Name: Derivación y caracterización de un transgen libre Humano madre pluripotentes inducidas Línea Celular y Conversión en condiciones definidas de calidad clínica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Aprende a derivar células madre pluripotentes inducidas humanas libres de factores mediante reprogramación con lentivirus y conversión a condiciones de grado clínico. Este protocolo utiliza fibroblastos dérmicos adultos.

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Nos gustaría agradecer a Patrick C. Lee, Cyril Ramathal y Saravanan Karumbayaram (SK) por su asistencia en la realización de los experimentos de derivación y caracterización de iPSC; Aaron Cooper por realizar los experimentos de análisis de iPSC; Vittorio Sebastiano y Renee A. Reijo Pera por dirigir los esfuerzos iniciales de reprogramación; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack y Donald B. Kohn por dirigir el establecimiento de las instalaciones de GMP de UCLA que permiten la conversión y caracterización de iPSC de grado clínico; Gustavo Mostoslavsky por proporcionarnos el vector de reprogramación policistrónico STEMCCA. Este trabajo se basa en una colaboración de investigación con Fibrocell Science y la Iniciativa de Investigaciones Clínicas para Derivados Dérmicos Obtenidos Mesenquimal (CIDMOD) para generar terapias celulares seguras y personalizadas. Este trabajo fue financiado por el Centro Eli y Edythe Broad de Medicina Regenerativa e Investigación de Células Madre de UCLA, The Phelps Family Foundation, Fibrocell Science, Inc. y el Premio Scholar's Award de UCLA CTSI a JAB.

NOTA: Este método se utilizó en la investigación publicada en Awe et al 10.. 1. Reprogramación Humana Adulto fibroblastos dérmicos con STEMCCA <ol><li> Fibroblastos dérmicos Descongele adultos humanos (HUFS), paso 4 o inferior, en un 37 ° C baño de agua durante 2 minutos, teniendo cuidado de no sumergir la parte superior del vial con agua. </li><li> Coloque la suspensión 1 ml de fibroblastos humanos en un vial cónico de 15 ml y colocar lentamente 4 ml de medios estándar HUF, pre-calentado a 37 ° C, de una forma gota a gota, para diluir a cabo sulfóxido de dimetilo (DMSO) y volver a suspender las células. </li><li> Centrifugar el vial a 200 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en un volumen adecuado de los medios de comunicación para crear una suspensión de 100 000 células / ml y a continuación, añadir 2 ml en un pocillo de una placa de seis pocillos, pre-recubierto durante 20 minutos con 0,2% de gelatina. NOTA: Una hermana bien con un número igual de células por línea y el estado necesita ser sembrado for el recuento de células / multiplicidad de infección (MOI) de cálculo. </li><li> Rock the lado de la placa a lado y lado a otro para distribuir uniformemente las células. Incubar durante la noche a 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador humidificado. </li><li> En el día de la transducción, obtener el recuento de células (s) de la hermana así (s) de aproximadamente 24 hr después de la siembra inicial HUF. </li><li> Descongelar 2 x 10 8 TU, o, concentrado lentiviral equivalente (STEMCCA) y diluir a 1 x 10 8 TU / ml en medio HUF. </li><li> Transducir células en una proporción 10-MOI en medios HUF suplementado con agente de transfección 8 mg / ml. Mezclar pozos transducidas de manera uniforme y se incuba durante la noche a 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador humidificado. </li><li> Aproximadamente 24 horas después de la transducción lentiviral, cambiar los medios de comunicación HUF a células madre pluripotentes humanas (PSC) medio estándar. </li><li> En los días 2 al 6, cambiar los medios de comunicación todos los días con medio PSC humano. </li><li> El día 6, la placa dos 0,2% recubierto de gelatina placas de 10 cm de1,5 a 1,75 x 10 6 MEFs derivados de ratones CF1 en HUF medios 12. </li><li> El día 7, con cuidado de no centrifugar más de 100 xg, uso tripsina temperatura ambiente para levantar los días 7 fibroblastos reprogramados de un pocillo de la placa de seis pocillos y el paso a una relación 01:16, en placas de todas las células de manera uniforme entre dos placas de 10 cm, con los medios de comunicación PSC humana fresca, que se sembraron con MEFs el día anterior. Distribuir los agregados de células en un movimiento en espiral hacia la derecha y colocar en un 37 ° C, 5% de CO 2 humidificado incubadora durante la noche. </li><li> Aproximadamente 48 horas después de la siembra de las células reprogramadas en MEFs y todos los días a partir de entonces, cambie a cabo gastados medios PSC humanos por medio fresco. </li><li> Después de 3 a 4 semanas, recoger las colonias individuales con la típica morfología ESC como con una aguja de calibre 21 y subclonar a cabo en una placa de 24 pocillos mediante la colocación de aproximadamente 8 a 10 piezas individuales de colonias específicas en pocillos individuales en un 0,2% de gelatina recubierta placa de 24 pocillos pre-semillaed con MEFs derivados de ratones CF1 en medio PSC humano. NOTA: Después de la expansión de las colonias escogidas, las colonias tienen que caracterizarse como pluripotentes de una formación corporal embrioide y análisis de la expresión de marcadores de pluripotencia a nivel de proteínas. </li></ol> 2. Integración de análisis vectorial de Sitio y STEMCCA Excision <ol><li> Analizar el sitio de integración STEMCCA por amplificación lineal no restrictiva PCR como se ha descrito 10. </li><li> Después de someter a ensayo para garantizar una integración en un área deseada del genoma, STEMCCA especial mediante la aspiración del viejo medio ESC humana. Entonces, se combinan 45 l de virus adeno-Cre-PuroR concentrado con 8 g agente de transfección / ml en 3 ml de medio PSC estándar durante 24 h. </li><li> Después del período de incubación de 24 horas, aspirar el sobrenadante viral mixta y se lavan las células dos veces con los medios de comunicación del PSC humanos. Coloque frescas medios PSC humanos junto con 2 mg / ml de puromicina por un período de 5 días, cambiando el ingenio diaria mediosh medios de comunicación y los antibióticos frescas. </li><li> Después de 5 días, subclón colonias con una aguja de calibre 21 restante sobre 0,2% pozos recubiertos de gelatina, en una placa de 12 pocillos pre-recubierto con MEFs derivados de CF1mice y ampliar como se detalló anteriormente. NOTA: Después de una expansión suficiente para obtener una solución madre congelada, se requiere conversión en condiciones libres de alimentador. Espere al menos el 95% de muerte de colonias de células madre como la mayoría de las células no se transducidas con éxito y sucumbirán a los antibióticos durante el período de 5 días de incubación. Aunque adeno-Cre-PuroR integra con una eficiencia de 0,001 a 1% en los cromosomas de acogida de las células infectadas, reexposing una muestra de las colonias factor libre de puromycin para asegurar la muerte celular 100% confirmará ninguna integración se ha producido 13. </li><li> Descongelar un vial de matriz de membrana basal pre-alícuota en hielo, durante un período de aproximadamente 2 hr (recomendaciones del fabricante) hasta que la matriz es un líquido y se diluye a una concentración final de 1:30 de medios basales frío. Coen el número deseado de pozos en una placa de seis pocillos con 1 ml por pocillo. Deje reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Cross-Hatch (usando una aguja de calibre 18, o una &quot;punta&quot; de vidrio o de plástico) al menos 20 a 30 colonias de un pozo previamente recubierto con MEFs. Tenga cuidado para reducir MEF edificante y traslado del plato. <ol><li> Generar el dispositivo de sombreado cruzado a través de una serie de enfoques diferentes, desde el calentamiento más complicado, tirando, y acabado de una pipeta Pasteur de vidrio sobre una llama abierta, al simple uso de una punta de pipeta de plástico estéril o, como en nuestro caso, 21- y / o calibre 18 agujas. </li></ol></li><li> Aspirar la matriz desde el pocillo recubierto después de la incubación. </li><li> Retire piezas de las colonias por raspado suave de la placa de edad con una pipeta de 200 l y se coloca cuidadosamente en 3 ml de los medios de comunicación combinados frescas 1 en la placa de matriz recubiertos. Incubar toda la noche en un 37 ° C, 5% de CO 2 humidificado incubadora. Cambiar medios 48 horas después de los pases. </li><li> Extraer el ADN genómico de hiPSCs convertidos post extirpado y libres de alimentador, en más del 80% de confluencia, usando kits de extracción de ADN comercial. </li><li> Analizar por escisión adecuada con primers específicos para las integraciones exógenas del lentivirus STEMCCA: gDNA-hendo-MycS-forward, 5&#39;-acgagcacaagctcacctct-3 &#39;; gDNA-hWPRE-inverso, 5&#39;-tcagcaaacacagtgcacacc-3 &#39;. Reconstituir iniciadores liofilizados con agua de calidad para PCR a una solución madre 10-M. </li><li> Ejecutar una PCR con el siguiente protocolo de cinco pasos: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 3 min; 35 ciclos de cada uno de los siguientes: desnaturalización a 98 ° C durante 20 segundos, hibridación del cebador a 62 ° C durante 15 seg, y extensión a 72 ° C durante 15 s; seguido de un único ciclo de extensión final a 72 ° C durante 3 min. </li><li> Hacer un gel de agarosa al 3% pesando 1,5 gramos de agarosa y colocándolo en tampón 1x 50 ml de Tris-acetato-EDTA. Horno de microondas hasta agarosa se disuelve y el lugar en la mancha de gel de ADN en pdilución Roper, mezclar y dispensar un volumen apropiado en casete de gel para solidificar durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Cargar 12 l de producto de PCR se mezcla con 3 l de colorante de carga en un gel de agarosa al 3%. Ejecutar el gel durante 30 minutos a 80 V. </li><li> Visualizar con luz ultravioleta para la ausencia de una banda que indica la escisión adecuada. </li></ol> 3. La cuantificación de la expresión génica diferencias mediante el uso de PCR cuantitativa de pre y post hiPSCs extirpados- <ol><li> Extraer el ARN total de hiPSCs convertidos post extirpado y libres de alimentador usando kits de extracción de ARN comerciales. </li><li> Reverse-transcribir hasta 1 g de ARN total mediante el uso de kits comerciales de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Use-oligo anclado (dT) 18 y cebadores hexámeros aleatorios. NOTA: Asegúrese de que el protocolo de PCR se adapta para la transcripción de genes de más o menos de 4 kb. Tendrá que ser hecho para que sea i gen STEMCCA integrado originalmente primers específicosnto. </li><li> Reconstituir la imprimación liofilizado con agua de calidad para PCR a una solución de 20 mM. </li><li> Utilice 5 ng de muestra por cada 20 l de reacción que consta de sonda UPL 10 M, 2x LightCycler 480 Sondas Maestro, y 20 mM adelante y atrás primers. </li></ol> 4. La conversión en condiciones GMP grado <ol><li> En el primer día de la transición de los hiPSCs post extirpado a condiciones GMP grado, hacer una mezcla de medios de comunicación que consiste en PSC humano combinado de medios de comunicación (1 medios combinado 1) y grado clínico buenas prácticas de fabricación (GMP) de medios de comunicación que pueden utilizarse (medios combinados 2 ) en una relación de 80:20. </li><li> Aspirar los viejos medios combinados 1 y colocar 3 ml de los nuevos medios de comunicación combinados 1 y 2, previamente calentado, en la relación de 80:20. Cambie los medios día durante 3 días con esta relación específica. Coloque las células de nuevo en un 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> En el día 4, hacer que los medios de comunicación combinado 1 y 2 en una proporción de 50:50. Aspirar la edad media y Replace con los medios de pre-calentado, con los medios de comunicación combinados 1 y 2 en la relación de 50:50. Cambie los medios durante 3 días con esta relación específica. Coloque las células de nuevo en un 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> El día 7, hacer los medios de comunicación combinada 1 y 2 en una proporción 20:80. Aspirar el medio viejo y reemplazarlo con los medios de comunicación pre-calentado, con los medios de comunicación combinados 1 y 2 en la proporción 20:80. Cambie los medios durante 3 días con esta relación específica. Coloque las células de nuevo en un 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> El día 10, hacer los medios de comunicación combinados 1 y 2 a una 0: relación de 100. Aspirar el medio viejo y reemplazarlo con los medios de comunicación pre-calentado, con los medios de comunicación combinados 1 y 2 en el 0: relación de 100. Cambie los medios todos los días a esta relación específica. Las células se encuentran ahora en los medios de comunicación-xeno libre completamente definido. Coloque las células de nuevo en un 37 ° C, 5% de CO2. NOTA: Durante este proceso de conversión, se necesita pases de rutina con una aguja de calibre 18 para mantener tamaño de la colonia y la densidad apropiados. Plan en la passaging células cada 4 a 5 días sobre la base de tamaño de las colonias, la confluencia, y la diferenciación. </li><li> Escudo un pocillo de una placa de seis pocillos con un sustrato-xeno libre definido según lo recomendado por el fabricante. </li><li> Pasaje Mecánicamente un confluente bien, ya convertida en Xeno-libre condiciones de comunicación, a partir de una placa de seis pocillos con una aguja de calibre 18. Es importante destacar que colocar nuevos medios de comunicación (medios combinados 2) en las células con inhibidores ROCA 1x durante 1 hora, antes de que pases a pre-condición los medios de comunicación. </li><li> Aspirar la solución de sustrato sintético de la nueva placa que las células están siendo transferidos a. Quite todos los medios que contienen los grupos de células madre de la placa vieja y la transferencia a la nueva placa. </li><li> Coloque las células de nuevo en un 37 ° C, 5% de CO2 durante 2 días con perturbación física mínima (idealmente placas, una vez dentro de la incubadora, no se tocan directamente en modo alguno) para permitir la unión máxima. NOTA: Las células requerirán cambios de medio día. Passagin Continuag cada 4 días serán importantes. Usando una aguja de calibre 21, de paso sólo las partes de colonias con morfología ESC-como óptima (alto cociente nucleocytoplasmic). Esto asegurará la selección de colonias hiPSC adecuadas que crecerán bien y eventualmente producir colonias homogéneos. El tiempo total de derivación de ESC como colonias es entre 15 a 20 días después del cambio inicial medios combinado. </li><li> Congele por las hiPSCs posteriores a extirpado GMP grado por primera trama cruzada todas las colonias utilizando una aguja de calibre 18. Levantar todas las piezas fuera mediante el uso de una pipeta de 200 l y transferir todos los medios que contienen las células a un vial de 15 ml cónico y centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Mientras que las células están centrifugación, hacer una congelación medios de comunicación que consiste en volúmenes iguales de medios combinados fríos 2 y medio de congelación con una concentración final de DMSO del 7,5%. </li><li> Después las células se sedimentan, aspirar fuera el medio viejo y gota a gota vuelva a suspender el sedimento con el medio de congelación. Inmediatamente transfer a viales de congelación y poner en un congelador a -80ºC. </li></ol> 5. hiPSCs Caracterización GMP grado Publicar extirpados- <ol><li> Para asegurar la adecuada expresión de los marcadores de pluripotencia después de la conversión, utilice QPCR para cuantificar la expresión de marcadores de pluripotencia clave (SOX2, OCT4, y NANOG) usando los cebadores listados en la Tabla 1 con los mismos pasos como se ha mencionado en el paso 3. metodologías QPCR seguir el mismos pasos que se indican en el paso 3. </li><li> El uso de citometría de flujo para detectar el ácido siálico no humano Neu5Gc (ácido -glycolylneuraminic N) de acuerdo con las condiciones generales que se indican en el kit según lo publicado previamente 10. </li><li> Lave suavemente las placas de cultivo celular con células mediante el uso de solución salina tamponada con fosfato de 1x (PBS). </li><li> Disociar colonias mediante el uso de reactivo de disociación 1x durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Durante la 5-min tiempo de incubación de la etapa 5.4, preparar la solución de bloqueo (proporcionado enkit) haciendo un 0,5% Agente bloqueador en PBS enfriado con hielo. </li><li> Rotula el siguiente conjunto de tubos para citometría de flujo: no teñida; 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) DAPI; El anticuerpo de control 1: 200; Primaria de anticuerpos de 1: 200; Anticuerpo secundario 1: 200 de IgG anti-pollo de burro (H + L); MEFs muestra; Células post extirpado muestra en matriz; y la Muestra células en sustrato sintético puesto extirpada. </li><li> Agitando suavemente los agregados de células de la etapa 5.4 mediante la adición de 2 ml de solución de bloqueo y de transferencia de contenido a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 80 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células dos veces con solución de bloqueo y se centrifuga como se ha indicado en el paso 5.7. </li><li> Suavemente volver a suspender aproximadamente 1 x 10 6 células en 100 l de solución de bloqueo con el volumen de dilución correspondiente de cada anticuerpo. Incubar con suave balanceo a 4 ° C durante 1 hora. </li><li> Repita lavados tres veces como en el paso 5.8. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento celular en 400 l de diluyente de Buffer (del kit) con 1: 100 de DAPI para tubos de 2, 6, 7, y 8 como se indica en el paso 5.6. </li><li> Células de la cepa a través de un colador de 40 micras y se ejecutan a través de citómetro de flujo. </li></ol>

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</ol>

James A. Byrne (JAB) y Agustín Vega-Crespo reciben fondos de investigación de Fibrocell Science, Inc. JAB es consultor científico de Fibrocell Science, Inc. Ningún otro autor tiene intereses contrapuestos que divulgar.

Se describe una metodología de derivar hiPSCs factor libre y hacerlos clínicamente relevante mediante la conversión de estas células en condiciones GMP grado de diferenciación celular aguas abajo en futuras terapias humanas. Aunque este protocolo es ampliamente aplicable a una variedad de tipos de células, que elegimos para reprogramar fibroblastos dérmicos humanos, debido a la facilidad de extracción de la paciente y su aplicabilidad a la terapéutica humana personalizados. Una vez que se subsanen las limitaciones en cu...

Se ha demostrado que las células humanas adultas son capaces de experimentar remodelación y reprogramación epigenética, como resultado de la expresión lentiviral de cuatro factores de transcripción clave4,5. Un avance importante en el campo de la reprogramación fue el uso de un único casete de células madre lentivirales sometidas a impuestos especiales (STEMCCA), que albergaba los cuatro factores de transcripción de reprogramación que permitían una relación estequiométrica precisa de la expresión de proteínas6. Además, cuando se transduce en una multiplicidad específica de rangos de infección, STEMCCA puede conducir a eventos de integración genómica predominantemente únicos durante el proceso de reprogramación7. La introducción de una versión susceptible de impuestos especiales de STEMCCA, que utiliza la tecnología Cre/loxP seguida de la escisión del vector de reprogramación después de la derivación de la línea de células madre, permitió derivar líneas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) sin factor8. Además, con el fin de mejorar las aplicaciones terapéuticas de las hiPSC, era necesario implementar una metodología novedosa, rápida y fácilmente aplicable para la conversión de líneas celulares de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP), de condiciones que contienen xeno a condiciones libres de xeno. Aquí, discutimos una metodología relevante que evalúa con mayor precisión las diferencias de expresión génica integradas, específicamente cuando se integran en un intrón, y la conversión celular de grado clínico en condiciones putativas de GMP. 
Investigaciones previas han utilizado solo el análisis transcripcional de microarrays relativamente insensible para analizar las diferencias de expresión génica en genes integrados después de la transducción STEMCCA3,9. Aquí, presentamos la metodología del análisis cuantitativo sensible de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para examinar más a fondo las diferencias de expresión génica integrada. Es importante destacar que los criterios actuales de puerto seguro descartan las hiPSC que tienen genes con integraciones virales, lo que limita la aplicabilidad de estas células para la terapéutica celular humanaposterior. Proponemos que el statu quo puede cambiar con el uso de hiPSCs reprogramadas intrónicamente completamente caracterizadas y libres de transgenes. Además, introducimos un robusto protocolo de conversión celular de grado GMP que se puede aplicar fácilmente a una variedad de diferentes tipos de células, que originalmente se derivaron en condiciones que contienen xeno10. Esto proporciona oportunidades significativas para el desarrollo de futuros experimentos de reprogramación celular, que requieren condiciones de grado clínico para mantener la relevancia terapéutica humana. 
Estas metodologías proporcionan una base sobre la cual los criterios actuales de puerto seguro pueden ampliarse para incluir líneas de hiPSC reprogramadas de STEMCCA caracterizadas que mantienen un perfil de expresión génica normal después de la escisión de STEMCCA del intrón integrado. Además, la conversión completa en condiciones de grado clínico, libres de antígenos animales no humanos, ayudará a incorporar muchos más tipos de células, que previamente han sido reprogramadas y caracterizadas solo en condiciones que contienen xeno. Estas metodologías, combinadas, son motivos persuasivos para que la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) considere ampliar su aprobación limitada de las terapias basadas en células madre embrionarias humanas (ESC) a las terapias basadas en hiPSC11. 
Recientemente detallamos la derivación de una línea de hiPSC libre de factores que fue completamente caracterizada y convertida en condiciones putativas de grado clínico10. Aquí, detallamos el protocolo para la derivación de hiPSC utilizando el lentivirus STEMCCA. A continuación, estas células madre se someten a un proceso de escisión seguido de la caracterización de la expresión génica. Finalmente, las hiPSC se convierten en condiciones de grado GMP mediante una metodología de conversión lenta.

<table><tr><tbody><td colspan="4"><fuerte>Medios y reactivos</fuerte></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (medios basales)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.</td><td>)11330057</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo (MEM) aminoácidos no esenciales (NEAA), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep, penicilina-estreptomicina, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Descongelar a 4 & grados; C, alícuota y almacenar en &menos; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Suero knockout de reemplazo</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>Descongelar a 4 & grados; C, alícuota y almacenar en &menos; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA, 0,5%</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Diluir el stock al 0,05% en 1x PBS</td></tr><tr><td>Factor básico de crecimiento de fibroblastos</td><td>GlobalStem (Rockville, MD, EE. UU.)</td><td>GSR-2001</td><td>Reconstituir a 10 &micro; g/ml de stock en albúmina sérica bovina al 0,1% disuelta en 1x PBS y almacenar en &menos; 80 &deg; C</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Millipore (Billerica, MA, EE. UU.)</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (matriz de membrana basal)</td><td>BD Biosciences (San José, CA, EE. UU.)</td><td>356231</td><td>Vial de Matrigel de caldo diluido con 10 ml de DMEM/F12 mientras está en hielo para una dilución 1:2. Alícuota y almacenamiento en &menos; 20 &deg;C.</td></tr><tr><td>CELLstart (sustrato sintético)</td><td>Invitrogen</td><td>A1014201</td><td></td></tr><tr><td>Stemmolecule Y27632</td><td>Stemgent (Cambridge, MA, EE. UU.)</td><td>04-0012-02</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Probes Master</td><td>Roche (Basilea, Suiza)</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>ProFreeze-CDM Medio/medio de congelación</td><td>Lonza (Basilea, Suiza)</td><td>12-769E</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)</td> <td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 BP DNA Ladder</td><td>Invitrogen 15628019</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, EE. UU.)</td> <td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina, de piel porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>Hacer stock al 0,2% en PBS, autoclave y almacenar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canadá)</td><td>5850</td><td>Combine el Suplemento 5x con el medio básico, alícuota y almacene a 4 &deg; C hasta por 2 semanas.</td></tr><tr><td>Stemedia NutriStem XF/FF Cultivo Medio</td><td>Tallo</td><td>05-100-1A Descongelar</td><td>a 4 & ° C O/N, alícuota y almacenamiento a 4 &deg; C hasta por 2 semanas.</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen (San Diego, CA, EE. UU.)</td><td>ANT-PM-1</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (Reactivo de disociación)</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-Pollo IgG AlexaFluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, EE. UU.</td><td>)703-546-155</td><td></td></tr><tr><td>Polibreno/agente de transfección</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</ placas resistentes></td></tr><tr><td>12 pocillos</td><td>VWR (West Chester, PA, EE. UU.)</td><td>29442-038</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 pocillos</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>placas de 10 cm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688819</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 18</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EE. UU.)</td><td>148265D</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 21</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>BD LSRII Citómetro de flujo</td><td>KSystem by Nikon (Tokio, Japón)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Versión 6.1.3 Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kits</td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit Invitrogen</td><td>K182000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit KAPA</td><td>Biosystems (Wilmington, MA, EE. UU.)</td> <td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ARN de alta pureza</td><td>Roche</td><td></td> 11828665001 <td></td></tr><tr><td>Transcriptor de primera cadena Kit de síntesis de ADNc</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack</td><td>Sialix (Newton, MA, EE. UU.) Paquete</td><td></td><td></td></tr><tr> básico<td colspan="4">Media</td></tr><tr><td>Combined media 1</td><td>StemCell Technologies y Stemgent</td><td></td><td>Consta de partes iguales de mTeSR1 y Nutristem</td></tr><tr><td>Combined Media 2</td><td>StemCell Technologies y Stemgent</td><td></td><td>Consta de partes iguales de TeSR2 y</td></tr><tr><td>Nutristem HUF Media</td><td></td><td></td><td>Dulbecco' Águila modificada' s medium/F12 [DMEM/F12] suplementado con un 10% de suero fetal bovino, 1x aminoácidos no esenciales, 1x Glutamax y 1x Primocin</td></tr><tr><td>Medios de Células Madre</td><td></td><td></td> Pluripotentes Humanas <td>DMEM/F12 suplementado con un 20% de reemplazo de suero knockout, 1x Glutamax, 1x aminoácidos no esenciales, 1x Primocina, 1x &beta;-mercaptoetanol y 10 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos.</td></tr><tr><td colspan="4">DMEM/F12, Dulbecco' Águila modificada' s medio/F12; PBS: solución salina tamponada con fosfato.</td></tr></tbody></table>

derivación y caracterización de un transgen libre humano madre pluripotentes inducidas línea celular y conversión en condiciones definidas de calidad clínica

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) se pueden generar con las metodologías de reprogramación a base de lentivirus. Sin embargo, los rastros de genes potencialmente oncogénicos restantes en regiones activamente transcrito del genoma, limitan su potencial para su uso en aplicaciones terapéuticas humanas 1. Además, los antígenos no humanos derivados de la reprogramación de células madre o la diferenciación en derivados terapéuticamente relevantes se oponen a estas hiPSCs se utilicen en un contexto clínico humano 2. En este vídeo, se presenta un procedimiento para la reprogramación y analizar hiPSCs factoriales libre libres de transgenes exógenos. Estos hiPSCs se pueden analizar para detectar anomalías de expresión génica en el intrón específico que contiene el lentivirus. Este análisis puede llevarse a cabo utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa sensible (PCR), que tiene una ventaja sobre técnicas menos sensibles utilizado anteriormente para detectar diferencias de expresión génica 3. La conversión total enbuenas prácticas de fabricación de grado clínico (GMP), permite relevancia clínica humana. Nuestro protocolo ofrece otra metodología, siempre que los criterios actuales de salvaguarda ampliarán e incluir los derivados basados ​​en hiPSC caracterizados factoriales libre para aplicaciones fines terapéuticos humanos derivadas hiPSCs GMP-grado, que debe eliminar cualquier riesgo inmunogenicidad debido a antígenos no humanos. Este protocolo es ampliamente aplicable a lentiviral reprogramado células de cualquier tipo y proporciona un método reproducible para la conversión de células reprogramadas en condiciones GMP grado.

Se presenta un protocolo para derivar hiPSCs factor libre de grado clínico utilizando el enfoque basado reprogramación lentiviral-STEMCCA. La figura 1A muestra una imagen representativa de tres diferentes líneas hiPSC previamente extirpada, después de la reprogramación con el enfoque STEMCCA sobre una capa de MEFs. La principal ventaja del enfoque de reprogramación STEMCCA radica en el éxito reprogramación consistente alcanzado por múltiples científicos, en diferentes grupos y las ubicaciones de investi...

Describimos un protocolo para derivar células madre pluripotentes inducidas humanas basadas en lentivirales, reprogramadas y caracterizadas, y convertirlas en condiciones putativas de grado clínico.

Derivación y caracterización de un transgen libre Humano madre pluripotentes inducidas Línea Celular y Conversión en condiciones definidas de calidad clínica

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

El objetivo general del siguiente experimento es derivar células madre pluripotentes inducidas humanas reprogramadas sin factor basadas en lentivirales y convertir estas células en condiciones putativas de grado clínico. Esto se logra reprogramando primero fibroblastos dérmicos humanos adultos con un solo casete de células madre lentivirales de tamaño ex en HI PSC. A continuación, las PSC HI reprogramadas se exponen al virus del ronroneo adeno Cree para la escisión completa y la eliminación del coche del tallo del genoma del huésped.A continuación, la extracción de ADN genómico de las PSC HI libres del alimentador, seguida de un análisis de agel, confirma la escisión adecuada del carro del tallo. Por último, los IPC del factor tres H se convierten en condiciones putativas de grado GMP mediante una metodología de conversión lenta en condiciones libres de xeno totalmente definidas. En última instancia, la reprogramación viral de fibroblastos dérmicos adultos humanos y la conversión completa de los H IPC en condiciones de grado clínico subraya la amplia aplicabilidad de esta metodología para reprogramar células humanas adultas y convertirlas en condiciones clínicamente relevantes.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las aplicaciones clínicas de las células madre pluripotentes inducidas por humanos, ya que están completamente libres de factores y convertidas a condiciones de grado clínico, lo que las hace compatibles con la terapéutica humana. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la reprogramación, la escisión y los pasos de conversión de grado clínico son difíciles de aprender debido a los principales procedimientos intrincados y específicos que deben seguirse para producir el factor tres y las células madre pluripotentes inducidas humanas de grado clínico para comenzar la descongelación. Fibroblastos dérmicos humanos adultos o HAF en un baño de agua a 37 grados centígrados durante dos minutos.Tenga cuidado de no sumergir la parte superior del vial en el agua. Coloque la suspensión de un mililitro de células en un vial de crónica de 15 mililitros para resuspender las células y diluir el DMSO gota a gota. Agregue lentamente cuatro mililitros de centrífuga media huff precalentada, la violeta 200 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente.A continuación, aspirar el sup, nacent y reus. Suspenda las células en medio a 100.000 células por mililitro en un pocillo de una placa de seis pocillos preco al 0,2% de gelatina. Agregue dos mililitros de la suspensión de celdas, luego agregue dos mililitros de suspensión a un segundo.Bueno, para ser utilizado para medir la multiplicidad de infección o MOI, balancee la placa de lado a lado y de un lado a otro para distribuir uniformemente las células antes de incubarlas durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono en una cámara humidificada. 24 horas más tarde, después de contar las células se descongelan dos veces, centre las ocho unidades de transducción o S de concentrado lentiviral equivalente y use medio huff para diluirlo a una vez 10 a las ocho TS por mililitro utilizando medio medio medio suplementado con ocho microgramos por mililitro de reactivo de transfección. Transduce las células a una proporción de multiplicidad de infección de 10.Mezcle los pocillos de transducción de manera uniforme e incube durante la noche aproximadamente 24 horas después de la transducción lentiviral. Retire el medio huff y reemplácelo con células madre pluripotentes humanas estándar o medio PSC. Cambie el medio diariamente en los días dos a seis en el día seis en dos platos de 10 centímetros recubiertos de gelatina al 0,2% placa de 1,5 a 1,75 veces 10 a los seis fibroblastos embrionarios de ratón derivados del componente del complemento factor uno o ratones CF uno en medio medio día el día siete.Agregue viajes a temperatura ambiente en un pocillo de una placa de seis pocillos de los fibroblastos reprogramados. Levanta suavemente las células y hace girar una placa de 100 veces G con medio PSC humano fresco todas las células en una proporción de uno a 16 en dos placas de metanfetamina CFI de 10 centímetros. Distribuya los agregados en un movimiento en espiral en el sentido de las agujas del reloj e incube durante aproximadamente 48 horas antes de reemplazar el medio.Después de tres a cuatro semanas, use una aguja de calibre 21 para recoger de ocho a 10 piezas individuales de colonias específicas con una morfología típica similar a ESC y subclonarlas en pocillos individuales de CFI MFS después de la expansión. Confirmar que las células son pluripotentes mediante la formación de cuerpos embrionarios y el análisis de expresión de marcadores después de verificar el sitio de integración del coche madre como se describe en el protocolo de texto adjunto. Extirpe el vástago del automóvil aspirando primero el antiguo medio PSC humano en tres mililitros de medio PSC estándar combinado.45 microlitros de adeno Cree pur o virus concentrado con ocho microgramos por mililitro de agentes de transfección. Luego agregue a las células e incube durante 24 horas después de la incubación, aspire el supinato viral para inducir el medio PSC humano para lavar las células dos veces. Luego agregue medio HPSC con dos microgramos por mililitro de micina pura y reemplácelo diariamente después de cinco días, subclone las colonias restantes y expándalas como se describe anteriormente en el video.A continuación, descongele un vial de matriz de membrana basal pre Eloqua en hielo y diluya en medio basal frío hasta una concentración final de uno a 30. Use un mililitro por pocillo para cubrir el número deseado de pocillos de una placa de seis pocillos y deje reposar la placa a temperatura ambiente durante una hora. Luego, con una aguja de calibre 18, raye al menos de 20 a 30 colonias de un pozo previamente cubierto con mes.Tenga cuidado de reducir el levantamiento de MES y la transferencia de las células de la placa. Después de la incubación de una hora, aspire la matriz del pocillo recubierto con una pipeta de 200 microlitros. Retire los trozos de las colonias raspándolos suavemente del plato viejo y colóquelos con cuidado en tres mililitros de medio recién combinado, uno en un plato recubierto de matriz.Después de incubar durante 48 horas, cambie el medio diariamente cuando las PSC HI convertidas extirpadas y libres de alimentador alcancen el 80% de fluidez. Utilice un kit comercial de extracción de ADN para extraer el ADN genómico utilizando los cebadores que se muestran aquí y que son específicos para las integraciones exógenas del lentivirus del cartón. Analice el ADN por PCR para la escisión adecuada para la transición de las PSC HI posteriores a la extirpación a las condiciones de grado GMP.Mezcle el medio combinado HPSC uno y el medio que cumple con las GMP de grado clínico o el medio combinado dos en una proporción de 80 a 20 precalentamiento a 37 grados Celsius. Aspire el medio combinado antiguo de las celdas y reemplácelo con tres mililitros de la nueva solución de medio caliente. Reemplace el medio diariamente durante tres días de paso de acuerdo con el protocolo de texto para mantener el tamaño y la densidad adecuados de la colonia en el cuarto día, reemplace el medio con una mezcla 50 50 de medios combinados cálidos uno y dos incubar durante tres días.Reemplazando el medio diariamente el día siete, cambie a una proporción de 20 a 80 de medios combinados calentados uno y dos respectivamente y reemplácelo diariamente durante tres días. El día 10, cambie a tibio, 100% combinado medio dos y cambie diariamente. Las células se encuentran ahora en un medio libre de xeno completamente definido.A continuación, después de usar un sustrato libre de xeno definido para cubrir un pocillo de una placa de seis pocillos, reemplace el medio libre de xeno en un pocillo de celdas de confluencia con un medio fresco que contenga una roca x. Después de incubar durante una hora, use una aguja de calibre 18 para convertir mecánicamente las células en las recién preparadas. Bueno, permita que las células se incuben sin ser molestadas durante dos días para permitir la máxima adhesión antes de caracterizar las células de acuerdo con el protocolo de texto.Esta figura muestra una imagen representativa de tres líneas H-I-P-S-C pre-extirpadas diferentes después de la reprogramación con el enfoque del carro del tallo en una capa de mes, aquí se muestra el gel de PCR de transcripción inversa posterior a la escisión que muestra un subclon en particular completamente libre del lentivirus del carro del tallo, como lo demuestra la falta de una banda de amplicón específica para una secuencia particular endógena al carro del tallo. En esta figura, se muestra la cuantificación de los factores asociados asociados a la pluripotencia estándar de los factores asociados a la pluripotencia estándar de los IPC convertidos pre-con en una matriz que contiene xeno y los IPC de grado H libres de xeno posteriores al impuesto especial en una matriz sintética, incluidos SOX dos, OCT cuatro y nanog. El uso de QPCR se ilustra aquí.Finalmente, como se ve aquí, las PSC de HI pre-convertidas y post-convertidas a condiciones de grado GMP se probaron mediante citometría de flujo para el ácido siálico y el ácido neurónico glicol indicativos de antígenos no humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo reprogramar fibroblastos dérmicos adultos humanos con el virus de reprogramación stemco, extirpar el virus del genoma y luego convertir completamente estas PSC HI en condiciones de grado clínico totalmente compatibles con la terapéutica humana. No olvide que trabajar con staca, un vector antiviral de tercera generación, puede ser extremadamente peligroso y hay que tomar precauciones.Al realizar este procedimiento, se debe utilizar un EPP adecuado y una sala de cultivo de tejidos VSL dos plus.

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Investigación

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Biología

A pesar de los recientes avances en la modificación genética, la transfección de células madre embrionarias humanas (células madre embrionarias humanas) sigue siendo un proceso caprichoso. Para nuestro conocimiento, los métodos sistemático y eficiente para transfectar las células madre pluripotentes inducidas (CMPi) no se han reportado. Aquí se describen los protocolos robustos para transfectar eficiente y nucleofect CMPi humanos.

Transfección y Nucleofecting Humanos células madre pluripotentes inducidas

Hemos establecido un protocolo para la inducción de los neuroblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de progenitores neuronales humanos y los tipos de células neuronales en el desarrollo del SNC para la reparación neural.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Se presenta un protocolo para la reprogramación eficiente de las células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) utilizando vectores retrovirales que codifican Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-myc (OSKM) y la identificación de hiPSC correctamente reprogramado por tinción en vivo con Tra- 1-81 anticuerpo.

Selección y aislamiento de las colonias de humanos células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos adultos Reprogramado

Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

A continuación, presentamos nuestro método establecido para reprogramar las células somáticas humanas en transgenes libre iPSCs humanas con virus Sendai, que muestra resultados consistentes y una mayor eficiencia.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Este protocolo describe cómo generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas en condiciones libres de alimentadores utilizando una combinación de vectores de virus Matrigel y Sendai que contienen factores de reprogramación.

Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita

La caracterización regular de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), para determinar el mantenimiento de su estado pluripotente, es un paso importante antes de que estas células se utilicen para otras aplicaciones. En este trabajo describimos un método para la propagación a pequeña escala de iPSCs humanas diseñado específicamente para permitir su caracterización fácil y rutinaria a través de inmunocitoquímica.

Propagación de pequeña escala de iPSCs humano en condiciones sin suero para la caracterización inmunocitoquímica de rutina

Este protocolo describe la reprogramación de primaria amniótico líquido y membrana de las células madre mesenquimales en células pluripotentes inducidas mediante un enfoque episomal no integrar en condiciones totalmente químicamente definidas. Se detallan los procedimientos de extracción, cultivo, reprogramación y caracterización de las células pluripotentes inducidas resultante por métodos rigurosos.

Reprogramación de primario líquido amniótico y las células de la membrana a pluripotencia en condiciones libres de Xeno

derivación robusta de las células inducido por el hombre pluripotentes madre (HIPS) se logró mediante el uso de no-integración de virus Sendai (SeV) vector reprogramación mediada de fibroblastos dérmicos. el mantenimiento de células caderas y la expansión clonal se realizó utilizando condiciones de cultivo libre de xeno y definidos químicamente con laminina humana recombinante 521 (LN-521) de matriz y esencial E8 (E8) Medium.

Integración Derivación Gratuita de Células Madre Pluripotentes Inducidas Humanas Usando Laminin 521 Matrix

Aquí, presentamos un protocolo para formar con precisión endotelio hemogénico a partir de células madre pluripotentes humanas en una condición libre de alimentador y xeno. Este método tendrá amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades y cribado de compuestos terapéuticos.

Diferenciación de endotelio hemogénico de células madre pluripotentes humanas en una condición definida libre de alimentador y xeno

Aprende a derivar células madre pluripotentes inducidas humanas libres de factores mediante reprogramación con lentivirus y conversión a condiciones de grado clínico. Este protocolo utiliza fibroblastos dérmicos adultos.

Derivación y caracterización de un transgen libre Humano madre pluripotentes inducidas Línea Celular y Conversión en condiciones definidas de calidad clínica (Video) | JoVE Journal

Derivación y caracterización de un transgen libre Humano madre pluripotentes inducidas Línea Celular y Conversión en condiciones definidas de calidad clínica

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