Regioselectiva biolística Focalización en Organotípicos cerebro rebanadas Usando una pistola de genes Modificado

El objetivo de este procedimiento es transfectar o etiquetar de forma rápida y eficiente distintas regiones de cortes organotípicos utilizando una pistola de genes. Esto se logra preparando primero cortes organotípicos viables del cerebro u otros tejidos. El segundo paso es producir ADN o partículas de oro decodificadas para su administración biótica.

A continuación, el corte organotípico se coloca bajo un montaje de pistola de genes estabilizado y las partículas recubiertas se disparan en el tejido o se transforman o etiquetan episómicamente. El paso final es observar o analizar el efecto de los genes heterólogos entregados a las regiones aisladas. En última instancia, este enfoque permite al usuario transfectar con precisión distintas regiones de los cortes de órganos con varios genes heterólogos.

La principal ventaja de este método sobre los métodos existentes es que la biologística permite el transfecte de células terminalmente diferenciadas, así como limitar el radio de acción a un diámetro pequeño. Este método puede ayudar a comprender cuestiones neurobiológicas clave, como la comprensión de la contribución regional de un solo gen. Comience este procedimiento colocando un cerebro fresco en un molde receptor pequeño.

Cúbralo con la solución ARO, que se ha llamado a un poco por encima de la temperatura ambiente. Luego enfríe rápidamente el molde a cuatro grados centígrados colocándolo sobre hielo. Cuando el aros se ha puesto.

Después de cinco a 10 minutos, retire el cerebro incrustado aros del molde. Después de eso, péguelo a la plataforma de la cortadora de fibro. A continuación, transfiera la plataforma a la cámara de corte Vibra que contiene PBS estéril y frío.

Después de cortar, coloque suavemente las rodajas en los insertos de cultivo celular en una bandeja de seis pocillos múltiples con medios de cultivo en el exterior del inserto. Incubarlos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. En este procedimiento, prepare los nanoproyectiles utilizando partículas de oro de 40 nanómetros de diámetro añadiendo primero 50 microlitros de esperma de 0,05 molares y 10 microlitros de ADN a un miligramo por mililitro a 10 miligramos de partículas de oro.

Luego agregue cloruro de calcio en la mezcla de solución para ayudar a la unión de las moléculas de ADN a las nanopartículas de oro. Después, introduzca la solución en el tubo con una jeringa. Coloque el tubo en la estación de preparación de tubos.

Deja que las partículas de oro se asienten. A continuación, retire el supinato por aspiración con una jeringa. Gire el tubo para distribuir uniformemente las partículas de oro.

Posteriormente seque las partículas bajo un flujo constante de nitrógeno a cinco litros por minuto. Para crear balas de ADN, corta el tubo en pedazos de un centímetro con un cortador de tubos. Luego, insértelos inmediatamente en el cartucho de genes cultivados o manténgalos desecados a cuatro grados centígrados hasta su uso en una campana de flujo de lámina estéril, cargue el cartucho que contiene el oro recubierto de ADN en el soporte del cartucho.

A continuación, cargue el soporte en la pistola genética. Fije el cañón de la pistola genética modificada a él con pinzas estériles. Coloque un inserto de filtro que contenga una rebanada organotípica en un plato de plástico estéril.

Retire el medio de la rebanada organotípica. A continuación, ajuste la presión del gas a 50 PSI usando el soporte. Coloque la pistola de genes a una distancia de 10 milímetros por encima de la región deseada del corte para la entrega genética.

A continuación, apunta con cuidado al centro del cañón y dispara las partículas recubiertas en el tejido. Después de la transfección biótica, lave la rodaja suavemente dos veces con PBS. A continuación, fije la rodaja incubándola en PFA helado al 4% en PBS durante 20 minutos.

Después de eso, lave la rebanada dos veces en PBS. De nuevo, corte suavemente la membrana del inserto con un bisturí sin alterar la rebanada. A continuación, coloque el soporte de la membrana en un portaobjetos de microscopio con pinzas y deje que el corte organotípico descanse sobre él.

A continuación, agregue una gota de papel de montaje en la rebanada. Coloque un cubreobjetos suavemente sin ninguna fuerza directamente en contacto con el pañuelo. Después, asegure el cubreobjetos con una fina capa de esmalte de uñas.

Esta figura muestra la entrega biótica de ADN codificado por proteínas fluorescentes en la rebanada organotípica de un ratón de seis semanas de edad. Como se puede ver aquí, una neurona bikini con un notable puerto dendrítico que se encuentra en la interfaz de la capa del bikini y la capa molecular del cerebelo muestra un marcaje pronunciado después de la transfección biótica transitoria con P-E-G-F-P-N uno. Aquí hay un mayor aumento de las dendritas con las espinas, y aquí hay una célula parametálica encontrada en la región aproximadamente uno del hipocampo.

Después de la administración biótica de la nanopartícula de oro recubierta de PDS Red FP Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en solo unas pocas horas durante el período de tres a cuatro días después de este procedimiento. Otros métodos, como la microscopía confocal, se pueden utilizar para responder preguntas adicionales, como cómo se conectan ciertas neuronas con regiones vecinas.