Un híbrido método de extracción de ADN para la Evaluación de las comunidades bacterianas cualitativa y cuantitativa de Aves de Corral en muestras de producción

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar una nueva técnica de extracción de ADN que combine la homogeneización mecánica del ADN con la eliminación de inhibidores de PCR y el estándar de oro y el método de extracción somática para muestras ambientales a lo largo del continuo de producción avícola. Esto se logra dividiendo primero una muestra ambiental en tubos de microcentrífuga que contienen una mezcla de perlas para homogeneizar de manera efectiva las muestras ambientales complejas. El segundo paso es colocar los tubos en un homogeneizador de alta potencia para liberar eficientemente los ácidos nucleicos de las células bacterianas y la matriz ambiental.

A continuación, el homogeneizado se utiliza como material de partida para el método de extracción de ADN enzimático estándar de oro a través de la fase de unión de inhibición de PCR. El paso final es colocar las muestras en una estación de trabajo robótica de extracción de ADN para proporcionar al usuario muestras de ADN extraídas susceptibles de una gran cantidad de aplicaciones posteriores, en última instancia, PCR cuantitativa y análisis de microbioma utilizando la plataforma de aluminio MiSeq, se utilizaron para demostrar que este novedoso método híbrido proporciona la mejor combinación de evaluaciones cualitativas y cuantitativas de las comunidades bacterianas totales en comparación con el procesamiento de muestras con el método de extracción mecánica o enzimática solo. Este método proporciona información sobre el análisis de las comunidades microbianas a lo largo del continuo de la producción avícola, pero también se puede aplicar a otros sistemas agrícolas, como el ganado porcino o la producción de cultivos que contienen muestras ambientales igualmente complejas.

La demostración de este procedimiento estará hoy a cargo de Kaitlyn Griffin, una estudiante de mi laboratorio. Para comenzar el experimento, pon un baño de agua a 95 grados centígrados. A continuación, pese tres réplicas de 0,33 gramos para analizar un total de un gramo de temperatura ambiente, suelo o material fecal en un tubo endotraqueal de dos mililitros de médula extrauterbulante

Agregue 825 microlitros de tampón de fosfato de sodio y 275 microlitros de solución de prelisis o PLS a un tubo de muestra. A continuación, agite las muestras durante 15 segundos después de mezclarlas, centrifuga los tubos a 14.000 Gs durante cinco minutos. Decantar el sobrenadante y añadir 700 microlitros de tampón A SL. A continuación, agita el tubo durante cinco segundos.

Abra un tubo a la vez para evitar la contaminación. A continuación, asegúrese de que haya un espacio de cabeza del 10% del volumen total en el tubo cónico antes de colocar las muestras en el instrumento de preparación rápida 24. Homogeneizar las muestras a una velocidad de seis metros por segundo durante 40 segundos.

Tenga en cuenta la diferencia entre la preparación rápida 24 y el vórtice después de la homogeneización. Centrifugar la muestra a 14.000 Gs durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril de dos mililitros a la muestra restante en el tubo ET de la matriz de lisis a 700 microlitros adicionales de un tampón SL para volver a homogeneizar y centrifugar.

Con los ajustes anteriores, coloque clips de bloqueo de plástico en los tubos de muestra para asegurarse de que no se abran e incube los sobrenadantes en un baño de agua a 95 grados Celsius durante cinco minutos. A continuación, abra cada tubo de microcentrífuga para liberar la presión, vuelva a tapar los tubos y vórtelos durante 15 segundos. Centrifugar las muestras a 14.000 GS durante un minuto.

Después de la centrifugación, transfiera 1,2 mililitros del sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril de dos mililitros. A continuación, coloque el blíster que contiene la lengüeta directamente sobre el tubo de microcentrífuga abierto y empuje suavemente la lengüeta fuera del blíster dentro del tubo. Para evitar el contacto entre la lengüeta de inhibición X y el tubo, agregue una lengüeta de inhibición X a cada muestra.

A continuación, agite los tubos hasta que las muestras se conviertan en un líquido uniformemente blanquecino. Incubar las muestras durante un minuto a temperatura ambiente y centrifugarlas a 14.000 quesos durante cinco minutos, evitando las partículas restantes en el fondo de los tubos. Transfiera todo el líquido a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros.

A continuación, centrifugar los tubos a toda velocidad durante cinco minutos. Antes de iniciar la purificación automatizada del ADN, asegúrese de que la estación de trabajo contenga la cantidad adecuada de puntas de filtro y tampones. A continuación, agregue tubos ellucian y tubos de filtro a los adaptadores del rotor y agregue 400 microlitros de cada muestra a la ranura central del adaptador del rotor.

Coloque los adaptadores de rotor en la centrífuga de la estación de trabajo y asegúrese de que todas las tapas de los tubos de microcentrífuga estén correctamente aseguradas dentro del adaptador de rotor. Añada la solución de proteinasa K a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y colóquelo en la ranura A de la estación de trabajo. Agregue dos tubos de microcentrífuga con bloqueo seguro de mililitros a la sección del agitador de la estación de trabajo y asegúrese de que las tapas de los tubos de muestra estén colocadas de manera segura.

Con la pantalla táctil de la estación de trabajo, seleccione el protocolo de detección de patógenos de heces humanas en heces de ADN y lea las pantallas posteriores para asegurarse de que la estación de trabajo se cargó correctamente. Una vez que se hayan pasado todas las pantallas de verificación, seleccione iniciar para ejecutar el protocolo. A continuación, retire las muestras de los adaptadores del rotor.

Combine las tres purificaciones repetidas para una muestra individual utilizando un sistema basado en centrifugación y evaporación. Vuelva a eluir la muestra hasta un volumen final de 100 microlitros con tampón tris EDTA. Finalmente, tape las muestras y colóquelas a menos 20 grados centígrados hasta que sean necesarias para el análisis posterior.

Este gráfico demuestra que el método mecánico proporcionó sistemáticamente las estimaciones más altas de abundancia de genes bacterianos normalizados totales para muestras fecales y de hojarasca. El método enzimático presentó las estimaciones más bajas en todos los casos. El novedoso método de extracción híbrido produjo la mejor combinación de estimaciones cualitativas y cuantitativas de la comunidad bacteriana total.

De los tres métodos de extracción probados. Ahora debería tener una mejor comprensión de cómo realizar este novedoso método de extracción de ADN híbrido semiautomatizado y ver su utilidad en la evaluación cualitativa y cuantitativa de las comunidades microbianas a partir de muestras ambientales complejas.