Derivación y caracterización de un transgen libre Humano madre pluripotentes inducidas Línea Celular y Conversión en condiciones definidas de calidad clínica

El objetivo general del siguiente experimento es derivar células madre pluripotentes inducidas humanas reprogramadas sin factor basadas en lentivirales y convertir estas células en condiciones putativas de grado clínico. Esto se logra reprogramando primero fibroblastos dérmicos humanos adultos con un solo casete de células madre lentivirales de tamaño ex en HI PSC. A continuación, las PSC HI reprogramadas se exponen al virus del ronroneo adeno Cree para la escisión completa y la eliminación del coche del tallo del genoma del huésped.

A continuación, la extracción de ADN genómico de las PSC HI libres del alimentador, seguida de un análisis de agel, confirma la escisión adecuada del carro del tallo. Por último, los IPC del factor tres H se convierten en condiciones putativas de grado GMP mediante una metodología de conversión lenta en condiciones libres de xeno totalmente definidas. En última instancia, la reprogramación viral de fibroblastos dérmicos adultos humanos y la conversión completa de los H IPC en condiciones de grado clínico subraya la amplia aplicabilidad de esta metodología para reprogramar células humanas adultas y convertirlas en condiciones clínicamente relevantes.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las aplicaciones clínicas de las células madre pluripotentes inducidas por humanos, ya que están completamente libres de factores y convertidas a condiciones de grado clínico, lo que las hace compatibles con la terapéutica humana. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la reprogramación, la escisión y los pasos de conversión de grado clínico son difíciles de aprender debido a los principales procedimientos intrincados y específicos que deben seguirse para producir el factor tres y las células madre pluripotentes inducidas humanas de grado clínico para comenzar la descongelación. Fibroblastos dérmicos humanos adultos o HAF en un baño de agua a 37 grados centígrados durante dos minutos.

Tenga cuidado de no sumergir la parte superior del vial en el agua. Coloque la suspensión de un mililitro de células en un vial de crónica de 15 mililitros para resuspender las células y diluir el DMSO gota a gota. Agregue lentamente cuatro mililitros de centrífuga media huff precalentada, la violeta 200 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, aspirar el sup, nacent y reus. Suspenda las células en medio a 100.000 células por mililitro en un pocillo de una placa de seis pocillos preco al 0,2% de gelatina. Agregue dos mililitros de la suspensión de celdas, luego agregue dos mililitros de suspensión a un segundo.

Bueno, para ser utilizado para medir la multiplicidad de infección o MOI, balancee la placa de lado a lado y de un lado a otro para distribuir uniformemente las células antes de incubarlas durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono en una cámara humidificada. 24 horas más tarde, después de contar las células se descongelan dos veces, centre las ocho unidades de transducción o S de concentrado lentiviral equivalente y use medio huff para diluirlo a una vez 10 a las ocho TS por mililitro utilizando medio medio medio suplementado con ocho microgramos por mililitro de reactivo de transfección. Transduce las células a una proporción de multiplicidad de infección de 10.

Mezcle los pocillos de transducción de manera uniforme e incube durante la noche aproximadamente 24 horas después de la transducción lentiviral. Retire el medio huff y reemplácelo con células madre pluripotentes humanas estándar o medio PSC. Cambie el medio diariamente en los días dos a seis en el día seis en dos platos de 10 centímetros recubiertos de gelatina al 0,2% placa de 1,5 a 1,75 veces 10 a los seis fibroblastos embrionarios de ratón derivados del componente del complemento factor uno o ratones CF uno en medio medio día el día siete.

Agregue viajes a temperatura ambiente en un pocillo de una placa de seis pocillos de los fibroblastos reprogramados. Levanta suavemente las células y hace girar una placa de 100 veces G con medio PSC humano fresco todas las células en una proporción de uno a 16 en dos placas de metanfetamina CFI de 10 centímetros. Distribuya los agregados en un movimiento en espiral en el sentido de las agujas del reloj e incube durante aproximadamente 48 horas antes de reemplazar el medio.

Después de tres a cuatro semanas, use una aguja de calibre 21 para recoger de ocho a 10 piezas individuales de colonias específicas con una morfología típica similar a ESC y subclonarlas en pocillos individuales de CFI MFS después de la expansión. Confirmar que las células son pluripotentes mediante la formación de cuerpos embrionarios y el análisis de expresión de marcadores después de verificar el sitio de integración del coche madre como se describe en el protocolo de texto adjunto. Extirpe el vástago del automóvil aspirando primero el antiguo medio PSC humano en tres mililitros de medio PSC estándar combinado.

45 microlitros de adeno Cree pur o virus concentrado con ocho microgramos por mililitro de agentes de transfección. Luego agregue a las células e incube durante 24 horas después de la incubación, aspire el supinato viral para inducir el medio PSC humano para lavar las células dos veces. Luego agregue medio HPSC con dos microgramos por mililitro de micina pura y reemplácelo diariamente después de cinco días, subclone las colonias restantes y expándalas como se describe anteriormente en el video.

A continuación, descongele un vial de matriz de membrana basal pre Eloqua en hielo y diluya en medio basal frío hasta una concentración final de uno a 30. Use un mililitro por pocillo para cubrir el número deseado de pocillos de una placa de seis pocillos y deje reposar la placa a temperatura ambiente durante una hora. Luego, con una aguja de calibre 18, raye al menos de 20 a 30 colonias de un pozo previamente cubierto con mes.

Tenga cuidado de reducir el levantamiento de MES y la transferencia de las células de la placa. Después de la incubación de una hora, aspire la matriz del pocillo recubierto con una pipeta de 200 microlitros. Retire los trozos de las colonias raspándolos suavemente del plato viejo y colóquelos con cuidado en tres mililitros de medio recién combinado, uno en un plato recubierto de matriz.

Después de incubar durante 48 horas, cambie el medio diariamente cuando las PSC HI convertidas extirpadas y libres de alimentador alcancen el 80% de fluidez. Utilice un kit comercial de extracción de ADN para extraer el ADN genómico utilizando los cebadores que se muestran aquí y que son específicos para las integraciones exógenas del lentivirus del cartón. Analice el ADN por PCR para la escisión adecuada para la transición de las PSC HI posteriores a la extirpación a las condiciones de grado GMP.

Mezcle el medio combinado HPSC uno y el medio que cumple con las GMP de grado clínico o el medio combinado dos en una proporción de 80 a 20 precalentamiento a 37 grados Celsius. Aspire el medio combinado antiguo de las celdas y reemplácelo con tres mililitros de la nueva solución de medio caliente. Reemplace el medio diariamente durante tres días de paso de acuerdo con el protocolo de texto para mantener el tamaño y la densidad adecuados de la colonia en el cuarto día, reemplace el medio con una mezcla 50 50 de medios combinados cálidos uno y dos incubar durante tres días.

Reemplazando el medio diariamente el día siete, cambie a una proporción de 20 a 80 de medios combinados calentados uno y dos respectivamente y reemplácelo diariamente durante tres días. El día 10, cambie a tibio, 100% combinado medio dos y cambie diariamente. Las células se encuentran ahora en un medio libre de xeno completamente definido.

A continuación, después de usar un sustrato libre de xeno definido para cubrir un pocillo de una placa de seis pocillos, reemplace el medio libre de xeno en un pocillo de celdas de confluencia con un medio fresco que contenga una roca x. Después de incubar durante una hora, use una aguja de calibre 18 para convertir mecánicamente las células en las recién preparadas. Bueno, permita que las células se incuben sin ser molestadas durante dos días para permitir la máxima adhesión antes de caracterizar las células de acuerdo con el protocolo de texto.

Esta figura muestra una imagen representativa de tres líneas H-I-P-S-C pre-extirpadas diferentes después de la reprogramación con el enfoque del carro del tallo en una capa de mes, aquí se muestra el gel de PCR de transcripción inversa posterior a la escisión que muestra un subclon en particular completamente libre del lentivirus del carro del tallo, como lo demuestra la falta de una banda de amplicón específica para una secuencia particular endógena al carro del tallo. En esta figura, se muestra la cuantificación de los factores asociados asociados a la pluripotencia estándar de los factores asociados a la pluripotencia estándar de los IPC convertidos pre-con en una matriz que contiene xeno y los IPC de grado H libres de xeno posteriores al impuesto especial en una matriz sintética, incluidos SOX dos, OCT cuatro y nanog. El uso de QPCR se ilustra aquí.

Finalmente, como se ve aquí, las PSC de HI pre-convertidas y post-convertidas a condiciones de grado GMP se probaron mediante citometría de flujo para el ácido siálico y el ácido neurónico glicol indicativos de antígenos no humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo reprogramar fibroblastos dérmicos adultos humanos con el virus de reprogramación stemco, extirpar el virus del genoma y luego convertir completamente estas PSC HI en condiciones de grado clínico totalmente compatibles con la terapéutica humana. No olvide que trabajar con staca, un vector antiviral de tercera generación, puede ser extremadamente peligroso y hay que tomar precauciones.

Al realizar este procedimiento, se debe utilizar un EPP adecuado y una sala de cultivo de tejidos VSL dos plus.