Name: El uso de nucleótidos Stopped-Flow Fluorescencia y etiquetadas para Analizar el Ciclo de Facturación ATP de Kinesins (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende a medir la cinética de unión y disociación de nucleótidos en el ciclo de ATP de kinesinas mediante fluorescencia con flujo detenido y nucleótidos marcados. Este método revela mecanismos de proteínas motoras.

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Este trabajo es apoyado por la Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación (BBSRC), la Royal Society y la Universidad de Nottingham.

1. determinación de la intensidad cambio de fluorescencia tras la unión de marcado con Mant de nucleótidos. <ol><li> Añadir 1 M de nucleótidos mant marcado a kinesin 1 M (concentraciones finales) en un tampón de reacción adecuado. Normalmente, un tampón que beneficia el crecimiento y la estabilidad de los microtúbulos se utiliza (véase el debate). Un buffer comúnmente utilizado contiene 80 mM de piperazina-bis-2-etanosulfónico (PIPAS) pH 6,9, 1 mM MgCl 2 y 1 mM de ácido etilenglicol-bis-2-aminoéter tetraacético (EGTA). Nota: La concentración de la quinesina se indica en todos los protocolos se refiere a la concentración de sitios de unión de nucleótidos (es decir, dominios de motor). Existen diferentes kinesins como monómeros, dímeros o tetrámeros y así pueden contener más de un sitio de unión de nucleótidos-por molécula. </li><li> Después de un período de incubación (1-3 min) y usando un fluorímetro estándar, medir el espectro de emisión para el complejo de nucleótidos-kinesin mant marcado. Utilice una longitud de onda de excitación de 365 nm ymedida de la luz emitida desde 400 hasta 500 nm en incrementos de 1nm. </li><li> Hacer una solución de 1 mM nucleótido marcado-mant en el mismo tampón de reacción utilizado en el paso 1.1. </li><li> Medir el espectro de emisión para la única muestra de nucleótidos mant, como se describe anteriormente (véase el paso 1.2). </li><li> Normalizar los espectros de la señal en la longitud de onda de la intensidad de fluorescencia pico del espectro de nucleótidos mant en solución (es decir, sin la quinesina) dividiendo a través de por este valor. </li><li> Trazar la espectros normalizados (por ejemplo, la Figura 2B) para observar las diferencias de intensidad de fluorescencia entre la unida mantATP y / o con destino a mantADP kinesina y mant nucleótido en solución. </li></ol> 2. Medición de las constantes de asociación y disociación de la tasa para mantATP <ol><li> A una solución de hasta 20 kinesin M (véase la discusión) en cualquier Mg 2 + tampón libre apropiado (por ejemplo, 80 mM TUBOS pH 6,9, 1 mM EGTA, 0,1% de Tween 20), añadir 1mM de ácido etilendiaminotetraacético (concentración final) (EDTA) y 1 mM (concentración final) de ditiotreitol (DTT). Nota: Se recomienda la adición de Tween 20 en el búfer, ya que reduce / previene la pérdida de la proteína kinesin en la columna utilizada para el intercambio de tampón (Pasos 2.3 y 3.3) </li><li> Incubar la solución a 25 ° C durante 15 min. </li><li> Nucleótidos independiente libre de EDTA y de la quinesina usando una columna de filtración de gel G-25 Sephadex flujo por gravedad de acuerdo con las instrucciones del fabricante (véase la lista de materiales). <ol><li> Equilibrar la columna con al menos 3 volúmenes de columna de un tampón apropiado exento de Mg 2 + (ver el paso 2.1). Cargar la solución que contiene la quinesina-en la columna. Preparar un tubo de recogida mediante la adición de un volumen apropiado de solución de cloruro de magnesio 100 mM al tubo de vacío, de tal manera que la concentración final de cloruro de magnesio es de 1 mM después de la recogida de la solución de quinesina. Además inmediata de cloruro de magnesio ayuda StabiliSE La kinesina sin nucleótidos. </li><li> Eluir la quinesina utilizando un tampón apropiado exento de Mg 2 +. Kinesins son inestables cuando está libre de nucleótido por lo que es importante trabajar con rapidez. Guarde la kinesin-nucleótido libre en hielo y utilizar dentro de 1-2 horas. </li></ol></li><li> Durante o antes de la preparación de la quinesina-nucleótido libre, preparar una serie de concentración mantATP en el mismo tampón de reacción como la solución final de la quinesina-nucleótido libre. Determinar la gama de concentraciones de mantATP requeridos de acuerdo a la concentración disponible de quinesina con una serie típica que varía de 0,1 a 50 M (véase el paso 2.5 y discusión). </li><li> Preparar una serie de concentraciones de kinesin-nucleótido libre. Para cada concentración de mantATP (Paso 2.4), una concentración de la quinesina-nucleótido libre debe ser preparado de tal manera que el nucleótido marcado es-mant en 5 a 10 veces el exceso molar sobre los sitios de unión de nucleótidos quinesina. </li><li> Ajuste la longitud de onda de excitación en la flo-paradow fluorímetro a 365 nm y recoger la luz emitida a&gt; 400 nm utilizando un filtro de paso largo. </li><li> A partir de la concentración más baja de mantATP, mezclar el mantATP con una concentración apropiada de la quinesina-nucleótido libre en una proporción de 1: 1 v / v utilizando un fluorímetro de flujo detenido (Figura 3A y 3B recuadro). Nota: Los reactivos se diluyen en un 50% a la mezcla. Mantenga una nota de la concentración de nucleótidos tanto de mezcla previa y posterior (es decir, 3,0 / 1,5 M) para evitar confusiones. </li><li> Montar el cambio en la intensidad de fluorescencia medida a cada concentración de mantATP a una función exponencial, más una línea de pendiente negativa constante para dar cuenta de photobleaching del grupo mant (es decir, fluorescencia = A 0 .exp (k .t obs) + (m. t + c), donde A 0 es la amplitud, k obs es la constante de velocidad y t es el tiempo, ver Figura 3B y discusión). A partir de estos ajustes determinar unvelocidad constante (k obs) en cada concentración de mantATP. Cada k obs es una convolución de una constante de velocidad de asociación y disociación (Figura 1, k 1 y k -1). </li><li> Deconvoluir las constantes de asociación y disociación de tasas por el trazado de k obs contra la concentración mantATP (por ejemplo, la Figura 3C). Coloque estos datos a una función lineal (es decir, k obs = k 1 [mantATP] + k-1) para obtener el gradiente y el eje y de intercepción. El gradiente representa la constante de velocidad para la asociación mantATP (Figura 1, k 1) con las unidades de M -1 s -1. La intersección representa la constante de velocidad de disociación (Figura 1, k -1) con unidades de s -1 (véase la discusión). Nota: Este enfoque también se puede aplicar para determinar la asociación y la disociación ADPconstantes de velocidad (Figura 1, k y k -4 4) mediante el uso de mantADP como el nucleótido. </li></ol> 3. Medición de la disociación velocidad constante durante mantADP <ol><li> A una solución de 2 M quinesina en un tampón de reacción adecuado (por ejemplo, 80 TUBOS mM pH 6,9, 1 mM de MgCl2, 1 mM EGTA, 0,1% de Tween 20), añadir 50 mM mantADP (concentración final). </li><li> Se incuba a 25 ° C durante 30 min. </li><li> Eliminar el exceso de mantADP y otra de nucleótidos libre por el intercambio de tampón de la quinesina en el tampón de reacción elegido utilizando una columna de Sephadex G-25 (véase la lista de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El dominio motor quinesina ahora debe cargarse con mantADP. </li><li> Ajuste la longitud de onda de excitación en el fluorímetro de flujo detenido a 365 nm y recoger la luz emitida a&gt; 400 nm utilizando un filtro de paso largo. </li><li> Mezclar el complejo mantADP.kinesin (~ 1μM) con un 50 veces o más molar exceso de ATP no marcado en una proporción de 1: 1 v / v utilizando un fluorímetro de flujo detenido (Figura 4A y 4B recuadro). </li><li> Montar la disminución de la intensidad de la fluorescencia observada con el tiempo para una sola función exponencial además de una línea de pendiente negativa constante para dar cuenta de photobleaching del grupo mant (es decir, fluorescencia = A 0 .exp (k .t obs) + (+ m.t c), donde A 0 es la amplitud, k obs es la constante de velocidad y t es el tiempo, véase la figura 4B y discusión). La obs k determinado a partir de este ajuste es la constante de velocidad para la disociación de ADP (Figura 1, k 4) con las unidades de s -1 (véase la discusión). </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

A continuación, presentamos los protocolos para la observación y el análisis de la cinética de las transiciones entre estados de nucleótidos para un kinesina. Estos protocolos utilizan el rápido método de mezcla de flujo detenido junto con nucleótidos marcados con fluorescencia. Los métodos de este tipo se han utilizado ampliamente para estudiar la unión de nucleótidos y de disociación para una variedad de kinesins 9-11,13-16. Los métodos descritos no permiten la observación de la liberación de fosfato (figura 1, paso 3). Sin embargo, la fluorescencia de flujo detenido se puede utilizar para observar esta transición mediante el uso de una proteína de detección de fosfato para acoplar la producción de fosfato a un cambio de intensidad de fluorescencia 17. Los métodos presentados uso de nucleótidos marcados con el pequeño methylanthraniloyl fluoróforo (mant), que generalmente presentan un aumento de la intensidad de fluorescencia cuando se une a la proteína. Además, el fluoróforo mant, cuando se conjuga a cualquiera de las posiciones 2 &#39;o 3&#39; en la posición ribose, a menudo tiene poco o ningún efecto sobre la unión, disociación o hidrólisis de los nucleótidos 9-12. Nucleótidos marcados con Mant están fácilmente disponibles de fuentes comerciales (véase la lista de materiales) y se proporcionan como mezclas de los 2 &#39;y 3&#39; conjugado, ya que rápidamente re-equilibran cuando se purifica a un único isómero 8. Nucleótidos Mant marcado excelentes moléculas indicadoras de que la cinética de unión de nucleótidos y la disociación se pueden observar. El uso de nucleótidos marcados con fluorescencia significa que la lectura de los ensayos descritos es un cambio en tiempo real en la intensidad de fluorescencia. Esto hace que estos ensayos ideal para la fluorescencia de flujo detenido, lo que permite un mezclado rápido de los reactivos y la observación en tiempo real de los cambios en la fluorescencia asociada con la reacción posterior. La combinación de flujo detenido como la técnica de mezcla y de fluorescencia como el método de detección produce un sistema que es relativamente muestra efciente. Por ejemplo, para adquirir los datos mostrados en la Figura 3C requiere 0,8 a 1,0 mg de kinesin-13 purificada, MCAK, y para adquirir los datos mostrados en la Figura 4B requiere ~ 0,3 mg de kinesin-13 purificada, MCAK. Un inconveniente de la utilización de mant como un fluoróforo es que es propenso a photobleaching. Esto se puede observar en el aislamiento de kinesin cinética de la reacción mediante la mezcla de una solución de nucleótidos mant marcado con tampón de reacción, en ausencia de quinesina, en el de flujo detenido. Se observa una disminución lenta de la intensidad de fluorescencia como el grupo se convierte en mant blanqueada. En el intervalo de escalas de tiempo utilizadas en los protocolos de photobleaching del grupo mant descritos está bien descrita por una función lineal. Por lo tanto, una forma sencilla de corregir datos para photobleaching es ajustar a una función exponencial con una línea de base descrita por una función lineal (es decir, mt + c) en lugar de la línea de base plana más común, descrito por un único parámetro. mantATP vinculante Al medir las constantes de velocidad de asociación y disociación de mantATP (Sección 2) la ADP, que permanece asociado con el sitio de unión de nucleótidos-kinesina en ausencia de microtúbulos, debe ser eliminado. Esto permite la asociación mantATP y disociación (figura 1, paso 1) que deben observarse en forma aislada de disociación ADP. Para conseguir esto, la quinesina se incuba con al menos un exceso de 50 veces de EDTA sobre los sitios de unión de nucleótidos (paso 2.1). El EDTA secuestra iones Mg 2 + Mg 2 + causando de disociarse de la cavidad de unión de nucleótidos, lo que resulta en la liberación del nucleótido 11. Por lo tanto, al realizar los pasos 2.1 a 2.3, es vital utilizar un buffer libre de Mg 2 +. La proteína kinesin-nucleótido libre es el tampón de separarlo tanto desde el nucleótido libre y de EDTA. Para llevar a cabo esta separación, un ge desechable de flujo por gravedadl columna de filtración es suficiente y es sencillo y rápido de usar (vea la lista de materiales). La interacción de mantATP con la quinesina de nucleótidos libres se lleva a cabo en un intervalo de concentraciones mantATP (Paso 2.4) para permitir la deconvolución de las constantes de velocidad de asociación y disociación (paso 2.8). La teoría detrás de los experimentos de este tipo está bien descrito en la referencia 18 En la realización de estos experimentos se comienza con la concentración más baja de mantATP. Esto elimina la necesidad de etapas de lavado entre las diferentes concentraciones. Es probable que sea necesario ajustar la sensibilidad del fluorímetro de flujo detenido como la concentración mantATP se incrementa. La concentración mantATP siempre debe ser superior al menos 5 veces más que la concentración de sitios de unión de nucleótidos kinesina mantener pseudo primer orden. Sin embargo, a medida que aumenta la concentración de mantATP, el cambio de señal puede llegar a ser inundado como la fracción de nucleótidos que se une a kinesin disminuye. Therefore, la concentración de la quinesina también se incrementa para cada nueva concentración de mantATP tal que la concentración de mantATP nunca es mayor que un exceso molar de 10 veces más sitios de unión de nucleótidos (paso 2.6). mantADP Disociación Aunque las constantes de asociación y de velocidad de disociación para mantADP pueden determinarse por el mismo método descrito para mantATP (Sección 2). La disociación de ADP a partir de una quinesina se puede observar directamente mediante la precarga del sitio de unión de nucleótidos con mantADP (Pasos 3.1 a 3.3) El complejo mantADP.kinesin se mezcla entonces con un exceso de ATP no marcado (paso 3.5). El exceso de ATP no marcado impide reconsolidación del mantADP a la quinesina y por lo tanto permite que la reacción de disociación (Figura 1, 4 k) para ser observada en el aislamiento de la asociación de mantADP. En este ensayo la concentración de ATP no marcado debe ser al menos un exceso molar de 50 veces de nucleotide sitios de unión. La teoría detrás de este ensayo está bien descrito en referencia 18. Este método directo da un valor más exacto para la constante de velocidad de la extrapolación para el eje y se describe en el Paso 2.8 disociación. La inclusión de los microtúbulos Los métodos descritos también se pueden utilizar para determinar la cinética de unión de nucleótidos y la disociación en presencia de microtúbulos. Los microtúbulos son introducidos a la jeringa de nucleótidos que contiene antes de la mezcla en el flujo detenido: la jeringa inferior de la Figura 3B y 4B (Adiciones). En esta configuración, la quinesina se reunirá el nucleótido en el mismo tiempo que cumple con los microtúbulos. Se utilizan microtúbulos estabilizados, donde el tiempo de vida del polímero tubulina se extiende por el uso de cualquiera de un producto químico estabilizador, tal como taxol o un análogo de GTP no hidrolizable, tales como guanosina-5 &#39;- [(α, β) -methyleno] trifosfato (GMPCPP, véase la lista de materiales). Es posible usar dos ciclos de polimerización de tubulina con GMPCPP para hacer los microtúbulos que se pueden almacenar durante muchos meses en 9,19 nitrógeno líquido. El uso de los microtúbulos precocinadas reduce significativamente las dificultades prácticas en la realización de estos ensayos. Para incluir los microtúbulos en los ensayos, es importante utilizar un tampón de reacción adecuado para la estabilidad de los microtúbulos. El tampón de elección es TUBOS base, con el tampón más comúnmente usado que contiene 80 mM TUBOS pH 6,9, 1 mM de MgCl 2 y 1 mM EGTA (conocido como BRB80) 20,21. Los métodos descritos no se limitan a utilizar con kinesins, pero pueden adaptarse y aplicarse a cualquier proteína de unión a nucleótidos. Por ejemplo, métodos similares se han aplicado al ciclo de recambio de ATP de los miembros de la familia de la miosina motores moleculares 12,22 y el uso de mant marcado nucleótidos de guanosina se extiende másmétodos de este tipo a GTP hidrólisis de proteínas 23,24.

Las quinesinas son una superfamilia de proteínas caracterizadas por un dominio altamente conservado motor 1. El motor de dominio kinesin interactúa con los microtúbulos en forma de nucleótidos-dependiente. Los miembros de la familia kinesin muestran una gama de funciones de kinesins de translocación, que llevan la carga de una manera dirigida a lo largo de los microtúbulos, la unión a kinesins finales-no-translocación de microtúbulos, que regulan la dinámica de microtúbulos 2,3. Kinesins utilizan la facturación de adensosine-5'-trifosfato (ATP) para regular su interacción con los microtúbulos del citoesqueleto 4-6. La conformación del dominio kinesin motor y por lo tanto su afinidad por los microtúbulos depende de su estado de nucleótidos: ATP, ADP, ADP.Pi o ninguna de nucleótidos pueden unirse (Figura 1). Para entender el mecanismo molecular de una quinesina, se requiere una comprensión de la relación entre la rotación de ATP y la interacción de los microtúbulos. Elrefore, un objetivo importante en el campo de quinesina es caracterizar las propiedades funcionales de los diferentes estados de nucleótidos y la cinética de las transiciones entre ellas, tanto en presencia como en ausencia de microtúbulos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg"> Figura 1 El ciclo simple recambio de ATP para un kinesina consta de cuatro estados posibles: sin nucleótidos (Φ), ATP-atado, ADP.P i -bound y obligado-ADP Cada una de las cuatro transiciones se caracteriza por un delantero y. constante hacia atrás tasa (k x y k-x, respectivamente). Para entender cómo el ciclo química de recambio de ATP se acopla con el ciclo mecánico de la interacción de los microtúbulos, uno debe determinar qué paso en el ciclo de rotación de ATP es limitante de la velocidad en ausencia de microtubEGLAS y luego determinar cómo el ciclo se ve alterado por la presencia de microtúbulos. El ciclo de recambio de ATP más simple consta de cuatro pasos químicos individuales: (1) la unión de ATP al sitio vacío (Φ denota el sitio de vacío, es decir, kinesin-nucleótido libre); (2) la escisión de ATP; (3) la disociación fosfato y (4) la disociación ADP (Figura 1). La etapa limitante de la velocidad ajusta la constante de velocidad para el ciclo de recambio de ATP completa. Por lo tanto, para determinar cuál es el paso limitante de la velocidad cada una de las transiciones individuales debe ser medido y comparado con la constante de velocidad para el ciclo completo. Los métodos para medir el volumen de negocios ATP constante de velocidad total del ciclo no se describen aquí, pero se pueden encontrar en referencia 7. Aquí se describen los métodos por los cuales las constantes de velocidad de pasos químicos individuales se pueden determinar. Hay un número de métodos disponibles para estudiar las transiciones individuales en el ciclo de facturación de una proteína de hidrólisis de nucleótidos. Los métodos presentados aquí toman advantage de las propiedades de nucleótidos marcados con el fluoróforo methylanthraniloyl, por lo general referido como mant, que muestran un cambio en la intensidad de la fluorescencia tras la unión a la proteína 8. El grupo mant se utiliza debido a su pequeño tamaño significa que, cuando se acopla a la ribosa (Figura 2A), que generalmente tiene poco o ningún efecto sobre la cinética de unión de nucleótidos o hidrólisis 9-12. A continuación, presentamos los protocolos que describen el uso de nucleótidos mant marcado, junto con la fluorescencia de flujo detenido, para permitir la observación de nucleótidos vinculante y disociación en el ciclo de recambio de ATP de un kinesina.

<table><tbody><tr><td>2'/3'-(N-metilantraniloil) adenosina-5' trifosfato&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-202</td><td>mantATP</td></tr><tr><td>2'/3'-(N-metilanthraniloyl) adenosina-5'-difosfato&nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-201</td><td>mantADP</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Roche</td><td># 10519979001</td><td>La sal disódica de ATP se produce a una concentración de 100&nbsp; mM en 100&nbsp; mM MgCl2. La concentración debe verificarse por absorción a 260&nbsp; nm (e = 15,400&nbsp; M-1cm-1). Solución almacenada en alícuotas a -20&nbsp; oC.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>0.5&nbsp; M solución madre en agua, pH 8,0. PELIGRO: polvo nocivo si se inhala.</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td>1&nbsp; M solución madre en agua fresca para su uso el mismo día. PELIGRO: polvo nocivo si se inhala o entra en contacto con la piel.</td></tr><tr><td>Columna NAP-5</td><td>GE Healthcare</td><td># 17-0853</td><td>G-25 resina Sephadex columna de filtración de gel de flujo por gravedad</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-405</td><td>análogo no hidrolizable de GTP</td></tr><tr><td>Fluorímetro de flujo detenido&nbsp;</td><td>Fotofísica aplicada</td><td>SX20</td><td>Un fluorímetro con algunas tuberías conectadas, que permite que los reactivos se mezclen rápidamente en la cubeta de observación. Permitiendo así la cinética de las reacciones en escalas de tiempo de ~0.1&nbsp;-&nbsp; 100&nbsp; SEC a ser monitoreado.</td></tr></tbody></table>

el uso de nucleótidos stopped-flow fluorescencia y etiquetadas para analizar el ciclo de facturación atp de kinesins

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

La superfamilia de quinesina de proteínas motoras de microtúbulos asociados comparten un dominio motor característica que tanto hidroliza ATP y se une microtúbulos. Kinesins muestran diferencias entre la superfamilia tanto en el recambio de ATP y en la interacción de los microtúbulos. Estas diferencias adaptar kinesins específicas para diversas funciones, tales como el transporte de carga, los microtúbulos de deslizamiento, la despolimerización de los microtúbulos y la estabilización de los microtúbulos. Para entender el mecanismo de acción de una quinesina es importante comprender cómo el ciclo química de recambio de ATP se acopla con el ciclo mecánico de la interacción de los microtúbulos. Para diseccionar el ciclo de recambio de ATP, un enfoque es utilizar nucleótidos marcados con fluorescencia para visualizar pasos individuales en el ciclo. La determinación de la cinética de cada transición de nucleótidos en el ciclo de recambio de ATP permite a la etapa o etapas limitante de la velocidad para el ciclo completo para ser identificado. Para una quinesina, es importante conocer el paso limitante de la velocidad, enla ausencia de microtúbulos, como este paso generalmente se aceleró varios miles de veces cuando la kinesin interactúa con los microtúbulos. El ciclo en ausencia de microtúbulos a continuación, se compara a la de la presencia de los microtúbulos para entender completamente ciclo de recambio de ATP de una quinesina. La cinética de las transiciones de nucleótidos individuales son generalmente demasiado rápido para observar mezclando manualmente los reactivos, particularmente en la presencia de microtúbulos. Un dispositivo de mezcla rápida, tal como un fluorímetro de flujo detenido, que permite a la cinética que deben observarse en escalas de tiempo de tan poco como unos pocos milisegundos, puede ser usado para monitorear tales transiciones. A continuación, describimos los protocolos en los que un mezclado rápido de los reactivos por flujo detenido se utiliza en conjunción con nucleótidos marcados con fluorescencia para diseccionar el ciclo de recambio de ATP de un quinesina.

Un aumento en la intensidad de fluorescencia del grupo mant se observa típicamente tras la unión del nucleótido mant-marcado a un quinesina. Sin embargo, la magnitud de un cambio de señal de este tipo es dependiente de la quinesina particular en cuestión. Por lo tanto, es útil para realizar mediciones de equilibrio para confirmar tanto la presencia y la magnitud de un cambio de intensidad de fluorescencia antes de progresar a ensayos cinéticos. Espectros de fluorescencia Representante para mantATP y mantADP, tanto en disolución como en el complejo con la kinesin-13, MCAK, se muestran en la Figura 2B. Estos datos ponen de relieve el aumento de la intensidad de fluorescencia mostrada por tanto mantATP y mantADP tras la unión a MCAK. El cambio en la intensidad de fluorescencia en la unión del mant nucleótidos a un kinesina se utiliza para informar sobre la asociación y la disociación de ambos ATP y ADP (Secciones 2 y 3). En el caso de MCAK, se observa una diferencia en la intensidad de fluorescencia entre mantATP.kinesin y mantADP.kinesin La figura 3A representa la reacción que se produce al mezclar mantATP con la quinesina-nucleótido libre. Los datos representativos que ilustran el aumento en la intensidad de fluorescencia que se produce tras la unión de mantATP a la quinesina-13, MCAK se muestra en la Figura 3B. Datos del tipo mostrado en la figura 3B se aplica en un intervalo de concentraciones mantATP. Una parcela de las constantes de velocidad (k obs) determinado frente a la concentración mantATP se muestra en la Figura 3C. Montaje de estos datos a una función lineal (es decir, k = k obs 1 [mantATP] + k -1) permite deconvolución de las constantes de velocidad que contribuyen a k obs (paso 2.8). Por lo tanto, lo que permite la determinación tanto de la asociación y de la constante de velocidad de disociación para mantATP (Figura 1, k 1 y k 1, respectivamente). La Figura 4A representa la reacción que se produce al mezclar mantADP.kinesin con un exceso de ATP no marcado. Los datos en la Figura 4B muestra la disminución de la intensidad de fluorescencia observado para mantADP tras la disociación de la quinesina-13, MCAK. Mediante el ajuste de estos datos a una función exponencial (Paso 3.6) la constante de velocidad para la disociación de mantADP se determina directamente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg"> Figura 2. nucleótidos marcados con el methylanthraniloyl fluoróforo (mant) se utilizan para aislar los pasos individuales en el ciclo de recambio de ATP. (A) Estructura de mantATP que muestra la posición del fluoróforo mant conjugado ya sea a la 2 'o 3' posición en la ribosa. (B) los espectros de fluorescencia normalizada para mantATP y mantADP en solución (maxp) y un mantATPd mantADP en el complejo con el kinesina MCAK (MATP + MCAK y MADP + MCAK). Los espectros mantATP se normalizan a la fluorescencia en el máximo para mantATP en solución y los espectros mantADP se normalizó a la fluorescencia en el máximo para mantADP en solución. Los espectros de los nucleótidos mant mezclados con MCAK se recogen en el puesto de mezcla 1 min. La concentración de los reactivos y los ajustes fluorímetro son como se describe en el protocolo los pasos 1.1 y 1.2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg"> Figura 3. Medición de la constante de velocidad de asociación de mantATP. (A) Esquema que representa la reacción que tiene lugar después de mezcla de flujo detenido: mantATP (MATP) se une al nucleótido libre kinesina. La intensidad de la fluorescencia de los grupos mant aumenta tras la unión a la proteína. (B) el cambio de la señal de fluorescencia (negro) observa al mezclar mantATP (25 M) con MCAK (5 M nu-de los nucleótidos libres,). Estos datos son ajuste (rojo de trazos) a una sola función exponencial además de una línea de pendiente negativa constante, que representa photobleaching del fluoróforo mant (ver discusión) Inserción:. Contenido de las jeringas antes de la mezcla en el fluorímetro de flujo detenido. (C) constantes de velocidad (k obs) determinados para la reacción de mantATP con MCAK sin nucleótidos representan gráficamente frente a la concentración de mantATP. Esta parcela tendrá una región lineal con el gradiente de ser la constante de velocidad de asociación (Figura 1, k 1) con unidades de M -1 s -1 y la ordenada en el origen es la constante de velocidad de disociación (Figura 1, k-1) con unidades de s-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> . Figura 4. Medición de la constante de velocidad de disociación para mantADP (A) Esquema que representa la reacción que tiene lugar mensaje de mezcla de flujo detenido por: kinesin precargado con mantADP se diluye en un exceso de ATP no marcado. Disociar mantADP se sustituye por el ATP no marcado, evitando de este modo la reacción posterior de asociación mantADP (véase el debate). La intensidad de fluorescencia del grupo mant disminuye tras la disociación de la proteína. Disminución (B) de la fluorescencia observada tras la disociación de mantADP de la quinesina MCAK. La señal de fluorescencia (negro) es apto (roja discontinua) a una sola exponencial más una línea de pendiente negativa constante para dar cuenta de photobleaching del grupo mant (véase el debate). La constante de velocidad determinada es la constante de velocidad para la disociación de mantADP (Figura 1, k4) Recuadro:.. Contenido de las jeringas antes de mezclar en un fluorímetro de flujo detenido <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Kinesins se caracterizan por la interacción dependiente de nucleótidos con los microtúbulos: un ciclo de recambio de ATP acoplada a un ciclo de la interacción de los microtúbulos. A continuación, describimos los protocolos para analizar la cinética de las transiciones de nucleótidos individuales en el ciclo de recambio de ATP de un kinesina utilizando nucleótidos marcados con fluorescencia y fluorescencia de flujo detenido.

El uso de nucleótidos Stopped-Flow Fluorescencia y etiquetadas para Analizar el Ciclo de Facturación ATP de Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la cinética de la unión y disociación de nucleótidos durante el ciclo de recambio A TP de una kinesina. Esto se logra preparando primero la proteína kinesina, ya sea libre de nucleótido o cargada con nucleótido marcado con fluorescencia. A continuación, la kinesina preparada se mezcla con el nucleótido utilizando un fluorímetro de flujo detenido y se observa el cambio en la fluorescencia asociado con la unión o disociación del nucleótido marcado con fluorescencia.Luego, el cambio en la fluorescencia se ajusta a una función exponencial para obtener una constante de velocidad. Por último, las constantes de tasa medidas se descentralizan y las constantes de tasa se atribuyen a transiciones particulares del ciclo de rotación A TP. En última instancia, la combinación de nucleótido marcado con fluorescencia y fluorescencia de flujo detenido se utiliza para medir la cinética de la unión y disociación de nucleótidos.CIN Para demostrar el procedimiento, Jennifer Patel y Hannah Belch, una estudiante de posgrado de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. Después de determinar la intensidad de fluorescencia de la kinesina tras la unión del nucleótido marcado por el hombre, como se describe en el protocolo de texto, a una solución de hasta 20 micromolares de kinesina en tampón libre de magnesio a un milimolar de EDTA y un milimolar de DTT, incubar la solución durante 15 minutos a 25 grados Celsius, configurar una columna de filtración de gel G 25 SX de flujo por gravedad y equilibrar con al menos tres volúmenes de columna de magnesio libre búfer. A continuación, cargue la solución de essin en la columna para separar los nucleótidos libres y el EDTA de la kinesina.Repare un tubo colector agregando un volumen de solución de cloruro de magnesio de 100 milimolares al tubo vacío, de modo que la concentración final de cloruro de magnesio sea de un milimolar. Después de la recolección de la solución de kinesina, el uso de un tampón libre de magnesio adecuado eluye rápidamente la kinesina. La presencia de cloruro de magnesio en el tubo de recolección ayuda a estabilizar la kinesina inmediatamente después de Ian de la columna, almacene la kinesina en hielo y úsela dentro de una o dos horas.Mientras tanto, prepara a un hombre una serie de concentración de TP. Elija el rango de concentraciones de acuerdo con la concentración disponible de kinesina. Para cada concentración de mant, un TP prepare una concentración adecuada de kinesina de tal manera que el nucleótido marcado con el hombre tenga un exceso molar de cinco a diez veces mayor que los sitios de unión del nucleótido de kinesina.Ajuste la longitud de onda de excitación en el fluorímetro de flujo detenido a 365 nanómetros y la longitud de onda de emisión por encima de 400 nanómetros con un filtro de paso largo. A continuación, comenzando con la concentración más baja de Manta TP, use el fluorímetro de flujo detenido para mezclar el Manta TP y la kinesina libre de nucleótidos en una proporción de volumen a volumen de uno a uno. Usando la siguiente fórmula, ajuste el cambio en la medida de intensidad de fluorescencia para enseñar la concentración de mant A TP a una función exponencial, más una línea de pendiente negativa constante para tener en cuenta el fotoblanqueo del grupo mant.A partir de estos ajustes, determine una constante de velocidad en cada concentración de manto. A continuación, un TP involuciona las tasas de asociación y disociación mediante el uso de hilo dental contra la concentración de mant. A TP A continuación, ajuste estos datos a una función lineal para obtener el gradiente y la intersección del eje y.El gradiente representa la constante de velocidad para el hombre, una asociación TP con unidades por molar por segundo. La intersección representa la constante de la tasa de disociación con las unidades por segundo. Para medir la tasa de disociación, fermente constantemente un DP a una solución de dos quinesinas micromolares en un tampón adecuado a 50.Micromolar significaba una incubadora DP a 25 grados centígrados durante 30 minutos. Después de usar una columna G 25 Sedex para eliminar el refrigerante A DP de la kinesina, cargado con mant A DP, y configurar el fluter de flujo de parada como se describió anteriormente en este video, use el flujo detenido para mezclar el complejo de quinina DP DP con un exceso molar de 50 veces o más de A TP sin etiquetar en una relación de volumen a volumen de uno a uno. La disminución de la intensidad de la fluorescencia observada a lo largo del tiempo a una sola función exponencial, más una línea de pendiente negativa constante para permitir el fotoblanqueo del grupo.El kops determinado a partir de este ajuste es la constante de velocidad para la disociación del mant A DP con unidades de por segundo. La magnitud del cambio de señal al unirse o disociarse del nucleótido de madera de mantley depende de la kinesina particular. Por lo tanto, es útil realizar primero mediciones de equilibrio para confirmar tanto la presencia como la magnitud de un cambio de intensidad fluorescente.Aquí se muestran los espectros fluorescentes que fermentan un TP y un DP tanto en solución como en complejo de la kinesina M CAC. Esta figura representa la reacción que se produce al mezclar un TP con quinesina libre de nucleótidos. Aquí se muestra el aumento de la intensidad de fluorescencia que se produce al unirse el hombre A TP a M CAC, ajustando la constante de velocidad frente al hombre.Una concentración de TP a una función lineal, como se ve aquí, permite la deconvolución de la constante de velocidad que contribuye a los kops y proporciona la tasa de asociación y disociación del fermento A TP. Esta figura muestra la disminución de la intensidad de fluorescencia observada en el fermento A DP tras la disociación de M CEC, como se ilustra aquí. La constante de velocidad para la disociación del manto A DP de Kinesin se determina ajustando estos datos a una función exponencial. Una vez dominados, estos protocolos se pueden completar en menos de tres horas.Aunque este método puede proporcionar información sobre la kinesina, también se puede aplicar a otras proteínas de unión a nucleótidos, como la miosina y las proteínas G. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar nucleótidos marcados con fluorescencia y un medidor de flujo de parada para medir la cinética de la unión y disociación de nucleótidos para una kinesina.

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Investigación

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