La automatización de experimentos-chip siguientes para generar perfiles epigenéticos en 10.000 células HeLa
10 de diciembre de 2014
Los métodos para mapear las interacciones proteína-ADN in vivo se están volviendo cruciales para todos los aspectos de la investigación genómica, pero son laboriosos, costosos y requieren mucho tiempo. Aquí se presenta un sistema robótico de manejo de líquidos disponible comercialmente que automatiza la inmunoprecipitación de cromatina para mapear las interacciones proteína-ADN in vivo con cantidades limitadas de células.
El objetivo general de este procedimiento es proporcionar a los investigadores una plataforma automatizada capaz de realizar experimentos de inmunoprecipitación de cromatina en solo 10.000 células. Esto se logra preparando primero cromatina cortada de alta calidad para la inmunoprecipitación de cromatina. En el segundo paso, se crea un experimento automatizado de inmunoprecipitación de cromatina y se ejecutan bibliotecas automatizadas con el ADN inmunoprecipitado.
El ADN inmunoprecipitado se analiza mediante PCR cuantitativa y secuenciación de nueva generación. En última instancia, el éxito de la tecnología automatizada puede validarse mediante la comparación de los perfiles de secuencia de inmunoprecipitación de cromatina generados en la muestra original de 10.000 células con los experimentos realizados en 100.000 células y los conjuntos de datos existentes como referencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo epigenético para mejorar nuestra comprensión de las funciones de biomarcadores específicos en varios tejidos.
Etapas de desarrollo y estados de la enfermedad. Esta técnica tiene implicaciones hacia el diagnóstico de múltiples enfermedades ya que ayudará a identificar biomarcadores epigenéticos en la salud y la enfermedad, de forma precisa y fiable. Las tecnologías automáticas son herramientas importantes para los investigadores en el análisis epigenético de tipos específicos de células, subpoblaciones y biopsias.
Para un experimento estándar de inmunoprecipitación de cromatina automatizada, comience agregando 120 microlitros de tampón de inmunoprecipitación de cromatina H a 100 microlitros de cromatina cortada de una a 2 millones de células, reservando de dos a 20 microlitros de cromatina para la muestra de entrada. A continuación, para configurar el experimento automatizado en el compacto IP star, seleccione los protocolos y haga clic en el icono de inmunoprecipitación de cromatina. Elija el método directo de inmunoprecipitación de cromatina y, a continuación, en la siguiente pantalla, elija el protocolo de inmunoprecipitación de cromatina de 200 microlitros y especifique el número de muestra.
Ajuste los parámetros experimentales de inmunoprecipitación de cromatina a cuatro horas para el recubrimiento de anticuerpos. Paso 15 horas para la etapa de inmunoprecipitación y cinco minutos para cada etapa de lavado. A continuación, configure los reactivos siguiendo las instrucciones que se muestran en la pantalla de información de diseño y añada los reactivos adecuados y los anticuerpos de grado ChIP-seq altamente validados.
Luego agregue 20 microlitros de proteína, perlas magnéticas recubiertas de A para cada reacción, y las muestras de cromatina después de que finalice el protocolo de chip nocturno y la reticulación inversa. Purifique el ADN con un kit de purificación de ADN basado en perlas magnéticas. Utilice un ensayo fluorométrico comercial de alta sensibilidad para cuantificar el ADN inmunoprecipitado.
A continuación, el uso de cebadores para al menos una región genómica de control positiva y una negativa. Analizar la calidad del ADN inmunoprecipitado por PCR cuantitativa según los parámetros adecuados de los materiales para el análisis. Los resultados se expresan como el porcentaje de la recuperación de la entrada para la secuenciación de próxima generación bajo protocolos.
Ahora haga clic en el icono de preparación de la biblioteca, luego elija la tecnología de preparación de la biblioteca de su preferencia y configure los reactivos de acuerdo con las instrucciones en la pantalla de información de diseño. Por ejemplo, en este experimento, se generaron perfiles de secuenciación para seis modificaciones diferentes de histonas asociadas con la expresión génica. La alta correlación de picos observada entre estos marcadores de histonas indica la capacidad del sistema automatizado para generar datos precisos y confiables.
Además, estos gráficos muestran la distribución de los picos para las diferentes modificaciones de histonas en regiones genómicas específicas. Finalmente, para un experimento de inmunoprecipitación de cromatina automatizada para muestras con números de células bajos, configure el protocolo de inmunoprecipitación de cromatina automatizada de 200 microlitros en el sistema de automatización como se acaba de demostrar. A continuación, cargue el sistema con el ChIP-seq, los anticuerpos y reactivos de grado se optimizan para trabajar en cantidades de cromatina entre 10.000 y 100.000 células utilizando solo 10 microlitros de proteína, una perlas magnéticas recubiertas para cada reacción.
Después del chip, ejecute la preparación de la biblioteca, seleccione el protocolo de preparación de la biblioteca micro plex y configure los reactivos siguiendo las instrucciones que se muestran en la pantalla de información de diseño. En esta PCR cuantitativa representativa de una inmunoprecipitación de cromatina a partir de una muestra inicial de 10.000 células, se observaron enriquecimientos significativos con los anticuerpos antihistonas en las regiones de control positivas y señales insignificantes en las regiones de control negativas. Aquí se muestran una serie de 10 reacciones de inmunoprecipitación que fueron reproducibles y altamente comparables con un experimento de inmunoprecipitación manual de cromatina, lo que demuestra la capacidad del sistema automatizado para trabajar con bajas cantidades de células sin un aumento visible en la variabilidad de un experimento a otro en comparación con la inmunoprecipitación manual.
Estos datos ilustran los análisis bioinformáticos de las bibliotecas de secuencias de 10.000 y 100.000. He a células S3 después de la inmunoprecipitación de cromatina, demostrando resultados sobresalientes de las muestras de inmunoprecipitación de cromatina de bajo número de células. Este conjunto de datos, que corresponde al experimento con 10.000 células de material de partida, contiene un ruido de fondo bajo con picos de enriquecimiento altamente fiables que son confirmados tanto por el conjunto de datos de 100.000 células como por el conjunto de datos de referencia del Instituto Broad.
Para el proyecto de codificación, es importante tener en cuenta que los datos de 10.000 celdas muestran picos casi idénticos a los datos del Broad Institute con una relación de superposición del 98% del mejor 40% de los picos clasificados por la puntuación significativa utilizada en el proyecto de código final. El sistema automatizado IP star requiere una intervención mínima del operador, lo que reduce el tiempo de manipulación de la inmunoprecipitación de cromatina a solo una o dos horas. Además, el proceso automatizado reemplaza los numerosos pasos propensos a errores de la inmunoprecipitación manual de cromatina y ofrece resultados altamente consistentes.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que una buena inmunoprecipitación de cromatina y una buena selección de anticuerpos altamente específicos y sensibles son clave para el éxito del experimento. Esta tecnología allanó el camino para que los investigadores de todos los campos de la biología mejoraran la precisión, la reproducibilidad y la consistencia de la terapia. Estudios de epigenética.
Descripción general
Este artículo presenta una plataforma automatizada para la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) que puede procesar eficientemente un bajo número de células, específicamente 10.000 células. El método tiene como objetivo simplificar la determinación de interacciones proteína-ADN, lo cual es esencial para la investigación genómica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Genómica
- Epigenética
- Técnicas de Laboratorio Automatizadas
Antecedentes
- Las interacciones proteína-ADN son cruciales para comprender la regulación génica.
- Los métodos tradicionales de ChIP son laboriosos y requieren un gran número de células.
- La automatización puede mejorar la eficiencia y la reproducibilidad en experimentos genómicos.
- Este estudio se centra en un sistema robótico que minimiza la intervención manual.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método automatizado de ChIP para números bajos de células.
- Validar la eficacia del sistema automatizado frente a los métodos tradicionales.
- Facilitar la identificación de biomarcadores epigenéticos en la salud y la enfermedad.
Métodos Utilizados
- Preparación de cromatina fragmentada de alta calidad a partir de 10.000 células.
- Automatización del proceso de ChIP mediante un sistema robótico de manipulación de líquidos.
- Análisis del ADN inmunoprecipitado mediante PCR cuantitativa y secuenciación de nueva generación.
- Comparación de los resultados con datos obtenidos a partir de muestras más grandes de células y conjuntos de datos existentes.
Resultados Principales
- El sistema automatizado produjo resultados confiables y reproducibles comparables a los métodos manuales.
- Se observó un enriquecimiento significativo de las modificaciones de histonas en las regiones de control positivo.
- Una alta correlación con conjuntos de datos de referencia indicó la precisión del enfoque automatizado.
- La intervención mínima del operador redujo considerablemente el tiempo de manipulación.
Conclusiones
- El método automatizado de ChIP es eficaz para números bajos de células.
- Esta tecnología puede impulsar la investigación epigenética y el descubrimiento de biomarcadores.
- La automatización mejora la consistencia y fiabilidad de los análisis genómicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La automatización de ChIP-seq para entradas bajas de células aborda un cuello de botella crítico en la validación de dianas epigenéticas, permitiendo la desviación mecanicista de hipótesis mediante el uso de poblaciones celulares primarias escasas o raras. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al generar perfiles epigenómicos reproducibles a partir de muestras limitadas, apoyando la selección de carteras y la toma de decisiones guiada por biomarcadores. La tecnología posiciona a los ensayos epigenómicos como herramientas de descubrimiento escalables y reutilizables, alineadas con la continuidad traslacional desde la identificación de dianas hasta la validación preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas y la aclaración de vías mediante el perfilado de modificaciones de histonas a partir de muestras con baja cantidad de material.
- Valor operativo: Apoya la desactivación de riesgos biológicos y la validación funcional de dianas al generar datos reproducibles de ChIP-seq a partir de 10.000 células.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras mediante lecturas epigenómicas confiables que se correlacionan con conjuntos de datos de referencia y puntos de referencia manuales.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos posteriores mediante la implementación de protocolos estandarizados y automatizables de ChIP-seq.
- Valor operativo: Aborda la estandarización del ensayo, la reproducibilidad y la obtención de resultados cuantitativos mediante automatización basada en perlas magnéticas y lecturas de qPCR/NGS.
- Escalabilidad: Destaca la preparación para cribado y la reutilización de plataformas gracias a la reducción del tiempo de manipulación manual y a la mínima intervención del operador.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Analiza la relevancia de enfermedades mediante la identificación de biomarcadores epigenéticos en estados de salud y enfermedad utilizando secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina con bajo número de células (ChIP-seq).
- Alineación Preclínica: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir un perfilado epigenómico consistente independientemente del tamaño de la muestra.
- Avance Ajustado al Riesgo: Apoya las decisiones mediante datos reproducibles y de bajo fondo, confirmados frente a conjuntos de datos de 100.000 células y datos de referencia.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método automatizado de ChIP-seq se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis hasta la identificación de compuestos líder, lo que permite el perfilado epigenómico en etapas tempranas con material limitado.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al generar perfiles de modificaciones de histonas a partir de muestras con bajo número de células.
- Selección: Ofrece disponibilidad para ensayos y reproducibilidad mediante la preparación automatizada de bibliotecas y métricas cuantitativas de recuperación de ADN.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes mediante qPCR (% de recuperación respecto a la entrada) y correlación de picos en secuenciación de nueva generación (NGS) para la comparación de condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante perfiles epigenómicos alineados con biomarcadores, validados frente a conjuntos de datos ortogonales.
- Reutilización Empresarial: Presenta la plataforma robótica como una capacidad reutilizable para ensayos epigenéticos en diversos proyectos, reduciendo la redundancia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista en estudios de mecanismos epigenéticos.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad logradas mediante manipulación automática de líquidos y minimización de pasos manuales.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del proyecto, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante datos epigenómicos fiables con baja cantidad de entrada.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, apoyadas por resultados de ChIP-seq reproducibles y correlacionados con referencias.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la preparación de cromatina, validación de anticuerpos y operación de sistemas automatizados de manipulación líquida.
- Necesita instrumentación que incluya una plataforma robótica (por ejemplo, IP-Star Compact), manipulación de perlas magnéticas e infraestructura analítica de qPCR/NGS.
- Exige estandarización entre equipos en la selección de anticuerpos, la fragmentación de cromatina y los parámetros del protocolo para garantizar la reproducibilidad.
- Implica consideraciones de adaptación al escalar de 10.000 a 100.000 células o al aplicar el método a biopsias primarias y subpoblaciones.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dependencia de anticuerpos altamente específicos y de alta calidad, así como de una fragmentación óptima de la cromatina para lograr éxito con muestras de bajo contenido celular.
