Name: La detección del antígeno leucocitario humano biomarcadores en cáncer de mama Utilizando-Label gratuita tecnología de biosensores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprende a detectar biomarcadores de antígenos HLA asociados a tumores en muestras de pacientes mediante biosensores sin etiquetado. Esta técnica permite la estratificación rápida de pacientes para inmunoterapia personalizada.

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Estos estudios fueron apoyados en parte por la Corporación de Desarrollo de Abilene, que proporciona espacio de laboratorio y apoyo salarial para Experimmune, un Centro de Desarrollo Inmunoterapéutico en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Tecnológica de Texas y Resonant Sensors Incorporated.

Declaración de Ética: muestras identificadas-De tejidos y plasma humanos se obtuvieron de Hendrick Medical Center bajo una Junta de Revisión Institucional aprobado protocolo. 1. La adición de anticuerpo biotinilado NOTA: La vigilancia de este paso es opcional. Ver protocolo alternativo si no de supervisión. <ol><li> Obtener placas derivados recubierto con avidina disponibles en el mercado (véase Materiales y Equipos Tabla). </li><li> Añadir 50 l de tampón fosfato salino (PBS) pH 7,2 a los pocillos. NOTA: Preincubación de PBS a 28 ° C para reducir al mínimo los cambios relacionados con la temperatura de resonancia. </li><li> Software del escáner bioensayo abierto y siga el asistente de configuración para definir el procedimiento experimental que incluye la selección de espacios en blanco, estándares y muestras en el diseño de la placa, el ajuste de temperatura (28 ° C), el número de escaneos por minuto (1), y la duración del experimento ( 150 min para dar cabida a los pasos de preparación). </li&gt; <li> Inserte la placa de ensayo preparado en la etiqueta escáner bioensayo gratuita y comenzar la primera exploración. Cuando la primera exploración, seleccione &quot;autorreferencia para empezar&quot;. La línea base es el conjunto inicial de exploraciones recogidos en el inicio del experimento. Si esta es la primera lectura realizado en esta placa específico, permitir que el escáner se ejecute para equilibrar la temperatura y eliminar la deriva en la línea de base. Vea la Figura 2 para una captura de pantalla de una línea de base seguido de la adición de la muestra. </li><li> Después de la línea de base se ha estabilizado, o al menos 5 exploraciones, una pausa en la lectura y expulsar el plato. </li><li> Retire PBS por el dumping en el fregadero y se añaden 50 l RL21A anticuerpo biotinilado en [10 mg / ml en PBS pH 7,2] a todos, pero los pozos de control en el plato. Añadir 50 l de PBS a los pocillos de control. </li><li> Inserte la placa posterior en el escáner bioensayo y reanudar la lectura hasta que se alcance la saturación, de aproximadamente 1,5 horas. </li><li> Pausa la lectura y expulsar el plato. </li><li> Lave el<html> la placa 3 veces con 200 l / pocillo de solución salina tamponada con fosfato + 0,05% de Tween 20 (PBST) seguido por 3 lavados con 200 l / pocillo de PBS pH 7,2. Repita con PBS. Toque en el exceso de PBS de la placa sobre toallas de papel antes de pasar al siguiente paso. NOTA: Este paso se puede realizar en un lavador de placas automático o lavar la placa 3 veces con 200 l de PBST por vertidos de líquido en un fregadero y la sustitución de PBST con una pipeta. </li><li> Añadir 50 l de PBS pH 7,2 a todos los pocillos activos. </li><li> Inserte la placa posterior en el escáner bioensayo y reanudar la lectura para monitorear resonancia post-lavado. </li><li> Detener la lectura y expulsar el plato. </li></ol> Protocolo alternativo para el Paso 1: <ol start="13"><li> Añadir 50 l RL21A anticuerpo biotinilado en [10 mg / ml PBS] a todos los pocillos. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 1,5 horas o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar la placa 3 veces con 200 l / pocillo PBST seguido de 3 lavados con 200 l / PBS así como en el paso 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. La adición de analito <ol><li> Retire el PBS y añadir 50 l por pocillo de tampón de ensayo apropiado. Para este ensayo, se utilizó comercialmente disponible suero humano normal diluido 1:20 en PBS. </li><li> Software del escáner bioensayo abierto y siga el asistente de configuración para definir procedimiento experimental. </li><li> Inserte la placa en el escáner bioensayo y comenzar una línea de base leer. Si esta es la primera lectura realizado en esta placa específica, dejar correr el escáner que se equilibre la temperatura y eliminar la deriva en la línea de base. </li><li> Después de la línea de base se ha estabilizado, o al menos 5 exploraciones, una pausa en la lectura y expulsar el plato. </li><li> Retire el tampón de ensayo de los pozos. </li><li> Controles de espiga con HLA A * 02: 01 monómero portador relevante (FLSL) o (SLLV, YLEV, o KVL) péptidos irrelevantes en concentraciones que van desde [0,625 a 10 mg / ml] en tampón de ensayo. Añadir 50 l de estándares a los pocillos de control de la placa </li><li> Añadir 50 l de analito en tampón de ensayo a la muestrapocillos de la placa. Para este ensayo, se disparó se utilizó suero humano disponible comercialmente. </li><li> Inserte la placa posterior en el escáner bioensayo y reanudar la lectura hasta que se alcance la saturación, de aproximadamente 30 a 60 min. </li><li> Pausa la lectura y expulsar el plato. </li><li> Lavar la placa 3 veces con 200 l / pocillo PBST seguido de 3 lavados con 200 l / PBS así como en el paso 1.9. </li><li> Añadir 50 l de tampón de ensayo a todos los pocillos activos. </li><li> Inserte la placa posterior en el escáner bioensayo y reanudar la lectura para monitorear resonancia post-lavado. </li><li> Detener la lectura y expulsar el plato. NOTA: El tampón de ensayo podría ser PBS, medios de cultivo de tejidos, o suero humano diluido 1:20 en PBS dependiendo del objetivo del ensayo. </li></ol> Análisis 3. Datos <ol><li> Analizar el uso del software de escáner bioensayo o exportar archivos de datos brutos a software de análisis estadístico preferido. El software del escáner bioensayo genera automáticamente la curva de unión basado en eldisposición de la placa proporcionado durante la instalación experimental. NOTA: Si no se utiliza el software del escáner bioensayo para el análisis, siga los pasos 3.2 a 3.4. </li><li> Restar la línea de base y el control negativo de cada punto de datos subsiguiente. </li><li> Calcular la media y la desviación estándar para los pocillos replicados en cada punto de tiempo. </li><li> Generar un gráfico de la curva de unión o seleccionar los datos finales para gráficos de barras. </li></ol>

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</ol>

Los autores, Debra Wawro Weidanz y Robert Magnusson, son, respectivamente, Consejero Delegado y Director de Tecnología de Sensores Resonant Incorporated, que produce el lector y ensayo de placa placas bioensayo utilizados en este artículo.

El método descrito en este documento introduce un sistema de detección de biomarcadores para el diagnóstico del cáncer que permitan la detección rápida de complejos de péptido / HLA solubles en suero, plasma, orina o saliva muestras de pacientes en un alto rendimiento de 96 o de formato de 384 pocillos. Este sistema de ensayo que utiliza receptor de la célula T imitando anticuerpos monoclonales y un sistema de detección de etiqueta libre reduce el tiempo de análisis a menos de 1 hr en comparación con 3,5 hr por ELISA convencional. Este enfoque de alto rendimiento permite una rápida estratificación de los pacientes a los ensayos clínicos de vacunas terapéuticas de cáncer o productos biofarmacéuticos. Los métodos actuales para la detección de estos objetivos enfermedad requieren purificación por afinidad y HPLC-MS / MS de muestras de pacientes individuales, un proceso que consume tiempo y engorroso. Aunque este método es susceptible de técnicas de ELISA convencionales, existe la preocupación de que los reactivos de detección secundarias, tales como el anticuerpo anti-microglobulina β2 podrían alterar la estructura de la naciente HLUna molécula de inhibir la unión y a la detección limitar TCRM. Detección sin etiquetas alivia estas preocupaciones. Este procedimiento podría ser modificado para su uso en otros sistemas de etiqueta libre tal como un sistema de resonancia de plasmón superficial. Sin embargo, esto reduciría en gran medida las capacidades de rendimiento más altos en comparación con el sistema de bioensayo utilizado en este estudio. Este protocolo puede ser modificado de manera efectiva para la detección de biomarcadores no HLA en el suero y plasma del paciente con la adherencia a unos pocos pasos críticos. Se recomienda el control del proceso de recubrimiento inicial de anticuerpos para la optimización de la superficie, como &lt;200 pm cambio dará lugar probablemente a baja señal para la etapa posterior detección. La línea de base y post-lavado lee son útiles para el análisis de seguridad como la abundancia de proteínas de suero puede enmascarar la unión de baja concentración de analito. Finalmente, la variación de temperatura de las muestras puede dar como resultado así a la variación también. Se recomienda que todas las muestras se pre-incubaron und el controlador de temperatura de la unidad biosassay libre etiqueta fijado en 3.2 ° C por encima de la temperatura ambiente. Las muestras refrigeradas deben disponer de tiempo suficiente para alcanzar la temperatura de funcionamiento. Las modificaciones futuras de este protocolo incluirán multiplexación de TCRM en la superficie de la placa. El sistema de bioensayo es actualmente susceptibles de manchas de pozos a una densidad de al menos 8-plex. Mediante la introducción de 4-8 TCRM a cada pocillo, por volúmenes de muestra de prueba se reducen y permitir la recogida de datos cada vez más complejos por paciente. Esta capacidad podría informar además los pacientes con respecto a las opciones terapéuticas.

El antígeno leucocitario humano de clase I (HLA) muestras de péptidos de 8-11 aminoácidos de longitud derivados de la degradación proteasomal del repertorio de proteínas intracelulares y presenta estos péptidos en la superficie de todas las células nucleadas 1,2. El complejo HLA es &quot;biomarcador de la naturaleza&quot;, lo que indica la salud de cada célula (Figura 1) para que circulan los linfocitos T citotóxicos (CTL). Reconocimiento de la enfermedad asociada péptidos resultados en la eliminación de la célula infractor por CTL. Por lo tanto, la respuesta inmune adaptativa es muy efectivo en la eliminación de la infección viral y tumor. Sin embargo, el sistema inmune ejerce una presión que a menudo promueve la selección en busca de virus o tumor capaz de evadir una respuesta eficaz de CTL. Receptores de células T (imitando TCRM) anticuerpos monoclonales (mAb) que reconocen específica de péptido / HLA-A * 02: 01 complejos tales como los derivados de proteínas asociadas con cáncer de mama, factor de migración de macrófagos inhibitoria (MIF19-27) 3 y NY-ESO-1 157-165, permiten la detección y destrucción de las células del cáncer de mama en la ausencia de un antitumoral efectiva de respuestas de CTL 4,5. Este trabajo representativo se centra en el HLA-A * 0201 molécula, que se expresa hasta en un 30% de la población. Sin embargo, la identificación de otros complejos de HLA / péptido relevantes, seguido por la producción de TCRM permite el desarrollo de inmunoterapias dirigidas y el diagnóstico de enfermedades compañera, la ampliación de la utilidad de este trabajo a una población mucho más amplia. Una porción de los complejos de péptido / HLA con destino a la superficie celular se libera en el plasma. Debido a la naturaleza altamente compleja de péptidos / HLA piscinas, los métodos actuales para la minería de la immunopeptidome de biomarcadores HLA asociados son mucho tiempo. Este proceso requiere la purificación por afinidad de HLA soluble a partir de plasma, la separación de HLA péptidos asociados por cromatografía líquida de alta presión de fase inversa(RP-HPLC) y la secuenciación de péptidos por espectrometría de masas en tándem (MS / MS) 6,7. Aunque este proceso es una opción viable para el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas, es un proceso engorroso como una herramienta de diagnóstico compañero para objetivos asociados HLA ya en la vacuna terapéutica o de la tubería biofarmacéutica 8-10. TCRM dirigida contra estos objetivos proporcionan las herramientas para el desarrollo de diagnóstico compañero rápida destinadas a estratificar a los pacientes en los ensayos clínicos pertinentes y ofrecer opciones terapéuticas más informadas. En este trabajo, un sistema de detección de biomarcadores gran avance para el diagnóstico del cáncer se presenta que utiliza TCRM y un sistema de bioensayo libre de etiquetas que monitorea las interacciones biológicas con pasos de procesamiento mínimos. El sistema de bioensayo-etiqueta libre se basa en un método, que utiliza el efecto de resonancia de modo de guiado (GMR) que se produce en rejillas de guía de onda dieléctrica 11-14. Cuando los contactos de luz de banda ancha de la difracciónrejilla en las placas requeridas para este sistema, dos longitudes de onda específicas se reflejan. La interacción de unión entre un receptor y su ligando inmovilizado se monitoriza en tiempo real mediante el seguimiento del cambio de longitud de onda de resonancia con un analizador de espectro 12. Picos de resonancia separadas se producen por el incidente TE (normal al plano de incidencia vector eléctrico) y TM (vector magnético normal al plano de incidencia) estados de polarización que proporcionan múltiples puntos de datos que puede aumentar potencialmente la precisión de detección 11,14. El uso de anticuerpos placas pre-sensibilizadas en este sistema de ensayo libre de etiquetas, el tiempo de ejecución de un ensayo con el análisis de datos es de aproximadamente 45 min. Además, múltiples muestras de pacientes pueden ser interrogados en un formato de 96 o 384 pocillos, una clara ventaja sobre un formato basado en HPLC-MS / MS.

<table><tbody><tr><td>Sistema de detección de bioensayos sin etiquetas ResoSens</td><td>Sensores resonantes incorporados</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas bionetic de 96 pocillos sensibilizadas con Avidin</td><td>Sensores resonantes incorporados</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ResoVu</td><td>Sensores resonantes incorporados</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL21A TCRm biotinilado mAb&nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL9A TCRm biotinilado mAb&nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLSL HLA-A*02:01 Monómero&nbsp;</td><td>Secuencia peptídica completa experinmune</td><td></td><td></td>: FLSELTQQL</tr><tr><td>SLLV HLA-A*02:01 Monómero&nbsp;</td><td>Secuencia peptídica completa experinmune</td><td></td><td></td>: SLLMWITQV</tr><tr><td>YLEV HLA-A*02:01 Monómero&nbsp;</td><td>Secuencia peptídica completa experinmune</td><td></td><td></td>: YLEPGPVTV</tr><tr><td>KVL HLA-A*02:01 Monómero&nbsp;</td><td>Secuencia peptídica completa experinmune</td><td></td><td></td>: KVLEYVIKV</tr><tr><td>Suero humano normal agrupado&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP2657100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Sobrenadante Celular</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Células cultivadas en IMDM, 10% FBS y 1% penn/strep. Sobrenadantes cosechados de cultivos confluentes de 3 días.</td></tr><tr><td>Modificación de Iscove del medio de Dulbecco (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-63</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>ThermoFisher</td><td>5318-1</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato + 0.05% Tween 20 (PBST)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-Azinobis [ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico]-sal diamónica (ABTS)</td><td>ThermoFisher</td><td>37615</td><td></td></tr><tr><td>conejo antihumano y beta; 2 microglobulinas&nbsp;</td><td>Dako</td><td>A0072</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidasa conjugada de cabra anti-conejo IgG&nbsp;</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&nbsp; microplacas</td><td>ThermoFisher</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 lector de microplacas</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immpress Kit de reactivos</td><td>Vector</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpact DAB</td><td>Vector</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina QS</td><td>Vector</td><td>H3403</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a</td><td>MP BioMedicals</td><td>50328</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b</td><td>MP BioMedicals</td><td>50330</td><td></td></tr><tr><td>anti-HLA-A2 (BB7.2)</td><td>Experimmune</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prisma 5</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la detección del antígeno leucocitario humano biomarcadores en cáncer de mama utilizando-label gratuita tecnología de biosensores

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Según la Sociedad Americana del Cáncer, más de 200.000 mujeres serán diagnosticadas con cáncer de mama invasivo cada año y aproximadamente 40.000 morirán de la enfermedad. Muestras de la clase de antígenos leucocitarios humanos (HLA) I péptidos derivados de la degradación proteasomal de las proteínas celulares y presenta estos fragmentos en la superficie celular para ser interrogado por los que circulan los linfocitos T citotóxicos (CTL). Generación de imitar receptor de células T (TCRM) anticuerpos monoclonales (mAb) que reconocen el cáncer de mama específica de péptido / HLA-A * 02: 01 complejos tales como los derivados de factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF 19-27) y NY-ESO- 1 157-165 permiten la detección y destrucción de las células del cáncer de mama en la ausencia de una respuesta eficaz CTL antitumoral. Complejos HLA / péptido intactos clase I se derraman por las células de cáncer de mama y representan biomarcadores de cáncer potencialmente relevantes. En este trabajo, un sistema de detección de biomarcadores gran avance para el cáncer de diagnósticos incorporación de receptor de células T anticuerpos monoclonales imitan combinados con una novela, biosensor libre de etiquetas utilizando-modo guiado de resonancia tecnología de sensores (GMR) se presenta. Detección de cobertizo MIF / HLA-A * 02: 01 complejos en los sobrenadantes de células MDA-MB-231, Punta de suero humano, y el plasma del paciente se demuestra. El impacto de este trabajo podría revolucionar la medicina personalizada a través del desarrollo de diagnóstico de enfermedades de compañía para inmunoterapias específicas.

Se realizó un conjunto representativo de experimentos utilizando el bien caracterizado TCRM, RL21A, un anticuerpo monoclonal IgG2a murino que reconoce específicamente un péptido (19-27 MIF o FLSL) dentro del contexto de la HLA-A * 02: 01 3 molécula. El monómero de péptido / HLA cognado, así como monómero de HLA irrelevante 15, se utilizó para demostrar el procedimiento descrito. La Figura 3 ilustra el formato de ensayo. RL21A es específico para el monómero FLSL / HLA con poca reactividad cruzada con otro péptido / HLA complejos 3. Esta especificidad se recapitula utilizando el sistema de bioensayo libre de etiquetas (Figura 4). La sensibilidad del sistema de ensayo biológico libre de etiqueta para este experimento es en el rango bajo nanomolar como se determina por titulación del anticuerpo RL21A en FLSL inmovilizada / monómero de HLA (Figura 5). Aunque la señal de fondo es significativamente mayor en las muestras de suero, sdetección ESPECÍFICOS de monómero FLSL / HLA en el suero humano con púas se logra en la Figura 6 y un gradiente de concentración es fácilmente discernible en estas muestras. Finalmente, los sobrenadantes de la línea celular MDA-MB-231, mostrados previamente para presentar la FLSL / HLA-A * 02: 01 molécula, se muestran para contener monómero soluble FLSL utilizando esta etiqueta plataforma de ensayo libre (Figura 7). La posterior adición de monómero FLSL / HLA aumenta la señal en RL21A (Figura 7). Debido a la sensibilidad del sistema, bien a la variación bien incluyendo cambios de resonancia negativos pueden ocurrir como resultado de las fluctuaciones de temperatura como se ha visto como una función de las desviaciones estándar de las Figuras 4 y 5. Estas variaciones se pueden reducir dramáticamente por pre-incubación de todas las muestras y el lector de placas de bioensayo a una temperatura en ligero exceso de la temperatura ambiente (es decir, 28 ° C). En la Figura 8, brevemente, 96-bien placas de poliestireno se recubrieron con [10 mg / ml] de RL21A durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavó con PBST, se bloquearon con leche baja en grasa 0,5%, se lavó con PBST, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con diluciones en serie de FLSL HLA monómero en el suero humano normal diluido 1:10 en PBS para generar una curva estándar o plasma de paciente diluido 1:10 en PBS. La placa se lavó con PBST, se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con conejo microglobulina β2 anti-humano [1: 5000] para detectar HLA intacto, y se lavaron en PBST. Las placas se incubaron a continuación durante 30 min con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo [1: 10.000] y se lavaron con PBST. Detección colorimétrica se realizó usando ABTS (2,2'-azinobis [ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico] sal -diammonium) sustrato con un tiempo de incubación de 15 min y se observó a 405 nm en un lector de microplacas. FLSL / HLA se detectó en tres muestras de pacientes. En la Figura 8B, el paciente RL.064 plasma se diluyó 1:20 en PBS y luego añadired a la placa y monitoreados en el detector sin etiquetas durante 60 minutos. Detección específica de complejo FLSL / HLA en el suero del paciente se llevó a cabo. Prueba t de Student se realizó con gráficos y estadísticas de software (p &lt;0,05). En la Figura 8C, las secciones de tejido se tiñeron a 1 mg / ml con el ratón anti-HLA-A2 (BB7.2) como control positivo, RL21A, IgG2b e IgG2a, respectivamente como controles negativos. La tinción se detectó utilizando un kit anti-ratón de detección, DAB (diaminobenzadina) y QS hematoxilina para la tinción nuclear como lo indique el fabricante. La tinción de tejido tumoral por RL21A confirma la presentación de complejos FLSL / HLA. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg"> Figura 1:. Tumor la presentación de antígenos por el antígeno leucocitario humano de clase I transformación cancerosa es un trastorno intracelular. HLA muestra intracellulproteínas ar y revelar cambios relacionados con el cáncer en la superficie celular. CTL y TCRM son capaces de reconocer las células cancerosas a través de complejos HLA-péptido distintas a las células. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg"> Figura 2:. Captura de adquisición de datos en el software del escáner bioensayo Ejemplo de adquisición de datos que muestra la línea de base inicial scan seguido por RL21A Además anticuerpo a una placa recubierta con 10 mg / ml de complejo FLSL / HLA. Las concentraciones de anticuerpos son como indicado. Cada línea representa un individuo bien monitoreado en el tiempo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg"> Figura 3:. El formato del ensayo Ilustración de anticuerpos inmovilizados sobre la superficie de la rejilla de difracción de la placa de ensayo rel capturaEvant complejos péptido / HLA en solución. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg"> Figura 4: Especificidad del RL21A para FLSL / HLA complejo Demostración de la especificidad de la biotinilado RL21A TCRM por su correspondiente monómero (FLSL) HLA en comparación con monómero de HLA irrelevante (YLEV, SLLV, y KVL).. Biotinilado RL21A TCRM [10 mg / ml] se inmovilizó sobre la superficie de la placa de ensayo recubierta de avidina y la detección se realizó utilizando no marcado monómero HLA relevante o irrelevante [10 mg / ml] en PBS. RL21A era específico para el Complejo FLSL / HLA. ANOVA de dos vías se realizó con gráficos y estadísticas de software (p &lt;0,001). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg"> Figura 5:. La unión sensibilidad de RL21A a sus afines péptido / complejo HLA Ilustración de la detectisobre el límite y vinculante sensibilidad de RL21A al complejo FLSL / HLA. Biotinilado HLA Monómero FLSL [10 mg / ml] se inmovilizó sobre la superficie de la placa de ensayo y RL21A no marcado se añadió a la placa en diluciones seriadas en PBS como se indica. Detección para este sistema estaba en el intervalo nanomolar bajo. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg"> Figura 6: Detección de HLA complejos en suero enriquecidas humano Demostración de la detección de HLA en el suero humano.. Biotinilado RL21A TCRM [10 mg / ml] se inmovilizó sobre la superficie de la placa de ensayo recubierta de avidina. Agrupado suero humano normal de pinchos con relevante (FLSL) o irrelevante (SLLV) monómero de HLA se diluyó 1:20 en PBS y después se añadió a la placa y monitoreado en el detector sin etiquetas durante 60 minutos. Detección específica del complejo FLSL / HLA en el suero humano se logró. En general, la señal de fondo (monómero SLLV irrelevante) es altaer para las muestras de suero diluidas en comparación con los analitos purificados en PBS (véase la Figura 4). ANOVA de dos vías se realizó con gráficos y estadísticas de software (p &lt;0,0001). <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg"> Figura 7:. Se detectaron los complejos de HLA solubles en cáncer de mama sobrenadantes de cultivo celular La capacidad para detectar HLA en sobrenadantes de células de cáncer de mama se demuestra. Biotinilado RL21A TCRM, RL9A TCRM (control negativo), y un control de isotipo se inmovilizaron sobre la superficie de la placa de ensayo. Se añadieron pinchos [5 mg / ml] y no enriquecido MDA-231 sobrenadantes de cultivo celular y la unión se controló durante 60 minutos en el detector sin etiquetas. FLSL y monómero SLLV HLA pinchos muestras representan controles positivos para RL9A y RL21A vinculante. Utilizó un modelo lineal se realizó a través de gráficos y estadísticas de software (p &lt;0,0001). Figura 8:. Detección específica de complejos FLSL / HLA en muestras de pacientes (A) una enzima tradicional ensayo de inmunoabsorción ligado (ELISA) se utilizó para detectar los complejos específicos FLSL / HLA en el plasma del paciente. (B) Biotinylated RL21A TCRM o IgG2a [10 g / ml] se inmovilizan en la placa de ensayo avidina. (C) el tejido del tumor de mama de RL.064 paciente estaba manchada como está descrita anteriormente 3 para verificar la presentación de tumores de los complejos FLSL / HLA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Complejos HLA / péptido intactos clase I se derraman por las células cancerosas, lo que representa un potencial biomarcador del cáncer relevante. Utilizando la tecnología de sensor de etiqueta libre y receptor de células T imitando anticuerpos monoclonales, detección de cobertizo MIF / HLA-A * 02: 01 complejos en los sobrenadantes de células MDA-MB-231, Punta de suero humano, y el plasma del paciente se demuestra, lo que permite el desarrollo de una novela cáncer de la plataforma de diagnóstico.

La detección del antígeno leucocitario humano biomarcadores en cáncer de mama Utilizando-Label gratuita tecnología de biosensores

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

El objetivo general de este procedimiento es medir el antígeno leucocitario humano o los antígenos tumorales asociados a HLA en los fluidos del paciente para la estratificación de los pacientes a la inmunoterapia relevante. Esto se logra inmovilizando primero el receptor de células T que imita a los anticuerpos, conocido como TCRM, en la superficie de la MICROPLACA. El segundo paso es añadir la muestra del paciente junto con la dilución en serie de los monómeros HLA del péptido objetivo para generar una curva estándar, que permite la cuantificación del antígeno objetivo en las muestras de los pacientes.A continuación, se monitoriza la unión del antígeno diana al anticuerpo en el sistema de bioensayo de marcado libre hasta que se alcanza el equilibrio. El paso final es analizar los datos resultantes utilizando la curva estándar para cuantificar la cantidad de antígeno diana en las muestras de los pacientes. En última instancia, la tecnología de biosensores sin etiquetas se utiliza para detectar biomarcadores de cáncer en muestras de pacientes.La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes, como la lc MSS, es la detección rápida y de alto rendimiento de antígenos asociados a HLA. Esto permite la estratificación rápida de los pacientes con cáncer según las modalidades de tratamiento, ya que sirve como plataforma de detección de biomarcadores. Si bien este método está relacionado con el cribado de biomarcadores de cáncer, el sistema es en realidad aplicable a muchas aplicaciones, incluidos los ensayos basados en células, el cribado híbrido de inmunofenotipado o el cribado de bibliotecas de moléculas pequeñas.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando estábamos desarrollando un anticuerpo terapéutico que imitara el receptor de células T. Nos preguntamos, ¿cómo identificaríamos a los pacientes que más se beneficiarían de este tipo de terapia? La demostración de este procedimiento estará a cargo de Kristen Dahl, una estudiante graduada de biotecnología que trabaja en mi laboratorio.Comience por preincubar la solución salina tamponada con fosfato o PBS a 28 grados Celsius para minimizar los cambios de resonancia relacionados con la temperatura. Agregue 50 microlitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS pH 7.2 a los pocillos de placas recubiertas de derivados de avadon. A continuación, abra el software del escáner de bioensayo.Siga el asistente de configuración para definir el procedimiento experimental, que incluye la selección de blancos, patrones y muestras en el diseño de la placa, el ajuste de la temperatura, el número de escaneos por minuto y la duración del experimento. A continuación, inserte la placa de ensayo preparada en el escáner de bioensayo sin etiquetas e inicie el primer escaneo. La línea de base es el conjunto inicial de exámenes recopilados al inicio del experimento.Si esta es la primera lectura que se realiza en esta placa específica, permita que el escáner funcione el tiempo suficiente para equilibrar la temperatura y eliminar la deriva en la línea de base. Una vez que la línea de base se haya estabilizado o después de al menos cinco exploraciones, detenga la lectura y expulse la placa. Deseche el PBS y agregue 50 microlitros de RL 21, un anticuerpo biotinilado, a todos los pocillos excepto a los de control en la placa.Luego agregue 50 microlitros de PBS a los pozos de control. A continuación, vuelva a insertar la placa en el escáner de bioensayo y reanude la lectura hasta que se alcance la saturación. Después de aproximadamente 1,5 horas, detenga la lectura y expulse la placa.A continuación, lave la placa tres veces con 200 microlitros por pocillo de PBS más 0,05%Tween 20 o PBST. Siga el lavado con tres enjuagues de 200 microlitros por pocillo de PBS pH 7.2 sin detergente. Golpee el exceso de PBS del plato sobre toallas de papel antes de pasar al siguiente paso.A continuación, agregue 50 microlitros de PBS a todos los pozos activos. A continuación, vuelva a insertar la placa en el escáner de bioensayo y reanude la lectura para controlar la resonancia posterior al lavado. Después de la lectura, detenga la lectura y expulse la placa.Para añadir el analito. Retire el PBS y agregue 50 microlitros por pocillo de un tampón de ensayo apropiado para este ensayo. El suero humano normal disponible comercialmente se diluyó de uno a 20 en PBS.A continuación, abra el software del escáner de bioensayo y siga el asistente de configuración. Para definir el procedimiento experimental, inserte la placa en el escáner de bioensayo y comience una lectura de referencia Después de que la línea de base se haya estabilizado o después de al menos cinco exploraciones, detenga la lectura y expulse la placa. A continuación, retire el tampón de ensayo de los pocillos.A continuación, añada los controles con monómero HLAA oh 2 0 1 que contenga péptidos relevantes o irrelevantes en concentraciones que oscilan entre 0,625 y 10 microgramos por mililitro en el tampón de ensayo. Luego agregue 50 microlitros de los estándares a los pozos de control de la placa. A continuación, agregue 50 microlitros del analito en tampón de ensayo a los pocillos de muestra de la placa.Para este ensayo, se utilizó suero humano enriquecido disponible comercialmente. Vuelva a insertar la placa en el escáner de bioensayo y reanude la lectura hasta que se alcance la saturación aproximadamente 30 a 60 minutos después de la saturación, detenga la lectura y expulse la placa. Proceda a lavar la placa tres veces con 200 microlitros por pocillo de PBST, seguido de tres enjuagues con 200 microlitros por pocillo de PBS como antes, luego agregue 50 microlitros de tampón de ensayo a todos los pocillos activos.Ahora vuelva a insertar la placa en el escáner de bioensayo y reanude la lectura para controlar la resonancia posterior al lavado antes de detener la lectura y expulsar la placa. Por último, analice los datos utilizando el software de escáner de bioensayo o exporte archivos de datos sin procesar al software de análisis estadístico preferido. El software del escáner de bioensayo genera automáticamente la curva de unión en función de la disposición de la placa proporcionada durante la configuración experimental.Se inmovilizó RL 21 Biotinilado A-T-C-R-M o IgG dos A en la placa de ensayo AVID AVIDAN, los resultados representativos muestran la detección del antígeno tumoral diana F-L-S-L-H-L-A en una muestra de plasma de paciente en equilibrio y en el postlavado. La IgG dos A se utiliza como control para las secciones de tejido de unión inespecíficas que se tiñeron con un control positivo y controles negativos. Y en el caso de RL 21, una tinción del tejido tumoral por RL 21 A confirma la presentación de complejos F-L-S-L-H-L-A.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir los biomarcadores asociados a HLA en los fluidos del paciente utilizando anticuerpos que imitan el receptor de células T y monitorear la unión del antígeno objetivo al anticuerpo en el sistema de bioensayo sin etiqueta. Al intentar este procedimiento, es importante recordar incubar todos los tampones de muestra antes de usarlos para evitar picos de temperatura y usar el tampón de muestra correcto para cada paso.

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La detección del antígeno leucocitario humano biomarcadores en cáncer de mama Utilizando-Label gratuita tecnología de biosensores (Video) | JoVE Journal

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