Name: Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Aprende a obtener imágenes de alta resolución de fotorreceptores proteicos mediante microscopía de fuerza atómica con mapeo nanomecánico cuantitativo PeakForce. Este método permite visualizar dímeros proteicos intactos en superficie de mica.

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El programa de la NSF-MRI (CHE: 1229103) es reconocido por la financiación de la compra de la nueva electrónica de control, software, líquido de las células, y otros equipos necesarios para montar un doble AFM / STM. Reconocemos las instalaciones compartidas en la Universidad de Chicago programa NSF-MRSEC (DMR-0820054) para obtener ayuda con la instrumentación de AFM, la capacitación y formación de imágenes, y de tiempo de instrumentos puestos a disposición por la Red de Investigación Instalaciones Materiales (DMR-0820054). Particularmente Agradecemos al Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, y el Prof. Ka Yee Lee para dar la bienvenida a nuestros estudiantes antes de la financiación de la propuesta de la NSF-MRI que trajo la instrumentación necesaria para nuestro campus. Reconocemos la financiación de una beca Título III STEM (ID: P031C110157) otorgó a la Universidad Northeastern Illinois que proporciona becas de investigación de verano para estudiantes y profesores, así como el apoyo a los consumibles. Por último, reconocemos Bruker-Nano, Inc. para la continuación del apoyo instrumental y permiso para reproduce un gráfico que muestra el mecanismo de PeakForce QNM y usar la palabra ScanAsyst para describir el software automatizado.

1. Informática y Microscopio Set Up <ol><li> Abra la válvula del cilindro N 2 y ajustar las perillas para asegurar la mesa de aire está flotando y el nivel. </li><li> Encienda el ordenador, el controlador y la luz de fibra óptica en este orden. </li><li> Ajuste el escáner al modo / LFM AFM y centrar la cámara en la cabeza AFM. </li><li> Software de código abierto. Seleccione categoría experimento &quot;Propiedades nanomecánicos&quot;, &quot;Quantitative nanomecánico Mapping&quot; en el grupo experimento, y &quot;PeakForce QNM en Fluid&quot; bajo experimento. Haga clic en Experimento de carga y luego Configuración. </li><li> Enfoque la cámara con el objetivo Z para ver la superficie del escenario. Uso de la gruesa arriba / abajo piezos mueven la etapa de aproximadamente 1 mm por debajo de la superficie de la abertura de la cabeza AFM. </li></ol> 2 Preparación de Superficie Mica <ol><li> Presione una etiqueta adhesiva sobre la cara de un disco limpio soporte de la muestra (15 mm de diámetro, 0,8 mm de espesor). Empuje una mica V-4disco de grado (25 x 25 x 26 mm) sobre el adhesivo hasta que quede firmemente unido. </li><li> Frota un trozo de cinta adhesiva transparente sobre la mica asegurar que esté completamente adherido sin burbujas de aire. Tire de la cinta de la mica de un lado para escindir de manera uniforme ella. Repita si es necesario para asegurar la mica es plana. </li><li> Agarre el disco de soporte, lado limpio mica para arriba, con un par de pinzas circulares (pinzas de disco), y coloque en el escáner. La mica debe ser por debajo del nivel de la abertura de la cabeza AFM. </li></ol> Asamblea Cell 3. fluido e Imagen de Mica Surface <ol><li> Enjuague la celda de fluido, junta tórica, adaptador de la jeringa, el adaptador de la manguera y la manguera de expulsión en etanol al 100%. Enjuague la celda de fluido en agua DI. Deje que todo el aire partes seque por completo. </li><li> Empuje el adaptador de la manguera en el puerto de la célula de fluido limpio. Presione suavemente la junta tórica en la muesca centro de la celda de fluido usando pinzas plana encabezados. </li><li> Presione el resorte ligeramente en el clip de retención de la sonda y convertirlo lejos de la del groove por la punta. </li><li> Sujete la sonda en el extremo largo de la punta con unas pinzas de punta plana. Coloque la sonda en la ranura con la punta hacia el centro de la célula. Empuje el resorte en y ajustar el clip de retención sobre la sonda para asegurarlo (Figura 1B). </li><li> Compruebe la pinza en el AFM para asegurarse de que está completamente retraída (Figura 1C). </li><li> Coloque la celda de fluido, la junta tórica y la sonda hacia abajo, en la parte superior de la muestra de mica. Deje que la cámara de fluido para descansar en los pernos de la AFM. Baje la abrazadera para estabilizar la cámara de fluido en el escenario. Pulse el interruptor hacia abajo en el microscopio hasta que una inspección visual muestra la junta tórica firmemente comprimido entre el disco de soporte y la celda de fluido. </li><li> Mientras observa el monitor, enfocar el mando de ajuste grueso para visualizar la parte superior de la celda de fluido en la pantalla. </li><li> Mueva el microscopio hasta que haya una imagen clara de la punta utilizando los botones de ajuste de X / Y y Z el objetivo. La punta se Appoído como una metálica, triángulo de oro. Mueva la punta más cerca de la superficie de la muestra usando la palanca piezo abajo en el microscopio. Se centran en la reflexión de la punta. No pierda de vista el voladizo real en relación a su reflejo. En esta etapa, deben ser estrechamente alineados, pero no completamente superpuesta. </li><li> Conecte el adaptador de la jeringa a una jeringa estéril de 1 ml. Una un extremo de la manguera de inyección para el adaptador de jeringa y coloque el otro extremo de la manguera en el recipiente de solución tampón. Extienda completamente el émbolo de la jeringa. </li><li> Conecte la manguera al adaptador de manguera en la celda de fluido. Presione suavemente el émbolo hasta que el líquido se llena completamente la cámara central. Compruebe la célula para asegurar que no haya burbujas de aire. Compruebe que hay derraman hacia fuera de la célula de fluido en el microscopio no fluido. Coloque la jeringa sobre un soporte sólido levantada. </li><li> Utilice la alimentación de la cámara y las perillas de traducción / Y X para localizar el láser en la pantalla (un punto rojo difuso). Usando el láser movembotones de control de ENT, se mueven el láser en la punta. </li><li> Ajuste con precisión los controles de láser y espejos hasta que la señal suma que aparece en el microscopio se maximiza (valor = 4-6). </li><li> Ajuste el ángulo del diodo cuadrante usando los botones en la parte trasera izquierda y el lado superior izquierdo de la cabeza de exploración para reducir las deflexiones verticales y horizontales que se muestran en el microscopio lo más cerca posible a cero (± 0,1). </li><li> En el software, seleccione opciones de adquisición. Como mínimo, seleccione la altura (traza y retraza), error de fuerza máxima y la deformación. Las otras opciones son dependientes del usuario y se pueden adaptar en base a la información específica deseada por el experimentador. </li><li> Seleccione &quot;línea&quot; para RT Plane Fit en cada ventana de adquisición. Seleccione &quot;ninguno&quot; para el OT Plano Fit en las ventanas de altura. Ajuste el X e Y offset y ángulo de lectura a cero, si no lo ha hecho. </li><li> Ajuste la velocidad de barrido de 1 Hz, la muestra por la línea 256, el control automático ScanAsystal individuo, y el auto Z límite ScanAsyst en off. Cambiar el límite de Z a 500 nm. Ajuste el tamaño de escaneo a 1 micra. </li><li> Haga clic en participar. En este punto, la punta se aproxima a la superficie. Mientras que la punta se acerca, observar el cambio de voltaje piezo Z en la esquina inferior izquierda de la pantalla. Si la punta se sale del rango, retire la punta y re-enfoque. Si esto no funciona, puede necesitar ser cambiado con el fin de tener un enfoque exitoso de la punta. Una vez que la punta está activado, las líneas comenzarán a aparecer en cada una de las ventanas de adquisición que compondrán una imagen. </li><li> Tomar imágenes de mica en 1 x 1 my un zoom lentamente para asegurarse de que la superficie de la mica es limpia y plana. Haga clic en la captura continua para guardar las imágenes tal y como aparecen. Acercar y moverse alrededor de la superficie si lo deseas. </li></ol> 4. Proteína Deposición y Preparación de la muestra de la Imagen <ol><li> Obtener muestra de proteína purificada 38 y mantener en hielo. Si se almacena en un congelador, descongelar la muestra enhielo durante 5 min. </li><li> Diluir la proteína a 0,0010 mg / ml solución buffer de imágenes utilizando refrigerado. El buffer de imágenes se utiliza aquí es 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), NaCl 150 mM, y 15 mM de MgCl 2. </li><li> Llenar una cámara 4 (100 x 15 mm) placa de Petri con solución buffer de imágenes refrigerado. Llenar cada cámara con al menos 5 ml de solución. Mezclar suavemente la solución de proteína se diluye con la punta unida a micropipeta. </li><li> Aplicar 200 l de la solución de proteína diluida a la superficie de la mica ya preparado. Después de 30 segundos, recoger la proteína de superficie / mica con las pinzas circulares (pinzas de disco). Mantenga la muestra paralela a la mesa de laboratorio. </li><li> Mientras sostiene la muestra, sumergir inmediatamente la muestra en la solución tampón contenida en el primer cuadrante de la placa de Petri (paso 4.2) asegurando al mismo tiempo que la muestra es paralela a la cuenca de la placa de Petri. Después de 1 segundo, retirar la muestra. </li><li> Seguir apretando la muestra paralela a la cuencade la placa de Petri, repita el paso 4.5 para los tres cuadrantes restantes. </li><li> Coloque el disco sobre un paño libre de polvo seco, para quitar el exceso de humedad y transferir el disco en la platina del microscopio. No toque la superficie real con el paño. No permita que la muestra se seque. </li><li> Repita los pasos 3.6 a 3.16. </li></ol> 5. Imaging proteínas en Mica <ol><li> Haga clic en la caja de parámetros de la comprobación en el lado izquierdo de la pantalla. Tamaño de Primavera y radio de la punta deben establecerse basa en que se utiliza la punta. </li><li> Haga clic en participar. Al igual que en el proceso de formación de imágenes mica (paso 3.17), observar la ventana de z-piezo cuando se acerca la punta. </li><li> Permitir el escáner a la imagen de la misma zona durante al menos dos pases consecutivos. Haga clic en la captura continua de guardar cada imagen recogida. </li><li> Mueva el escáner a una nueva región y / o cambiar el tamaño de la imagen si lo deseas. </li><li> Después de que el software automatizado ha terminado de ajustar elparámetros de análisis para un tamaño de imagen en particular, a su vez el software de apagado. </li><li> Ajustar manualmente velocidad de barrido, límite de z, el número de líneas, y la tensión con el fin de afinar el enfoque de la imagen. Si la imagen se vuelve demasiado fuera de foco, gire el software de nuevo para devolver la posición de partida original. Para aumentar la resolución de una imagen, mientras que el zoom sobre una proteína, disminuir la velocidad de exploración y aumentar el número de líneas proporcionalmente. </li><li> Después del experimento, limpiar la célula líquida con etanol al 100% y enjuague con DI H 2 O. Deje que el líquido celular que se seque completamente. </li><li> Abra el software de datos para procesar las imágenes de datos en bruto. En primer lugar, aplanar la imagen haciendo clic en el icono de aplanar. Seleccione Zero º orden y haga clic en ejecutar. Dependiendo de la imagen, un plano de ajuste puede ser necesario para obtener una imagen debidamente plana. En este caso, seleccione el icono en forma de avión y dibujar un plano de una superficie plana de la imagen con el cursor. Haga clic en ejecutar. Repita si es necesario </li><li> Select en la ficha de sección transversal para medir las dimensiones de la proteína. Dibujar una línea con el cursor se mueve por encima de la molécula o el área a analizar. Repetir para múltiples áreas y el software va a generar una superposición. Exportar la imagen o los datos utilizados para generar la imagen en un formato compatible con otros programas de software y de dibujo. </li></ol>

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<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , Schrodinger, LLC. Forthcoming.</li>
<li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome%2C+RpBphP3%2C+reveals+residues+that+modulate+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li>
<li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome%3A+photoconversion+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li>
<li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928(2011).</li>
<li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li>
<li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li>
</ol>

No hay intereses financieros contrapuestos ni conflictos de intereses.

AFM es un método de microscopía de sonda de barrido completamente capaz de visualizar las proteínas y otras macromoléculas biológicas en condiciones fisiológicamente pertinentes. En comparación con la cristalografía de rayos X y RMN, una limitación de AFM es su incapacidad para lograr la misma resolución, en particular la resolución lateral. Cuando se utiliza AFM para analizar una molécula en cualquier superficie, el impacto de la superficie y la sonda en la imagen de la molécula también deben ser considerados cuando se...

Microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha convertido en una herramienta muy importante para la investigación de las propiedades estructurales y mecánicas de superficies, películas delgadas, y las moléculas individuales desde su invención en 1986 (Figura 1). 1-3 Uso de una célula líquido, el método tiene llegado a ser particularmente útil en los estudios de macromoléculas biológicas y células incluso que viven en un ambiente fisiológicamente relevante. 4-10 Tapping-mode AFM se ha utilizado tradicionalmente para obtener imágenes de materiales blandos o moléculas unidas débilmente a la superficie, ya que el modo de contacto-AFM es típicamente inadecuado debido a los daños causados ​​por las fuerzas laterales ejercidas sobre la muestra por el voladizo. 11 AFM en modo Tapping reduce sustancialmente estas fuerzas por tener la punta toque la superficie de forma intermitente en lugar de estar en contacto constante. En este modo, el voladizo se hace oscilar en o cerca de su frecuencia de resonancia normal a la superficie. Al igual que en contacto con el modo de AFM, la topografía es analyzed trazando el movimiento de la piezo-z como una función de xy (distancia). La dinámica en voladizo pueden ser bastante inestables a o cerca de resonancia; por lo tanto, son muy difíciles de automatizar fuera de una situación de &quot;estado estacionario&quot;. En concreto, estas dinámicas dependen tanto de las propiedades de la muestra y entorno de digitalización. Para una molécula suave adsorbido a un (a) superficie dura, un bucle de retroalimentación bien afinado para la molécula puede dar lugar a la oscilación de realimentación para la superficie. Operación en el líquido complica aún más la sintonización del voladizo. Los cambios en los niveles de temperatura o de fluidos requieren reajuste constante de punto de ajuste, las ganancias, y otros parámetros de imagen. Estos ajustes suelen llevar mucho tiempo muy difícil y para los usuarios. Pico Quantitative Fuerza nanomecánico Asignación de propiedades (PF-QNM), como tocar el modo de AFM, evita interacciones laterales poniéndose en contacto con la muestra de forma intermitente (Figura 2). 12-15 &lt;/ Sup&gt; Sin embargo, PF-QNM opera en modo no-resonante y frecuencias mucho más bajas que en modo tapping AFM. Esto elimina los problemas de ajuste de modo de contacto intermitente-AFM, en particular los exacerbado por la presencia de fluido. Con PF-QNM, las imágenes se recogieron mediante la adopción de una curva de respuesta de la fuerza en cada punto de contacto. Con la adición de software ScanAsyst, 15 de ajuste de los parámetros de análisis puede ser automatizado y una imagen de alta resolución obtuvo en cuestión de minutos, incluso por usuarios inexpertos. Una vez que el usuario se familiarice con el AFM, cualquiera o todos los parámetros automatizados pueden estar desactivadas en cualquier momento que permite la experimentalista para ajustar la calidad de imagen de forma manual. Desde su creación, PF-QNM se ha aplicado para asignar bacteriorodopsina, una proteína de membrana, y otras proteínas nativas a nivel submolecular. 16-18 Para bacteriorodopsina, hay una correlación directa entre la flexibilidad de proteínas y de rayos X las estructuras cristalográficas. 12 PF -qnM se ha utilizado para investigar las células vivas con alta resolución. 19,20 conexiones importantes Además, los datos PF-QNM ha dilucidado entre la estructura y la mecánica dentro de la membrana de los eritrocitos que son críticas para la integridad y función celular. 21 Hemos empleado de microscopía de sonda de barrido (SPM) métodos, incluyendo AFM 22, 23 para estudiar la estructura de los fotorreceptores de luz roja llamada bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 Se componen de un módulo de detección de luz unido covalentemente a un módulo de señalización efector tales como histidina quinasa (HK). 26 El módulo de detección de luz normalmente contiene un cromóforo bilin que experimenta la transformación estructural tras la absorción de un fotón, con una serie de cambios estructurales que llegan al módulo de señalización efector y que conducen a una transformación global de la proteína entera . 24,27-29 Sobre la base de esta transformación, hay dos absorción de luz distinta sstados de BphPs, una luz que absorbe estado rojo y rojo lejano, denotan como Pr y Pfr. Pr es térmicamente estable estado, adaptada a la oscuridad para la mayoría de BphPs. 28 La base molecular de Pr / Pfr fotoconversión no se entiende por completo debido al conocimiento estructural limitada de estas proteínas. Con la excepción de una estructura de D. radiodurans, 30 todas las estructuras cristalográficas de rayos X publicada de estas proteínas están en el estado adaptado a la oscuridad y carecen de dominio efector. Los BphPs intactos son demasiado grandes para ser estudiado de manera efectiva por resonancia magnética nuclear (RMN) y son notoriamente difíciles de cristalizar en su forma intacta (particularmente en el estado de luz adaptado) para la cristalografía de rayos X. BphPs Recientemente se han diseñado como marcadores de proteínas fluorescentes infrarrojos (de IFP). 31 Caracterización estructural de estas proteínas puede ayudar aún más en el diseño IFP efectiva. 32-36 El foco de este artículo para presentar un procedimiento paraobtención de imágenes de BphPs utilizando AFM de células de líquido a través de PF-QNM. El método se demuestra por los estudios del estado de luz adaptada de la RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) a partir de la bacteria fotosintética R. palustris. El procedimiento que aquí se presenta es AFM enfoque conveniente y sencillo para obtención de imágenes de proteínas, así como otras macromoléculas biológicas. Con este método, los detalles estructurales de moléculas individuales se pueden recoger en un corto período de tiempo, similar a una sesión de laboratorio curso de ciencias de nivel superior. A través de la medición de secciones transversales y completando nuevos análisis dimensionales, los datos experimentales se pueden comparar con los modelos computacionales útiles. 37-42

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4997-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Acros Organics</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Multimodo 8 AFM</td><td>Bruker-Nano</td><td>492-008-011</td><td>equipado con controlador Nanoscope V y escáner J</td></tr><tr><td>Sonda</td><td>Bruker-Nano</td><td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td><td></td></tr><tr><td>Modo de roscado Célula fluida</td><td>Bruker-Nano</td><td>MTFML</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-4 Grado</td><td>SPI suministros</td><td>1150503</td><td>25 x 25 x .26 mm</td></tr><tr><td>Disco de soporte de muestra</td><td>nanoSurf</td><td>BT02236</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Plasta-Medic, Inc.</td><td></td><td>100 mm x 15 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>micropipetas</td><td>Denville Scientific</td><td>XL 3000i</td><td></td></tr><tr><td>RpBphP3</td><td></td><td></td><td>Preparados según las referencias citadas</td></tr><tr><td>Software de nanoscopio</td><td>Bruker-Nano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light</td><td>Digital Instruments Inc.</td><td>F0-50</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de disco Pelco AFM</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1668</td><td>Jeringa de 12 mm</td></tr><tr><td>1 ml</td><td>McKesson</td><td>102-ST1C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf Denville</td><td>Scientific</td><td>C2171</td><td></td></tr><tr><td>El sistema gráfico molecular Pymol v.1.5.0.1</td><td>Schrödinger, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microscopía de fuerza atómica de red-light fotorreceptores a través de cartografía peakforce cuantitativa nanomecánico propiedad

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Microscopía de fuerza atómica (AFM) utiliza una punta piramidal unida a un voladizo para investigar la respuesta de la fuerza de una superficie. Las deflexiones de la punta se pueden medir a ~ 10 pN por un láser y un detector sectorizado, que puede ser convertido a la imagen topografía. La modulación de amplitud o AFM &quot;modo de tocar&quot; implica la sonda de toma de contacto intermitente con la superficie mientras oscilante a su frecuencia resonante para producir una imagen. Utilizado conjuntamente con una célula de fluido, de modo tapping AFM permite la obtención de imágenes de macromoléculas biológicas tales como proteínas en condiciones fisiológicamente pertinentes. -Modo de tocar AFM necesita un ajuste manual de la sonda y ajustes frecuentes de una multitud de parámetros de análisis que puede ser un reto para los usuarios sin experiencia. Para obtener imágenes de alta calidad, estos ajustes son los que más tiempo consume. PeakForce cuantitativa nanomecánico Asignación de propiedades (PF-QNM) produce una imagen mediante la medición de una respon vigorSE curva para cada punto de contacto con la muestra. Con el software ScanAsyst, PF-QNM se puede automatizar. Este software ajusta el punto de ajuste, frecuencia de accionamiento, velocidad de barrido, las ganancias, y otros parámetros importantes de escaneado automáticamente para una muestra dada. No sólo este proceso de proteger ambas sondas frágiles y muestras, se reduce significativamente el tiempo requerido para obtener imágenes de alta resolución. PF-QNM es compatible para el AFM de imágenes en el líquido; por lo tanto, tiene una amplia aplicación para obtener imágenes de materiales biológicamente relevantes. El método presentado en este trabajo se describe la aplicación de PF-QNM para obtener imágenes de una bacteriana fotorreceptor de luz roja, RpBphP3 (P3), a partir de la fotosíntesis R. palustris en su estado de luz adaptado. Usando este método, los dímeros de proteínas individuales de P3 y agregados de dímeros se han observado en una superficie de mica en presencia de un tampón de formación de imágenes. Con los ajustes apropiados a la superficie y / o concentración de la solución, este métodopuede aplicarse en general a otras macromoléculas biológicamente relevantes y materiales blandos.

Imágenes de AFM representativos de una proteína de fotorreceptores, P3, en su estado de luz adaptado se presentan en las Figuras 3 y 4. Un sustrato de mica recién escindido (Figura 3A) es una superficie adecuada, plana para la adsorción de proteínas. El cobro de una imagen de mica limpio como un control negativo es importante por varias razones. En primer lugar, asegura la célula líquido se limpia y sin materiales residuales de los experimentos anteriores se contamine l...

En este artículo se describe un método para investigar la estructura de un fotorreceptor de proteína utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). El mapeo de propiedades nanomecánicas cuantitativas de PeakForce (PF-QNM) revela dímeros de proteínas intactos en una superficie de mica.

Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

El objetivo general de este procedimiento es recopilar imágenes de alta resolución de proteínas fotorreceptoras mediante microscopía de fuerza atómica. Esto se logra obteniendo primero una muestra del fotorreceptor y diluyéndola. El segundo paso es aplicar la muestra de proteína sobre una superficie de mica limpia y recién cortada durante unos 30 segundos.Luego, la MICA se enjuaga con tampón para eliminar las moléculas sueltas y sueltas. A continuación, la muestra se conecta a una celda líquida que está equipada con una sonda adecuada. Este ensamblaje se carga en el escáner.Después de llenar la celda líquida con solución tampón, enganche la punta con la muestra y comience a escanear. En última instancia, la microscopía de fuerza atómica que incorpora la fuerza máxima. El mapeo cuantitativo de propiedades nanomecánicas se utiliza para recopilar imágenes de una sola proteína fotorreceptora en la superficie de la muestra.La microscopía de fuerza atómica que incorpora las fuerzas máximas q y m puede responder a preguntas clave en el campo de la biología molecular, como cuáles son las características estructurales y químicas importantes que determinan la función de las macromoléculas bi

atomic-force-microscopy-red-light-photoreceptors-using-peakforce

Research

Investigación

JoVE Journal

Engineering

Ingeniería

Fuente: Kulkarni, M. et al. Imágenes de la dinámica de Ca2+ en los terminales de los axones fotorreceptores de cono de la retina del ratón. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el uso de la microscopía de dos fotones para monitorear la dinámica del calcio en los fotorreceptores de cono de la retina de un ratón transgénico. Describe los pasos para preparar cortes de retina, obtener imágenes de biosensores de calcio basados en FRET y analizar los cambios de fluorescencia para cuantificar los...

Microscopía de dos fotones para monitorizar la dinámica del calcio en los fotorreceptores de los conos de la retina de los ratones

Describimos una técnica para medir simultáneamente la cinética de unión a un solo receptor regulado por fuerza e imágenes en tiempo real de la señalización de calcio en un solo linfocito T.

Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

Se describen protocolos para cuantificar las interacciones mecánicas entre las células adherentes y los sustratos microestructurados. Estas interacciones están estrechamente relacionadas con comportamientos celulares esenciales, como la migración, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis. Los protocolos presentan un software de análisis de imágenes de código abierto llamado MechProfiler, que permite la determinación de las fuerzas involucradas para cada microposte.

Fácil y Precisa mecanoterapia perfiles en micropost Arrays

Recientemente se han desarrollado varios biosensores de fuerza basados en FRET, que permiten la resolución de la fuerza intracelular específica de la proteína. En este protocolo, demostramos cómo uno de estos sensores, diseñado para el enlazador de la proteína del complejo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, se puede utilizar para medir las fuerzas de actomiosina en el complejo nuclear LINC.

Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC

Se describen los procedimientos y estrategias para medir las propiedades mecánicas y las vías despliegue mecánicas de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica. También mostramos resultados representativos como referencia para la selección y justificación de las grabaciones de molécula única de proteína buena.

Espectroscopia de la fuerza de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica

Aquí, presentamos un protocolo para el uso simultáneo de Förster Resonancia Sensores de tensión basado en la transferencia de energía para medir recuperación de carga y de la fluorescencia de la proteína después de photobleaching para medir la dinámica de la proteína que permite la medida de fuerza-sensible dinámica de proteínas dentro de células vivas.

Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

Aquí se presenta un protocolo integral para realizar experimentos ultrarrápidos de abrazadera de fuerza en motores de miosina-5 procesuales, que podrían extenderse fácilmente al estudio de otras clases de motores de proceso. El protocolo detalla todos los pasos necesarios, desde la configuración del aparato experimental hasta la preparación de muestras, la adquisición de datos y el análisis.

Disección de las propiedades mecanoenzimáticas de miosinas procesivas con espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza

Aquí, presentamos un protocolo para investigar las propiedades mecánicas intracelulares de células embrionarias aisladas de pez cebra en confinamiento tridimensional con medición directa de la fuerza mediante una trampa óptica.

Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Medición directa de las fuerzas dentro de haces de microtúbulos activos reconstituidos

Aquí, describimos una configuración de pinza magnética de alta velocidad que realiza mediciones nanomecánicas en biomoléculas sensibles a la fuerza a la velocidad máxima de 1.2 kHz. Introducimos su aplicación a horquillas de ADN y complejos SNARE como sistemas modelo, pero también será aplicable a otras moléculas involucradas en eventos mecanobiológicos.

Pinzas magnéticas de alta velocidad para mediciones nanomecánicas en elementos sensibles a la fuerza

Aprende a obtener imágenes de alta resolución de fotorreceptores proteicos mediante microscopía de fuerza atómica con mapeo nanomecánico cuantitativo PeakForce. Este método permite visualizar dímeros proteicos intactos en superficie de mica.

Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad (Video) | JoVE Journal

Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad

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