El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología En Vivo

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar las neuronas sensoriales olfativas in vivo para visualizar la morfología y el desarrollo axonal. Esto se logra primero analizando detenidamente el dextrano acoplado con flúor en neuronas sensoriales olfativas individuales. El segundo paso es esperar 24 horas para permitir que el tinte se extienda a los procesos axonales de las neuronas sensoriales.

A continuación, se anestesia un renacuajo y se obtiene una pila de imágenes tridimensionales del bulbo olfativo mediante microscopía multifotónica. El paso final es examinar repetidamente la neurona marcada en el mismo animal después de intervalos de tiempo especificados. En última instancia, la reconstrucción de la morfología celular permite la visualización de cambios en la morfología axonal.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cómo crecen los axones hacia las regiones objetivo en el cerebro anterior y cómo se forman las sinapsis. Antes del experimento. Asegúrese de que la configuración de electroporación consista en un microscopio estereoscópico con una gran distancia de trabajo y esté equipado con iluminación fluorescente y juegos de filtros para el tinte.

Utilizado para la electroporación, utilice una electroporación de celda única dedicada o un generador de pulso cuadrado genérico conectado a un osciloscopio. Conecte las salidas de electroporación a un soporte de pipeta y a un electrodo de baño. Asegúrese de que tanto el soporte de la pipeta como el electrodo de baño contengan hilos de plata recubiertos con una fina capa de cloruro de plata.

A continuación, monte el soporte de pipeta en un micromanipulador para permitir un posicionamiento preciso. Después de eso, fabrique las micropipetas para electroporación con capilares de vidrio de silicato bo con un filamento interno. Ajuste los parámetros de la micropipeta polar para producir un vástago más largo y una micropipeta de apertura de punta más pequeña con alta resistencia a la pipeta para la electroporación de una sola célula.

A continuación, mida la resistencia de la pipeta directamente con la celda única electroporada específica. En este procedimiento, disuelva el dextrano fluorado acoplado a cuatro en el anillo de rana a una concentración de tres milimolares. Divida esta solución madre en pequeñas alícuotas y guarde la que se pueda usar en el futuro en el congelador.

A continuación, rellene la micropipeta con uno a cinco microlitros de solución de dextrano. Agite con cuidado la micropipeta para eliminar las burbujas de aire residuales de la punta de la pipeta. A continuación, monte la micropipeta en el soporte de pipetas.

Asegúrese de que el alambre de plata del interior de la pipeta esté en contacto con la solución de colorante. Ahora, coloque un pequeño trozo de pañuelo en una placa de Petri y cúbralo con una pequeña cantidad de agua que contenga 0.02%trica. A continuación, anestesia un renacuajo pre metamórfico en el agua que contiene 0,02%trica.

Confirme la anestesia adecuada tocándola y asegurándose de que no responda. Luego, transfiera con cuidado el renacuajo a la placa de Petri cubierta de pañuelo. Asegúrese de que el electrodo esté en contacto con el tejido húmedo y coloque la punta de la micropipeta cerca del órgano olfativo del renacuajo con un micromanipulador.

Después de eso, penetra en la piel que cubre el órgano olfativo. Con la punta de la pipeta, avance con cuidado la punta hacia la capa de neuronas sensoriales ubicada en el centro del epitelio olfativo principal o epitelio nasal MRO. Ahora active los pulsos de voltaje cuadrado positivo para transferir el tinte a las neuronas sensoriales mediante la aplicación de un solo polo de voltaje o trenes de múltiples pulsos.

A continuación, visualice el éxito de la extrusión y electroporación del tinte utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia. El tinte se propaga rápidamente en el cuerpo de la célula y las dendritas después de una electroporación exitosa. Después de repetir los procedimientos para el segundo órgano olfativo del renacuajo, transfiera el renacuajo a un vaso de precipitados lleno de agua dulce para su recuperación, y permita que el tinte electroporado se extienda a las neuronas sensoriales y al bulbo olfativo.

Al menos 24 horas después de la electroporación, anestesiar el renacuajo en el agua que contiene 0,02%trica. A continuación, transfiera con cuidado el renacuajo a una cámara de imágenes. Corta un pequeño rectángulo de una tira de param.

A continuación, cubra el renacuajo con el param, dejando el céfalo anterior de la cola a través de la ventana recortada. Fije el parábolo con agujas en el plato sin dañar al renacuajo, y asegúrese de que el renacuajo esté sumergido en suficiente agua que contenga 0.02% de Trica. A continuación, monte la cámara de imágenes en la platina de un microscopio multifotónico vertical o un microscopio confocal.

Adquiera una pila tridimensional de imágenes del bulbo olfatorio y asegúrese de que el procedimiento de imagen no exceda los 10 a 15 minutos. Después de eso, regrese el renacuajo al agua normal en un tanque separado y evite que se exponga a la luz. En esta imagen, cuatro hebras de cubierta acopladas a diferentes fluoro cuatro fueron electroporadas en cuatro ubicaciones distantes del órgano olfativo, lateral indicado por verde, intermedio indicado por amarillo medial indicado por rojo, y el órgano nasal del vómer indicado por naranja.

Esto permite la visualización del bulbo olfativo accesorio y los tres campos de proyección principales del bulbo olfativo principal. Esta imagen muestra reconstrucciones tridimensionales de diferentes patrones de crecimiento axonal de neuronas sensoriales olfativas individuales superpuestas a la estructura del bulbo olfativo, y aquí hay un ejemplo de un axón de una sola neurona sensorial olfativa que se proyecta en el bulbo olfatorio y forma una arborización en penacho en el glomerular esférico. Como se ve aquí en Opus Levu, estos axones se bifurcan regularmente antes de conectarse a uno, dos o varios gmer.

Este es un ejemplo representativo de una neurona sensorial olfativa individual investigada repetidamente por imágenes de lapso de tiempo in vivo que muestra cambios continuos en la morfología axonal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar las neuronas sensoriales olfativas a través de la electroporación y cómo monitorear su desarrollo utilizando imágenes TimeLapse in vivo.