La detección del antígeno leucocitario humano biomarcadores en cáncer de mama Utilizando-Label gratuita tecnología de biosensores

El objetivo general de este procedimiento es medir el antígeno leucocitario humano o los antígenos tumorales asociados a HLA en los fluidos del paciente para la estratificación de los pacientes a la inmunoterapia relevante. Esto se logra inmovilizando primero el receptor de células T que imita a los anticuerpos, conocido como TCRM, en la superficie de la MICROPLACA. El segundo paso es añadir la muestra del paciente junto con la dilución en serie de los monómeros HLA del péptido objetivo para generar una curva estándar, que permite la cuantificación del antígeno objetivo en las muestras de los pacientes.

A continuación, se monitoriza la unión del antígeno diana al anticuerpo en el sistema de bioensayo de marcado libre hasta que se alcanza el equilibrio. El paso final es analizar los datos resultantes utilizando la curva estándar para cuantificar la cantidad de antígeno diana en las muestras de los pacientes. En última instancia, la tecnología de biosensores sin etiquetas se utiliza para detectar biomarcadores de cáncer en muestras de pacientes.

La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes, como la lc MSS, es la detección rápida y de alto rendimiento de antígenos asociados a HLA. Esto permite la estratificación rápida de los pacientes con cáncer según las modalidades de tratamiento, ya que sirve como plataforma de detección de biomarcadores. Si bien este método está relacionado con el cribado de biomarcadores de cáncer, el sistema es en realidad aplicable a muchas aplicaciones, incluidos los ensayos basados en células, el cribado híbrido de inmunofenotipado o el cribado de bibliotecas de moléculas pequeñas.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando estábamos desarrollando un anticuerpo terapéutico que imitara el receptor de células T. Nos preguntamos, ¿cómo identificaríamos a los pacientes que más se beneficiarían de este tipo de terapia? La demostración de este procedimiento estará a cargo de Kristen Dahl, una estudiante graduada de biotecnología que trabaja en mi laboratorio.

Comience por preincubar la solución salina tamponada con fosfato o PBS a 28 grados Celsius para minimizar los cambios de resonancia relacionados con la temperatura. Agregue 50 microlitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS pH 7.2 a los pocillos de placas recubiertas de derivados de avadon. A continuación, abra el software del escáner de bioensayo.

Siga el asistente de configuración para definir el procedimiento experimental, que incluye la selección de blancos, patrones y muestras en el diseño de la placa, el ajuste de la temperatura, el número de escaneos por minuto y la duración del experimento. A continuación, inserte la placa de ensayo preparada en el escáner de bioensayo sin etiquetas e inicie el primer escaneo. La línea de base es el conjunto inicial de exámenes recopilados al inicio del experimento.

Si esta es la primera lectura que se realiza en esta placa específica, permita que el escáner funcione el tiempo suficiente para equilibrar la temperatura y eliminar la deriva en la línea de base. Una vez que la línea de base se haya estabilizado o después de al menos cinco exploraciones, detenga la lectura y expulse la placa. Deseche el PBS y agregue 50 microlitros de RL 21, un anticuerpo biotinilado, a todos los pocillos excepto a los de control en la placa.

Luego agregue 50 microlitros de PBS a los pozos de control. A continuación, vuelva a insertar la placa en el escáner de bioensayo y reanude la lectura hasta que se alcance la saturación. Después de aproximadamente 1,5 horas, detenga la lectura y expulse la placa.

A continuación, lave la placa tres veces con 200 microlitros por pocillo de PBS más 0,05%Tween 20 o PBST. Siga el lavado con tres enjuagues de 200 microlitros por pocillo de PBS pH 7.2 sin detergente. Golpee el exceso de PBS del plato sobre toallas de papel antes de pasar al siguiente paso.

A continuación, agregue 50 microlitros de PBS a todos los pozos activos. A continuación, vuelva a insertar la placa en el escáner de bioensayo y reanude la lectura para controlar la resonancia posterior al lavado. Después de la lectura, detenga la lectura y expulse la placa.

Para añadir el analito. Retire el PBS y agregue 50 microlitros por pocillo de un tampón de ensayo apropiado para este ensayo. El suero humano normal disponible comercialmente se diluyó de uno a 20 en PBS.

A continuación, abra el software del escáner de bioensayo y siga el asistente de configuración. Para definir el procedimiento experimental, inserte la placa en el escáner de bioensayo y comience una lectura de referencia Después de que la línea de base se haya estabilizado o después de al menos cinco exploraciones, detenga la lectura y expulse la placa. A continuación, retire el tampón de ensayo de los pocillos.

A continuación, añada los controles con monómero HLAA oh 2 0 1 que contenga péptidos relevantes o irrelevantes en concentraciones que oscilan entre 0,625 y 10 microgramos por mililitro en el tampón de ensayo. Luego agregue 50 microlitros de los estándares a los pozos de control de la placa. A continuación, agregue 50 microlitros del analito en tampón de ensayo a los pocillos de muestra de la placa.

Para este ensayo, se utilizó suero humano enriquecido disponible comercialmente. Vuelva a insertar la placa en el escáner de bioensayo y reanude la lectura hasta que se alcance la saturación aproximadamente 30 a 60 minutos después de la saturación, detenga la lectura y expulse la placa. Proceda a lavar la placa tres veces con 200 microlitros por pocillo de PBST, seguido de tres enjuagues con 200 microlitros por pocillo de PBS como antes, luego agregue 50 microlitros de tampón de ensayo a todos los pocillos activos.

Ahora vuelva a insertar la placa en el escáner de bioensayo y reanude la lectura para controlar la resonancia posterior al lavado antes de detener la lectura y expulsar la placa. Por último, analice los datos utilizando el software de escáner de bioensayo o exporte archivos de datos sin procesar al software de análisis estadístico preferido. El software del escáner de bioensayo genera automáticamente la curva de unión en función de la disposición de la placa proporcionada durante la configuración experimental.

Se inmovilizó RL 21 Biotinilado A-T-C-R-M o IgG dos A en la placa de ensayo AVID AVIDAN, los resultados representativos muestran la detección del antígeno tumoral diana F-L-S-L-H-L-A en una muestra de plasma de paciente en equilibrio y en el postlavado. La IgG dos A se utiliza como control para las secciones de tejido de unión inespecíficas que se tiñeron con un control positivo y controles negativos. Y en el caso de RL 21, una tinción del tejido tumoral por RL 21 A confirma la presentación de complejos F-L-S-L-H-L-A.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir los biomarcadores asociados a HLA en los fluidos del paciente utilizando anticuerpos que imitan el receptor de células T y monitorear la unión del antígeno objetivo al anticuerpo en el sistema de bioensayo sin etiqueta. Al intentar este procedimiento, es importante recordar incubar todos los tampones de muestra antes de usarlos para evitar picos de temperatura y usar el tampón de muestra correcto para cada paso.