continuación, un TP involuciona las tasas de asociación y disociación mediante el uso de hilo dental contra la concentración de mant. A TP A continuación, ajuste estos datos a una función lineal para obtener el gradiente y la intersección del eje y.

El gradiente representa la constante de velocidad para el hombre, una asociación TP con unidades por molar por segundo. La intersección representa la constante de la tasa de disociación con las unidades por segundo. Para medir la tasa de disociación, fermente constantemente un DP a una solución de dos quinesinas micromolares en un tampón adecuado a 50.

Micromolar significaba una incubadora DP a 25 grados centígrados durante 30 minutos. Después de usar una columna G 25 Sedex para eliminar el refrigerante A DP de la kinesina, cargado con mant A DP, y configurar el fluter de flujo de parada como se describió anteriormente en este video, use el flujo detenido para mezclar el complejo de quinina DP DP con un exceso molar de 50 veces o más de A TP sin etiquetar en una relación de volumen a volumen de uno a uno. La disminución de la intensidad de la fluorescencia observada a lo largo del tiempo a una sola función exponencial, más una línea de pendiente negativa constante para permitir el fotoblanqueo del grupo.

El kops determinado a partir de este ajuste es la constante de velocidad para la disociación del mant A DP con unidades de por segundo. La magnitud del cambio de señal al unirse o disociarse del nucleótido de madera de mantley depende de la kinesina particular. Por lo tanto, es útil realizar primero mediciones de equilibrio para confirmar tanto la presencia como la magnitud de un cambio de intensidad fluorescente.

Aquí se muestran los espectros fluorescentes que fermentan un TP y un DP tanto en solución como en complejo de la kinesina M CAC. Esta figura representa la reacción que se produce al mezclar un TP con quinesina libre de nucleótidos. Aquí se muestra el aumento de la intensidad de fluorescencia que se produce al unirse el hombre A TP a M CAC, ajustando la constante de velocidad frente al hombre.

Una concentración de TP a una función lineal, como se ve aquí, permite la deconvolución de la constante de velocidad que contribuye a los kops y proporciona la tasa de asociación y disociación del fermento A TP. Esta figura muestra la disminución de la intensidad de fluorescencia observada en el fermento A DP tras la disociación de M CEC, como se ilustra aquí. La constante de velocidad para la disociación del manto A DP de Kinesin se determina ajustando estos datos a una función exponencial. Una vez dominados, estos protocolos se pueden completar en menos de tres horas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la kinesina, también se puede aplicar a otras proteínas de unión a nucleótidos, como la miosina y las proteínas G. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar nucleótidos marcados con fluorescencia y un medidor de flujo de parada para medir la cinética de la unión y disociación de nucleótidos para una kinesina.