Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad

El objetivo general de este procedimiento es recopilar imágenes de alta resolución de proteínas fotorreceptoras mediante microscopía de fuerza atómica. Esto se logra obteniendo primero una muestra del fotorreceptor y diluyéndola. El segundo paso es aplicar la muestra de proteína sobre una superficie de mica limpia y recién cortada durante unos 30 segundos.

Luego, la MICA se enjuaga con tampón para eliminar las moléculas sueltas y sueltas. A continuación, la muestra se conecta a una celda líquida que está equipada con una sonda adecuada. Este ensamblaje se carga en el escáner.

Después de llenar la celda líquida con solución tampón, enganche la punta con la muestra y comience a escanear. En última instancia, la microscopía de fuerza atómica que incorpora la fuerza máxima. El mapeo cuantitativo de propiedades nanomecánicas se utiliza para recopilar imágenes de una sola proteína fotorreceptora en la superficie de la muestra.

La microscopía de fuerza atómica que incorpora las fuerzas máximas q y m puede responder a preguntas clave en el campo de la biología molecular, como cuáles son las características estructurales y químicas importantes que determinan la función de las macromoléculas biológicamente activas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos actuales, como la RMN y la cristalografía de rayos X, es que se pueden obtener imágenes de alta resolución de proteínas intactas y otras macromoléculas biológicas en un entorno biológicamente relevante. Generalmente, las personas que son nuevas en este método luchan porque el ajuste de la sonda y la solución requiere múltiples pasos, algunos de los cuales son bastante complejos.

Con Peak Force Q y M y el software automatizado, varios de estos pasos se simplifican, lo que hace que el proceso sea mucho más fácil para los nuevos usuarios y los estudiantes de pregrado. Para demostrar este procedimiento estarán tres estudiantes de pregrado de mi laboratorio de investigación, Marie Kroger, Blair Sorenson y Jessica Thomas. Estos estudiantes cursarán estudios de posgrado en los campos de la microbiología, la ingeniería química y la química el próximo año.

Estos elementos deben activarse en un orden específico. Primero, la computadora, luego el controlador y, por último, la luz de fibra óptica. El microscopio debe leer una FM y una FM LF.

La cámara debe estar centrada sobre el cabezal óptico FM del software. Se debe seleccionar lo siguiente. La categoría del experimento es propiedades mecánicas.

El grupo del experimento es el mapeo nanomecánico cuantitativo, y el experimento es la fuerza máxima q y m en el fluido. Con la configuración correctamente seleccionada, el experimento se puede cargar y configurar. El enfoque de la cámara debe establecerse usando el objetivo Z primero, seguido de usar los controles del curso para posicionar el escenario, el objetivo es colocar la apertura de la cabeza A FM un milímetro antes de la superficie del escenario para manipular los discos de muestra con mica recién cortada tienen pinzas de agarre de disco circulares.

Comience ensamblando la celda de fluido a partir de piezas impecablemente limpias. Primero, conecte el adaptador de manguera al puerto de las celdas de fluido limpio. Luego, usando pinzas de cabeza plana muy suavemente, presione la junta tórica en su hendidura en la celda de fluido.

A continuación, en el clip de retención de la sonda, presione ligeramente el resorte y gírelo en dirección opuesta a la ranura. Con las mismas pinzas, sujete la sonda y deslícela en la ranura, de modo que la punta mire hacia el centro de la celda. A continuación, fije la sonda con el clip.

El siguiente paso es comprobar que la abrazadera del FM.It A debe estar completamente retraída. Coloque el conjunto mirando hacia abajo sobre la muestra. Coloque el conjunto en los pernos del A FM para estabilizarlo.

Baje la abrazadera. Para inspeccionar la junta tórica, presione el interruptor hacia abajo en el microscopio hasta que vea la junta tórica. Debe estar firmemente comprimido entre el disco de soporte y la celda de fluido.

La celda de fluido se puede enfocar usando la perilla de ajuste grueso. A continuación, utilizando el ajuste XY, concéntrese en la punta de la sonda. Parece un triángulo dorado metálico.

Ahora, usando la palanca de pizo hacia abajo, acerque la punta a la superficie de la muestra, ajuste el enfoque en las puntas, la reflexión y controle la posición de los voladizos en relación con esta reflexión. En la actualidad, deben estar estrechamente alineados, pero no superponerse completamente. Ahora, prepara la jeringa.

Llénalo con un mililitro de solución tampón y conecta el adaptador. A continuación, conecte la jeringa a la manguera de expulsión y extienda completamente el émbolo. A continuación, conecte la manguera a la celda de fluido usando un adaptador para llenar la cámara, presione suavemente el émbolo hasta que el centro de la cámara esté lleno.

No debe haber burbujas de aire ni derrames de la celda de fluido sobre el microscopio. A continuación, coloque la jeringa en una posición bien apoyada por encima de la cámara. A continuación, utilice los mandos de alimentación de la cámara y de traducción XY.

Para ubicar el láser en la pantalla, debe aparecer como un punto rojo difuso. Una vez localizado, utilice los controles láser para moverlo a la sonda. Ahora, finalmente, ajuste los controles del láser y del espejo hasta que la señal de suma en el microscopio se maximice entre cuatro y seis, ajuste el diodo cuadrante.

A continuación, utilice las perillas del cabezal de escaneo para ajustar las deflexiones verticales y horizontales hasta que los valores del microscopio vuelvan a ser lo más cercanos posible a cero. Asegúrese de seleccionar las opciones de adquisición adecuadas antes de continuar. Establezca la velocidad de escaneo en aproximadamente un hercio en la ventana de muestras por línea.

Escriba 256. Para el control automático de asistencia de escaneo. Seleccione individual para la asistencia de escaneo automático, seleccione el límite Z desactivado.

El límite Z debe ser de 500 nanómetros y el tamaño del escaneo debe ser de una micra. Con los ajustes correctos, mida la sonda. Observe el cambio de voltaje Z pazo a medida que la punta de la sonda se acerca a la superficie.

Si la punta se sale del rango, retírela y vuelva a acercarla, es posible que deba reemplazarse la punta de la sonda. Si esto no funciona, cuando la punta está activada, deberían aparecer líneas en cada una de las ventanas de adquisición, y estas líneas construirán una imagen. Comienza la captura continua de imágenes de la mica.

Acérquese lentamente para asegurarse de que la superficie de MICA esté plana y limpia. Prepare una placa de Petri de cuatro cámaras con solución tampón de imágenes refrigerada. Cada cámara necesita al menos cinco mililitros.

Antes de tomar una alícuota de proteína diluida, remuévala suavemente con la micropipeta. A continuación, se toma una alícuota de 200 microlitros y se aplica la proteína diluida sobre la superficie de la MICA. Espere unos 30 segundos para que la solución resida en la superficie.

A continuación, con las pinzas de disco, levante el disco sin inclinarlo y sumérjalo inmediatamente en la primera piscina de solución tampón. Durante un segundo, asegúrese de que el disco permanezca paralelo al banco. Es muy importante mantener la muestra paralela a la placa de Petri durante el paso de enjuague.

Estas moléculas blandas y flexibles pueden distorsionarse en la superficie por fuertes corrientes de solución acuosa. A continuación, sumerja brevemente el disco en cada una de las otras tres piscinas durante un segundo por piscina. A continuación, transfiera el disco a un paño seco y sin polvo.

Deja que el exceso de humedad se transfiera al paño, pero no dejes que el disco se seque por completo. No permita que el paño toque la muestra Retire con cuidado la muestra del paño con las pinzas de disco y coloque la muestra en el escáner A FM. Coloque la celda de fluido encima de la muestra y proceda con la configuración y la obtención de imágenes.

Después de todos los parámetros de la sonda, el tamaño del resorte y el radio de la punta están configurados correctamente. Mida la sonda como cuando se toman imágenes. Micah, observa el ZP azo a medida que la punta se acerca a la superficie.

Al tomar imágenes, permita que el escáner tome imágenes de la misma área durante al menos dos pasadas consecutivas. Utilice la captura continua para guardar cada imagen. Ajuste el tamaño y la ubicación de la imagen como desee.

Una vez que el software automatizado ha terminado, ajuste los parámetros de escaneo para un tamaño de imagen en particular. Apague el software a bien. Ajuste el enfoque de la imagen, ajuste manualmente la velocidad de escaneo, el límite Z, el número de líneas y el punto de ajuste.

Si la imagen se desenfoca demasiado, vuelva a encender el software para volver a la posición inicial original. Mientras se acerca a una proteína, disminuya la velocidad de escaneo y aumente el número de líneas proporcionalmente para aumentar la resolución de la imagen. Más tarde. Al analizar las imágenes, primero, aplana la imagen haciendo clic en el icono de aplanar.

Seleccione la orden cero y ejecute la operación. A veces es necesario utilizar un ajuste liso para obtener imágenes adecuadamente planas. Seleccione el icono de ajuste simple y utilice el cursor para dibujar un plano sobre un área plana de la imagen.

Ejecute el ajuste liso y repita la operación según sea necesario. A continuación, seleccione la pestaña de la sección transversal para medir las dimensiones de la proteína. Dibuje una línea con el cursor sobre la molécula o área a analizar.

Repita este proceso en varias áreas. Si se desea una superposición, se puede estudiar cualquier número de moléculas biológicas utilizando un FM para una proteína fotorreceptora en su estado adaptado a la luz, un sustrato de micas recién escindido es una superficie plana adecuada para la absorción de proteínas. Los dímeros de proteínas fotorreceptoras individuales se observaron utilizando el modo QNM de fuerza máxima.

Las flechas señalan dímeros individuales y el asterisco denota un agregado de proteínas mediante software de análisis de imágenes. Las secciones transversales de las proteínas se pueden medir después de aplanar la imagen. Los datos XY se correlacionan con las mediciones de altura.

Estos se pueden utilizar para una variedad de cálculos. Después de ver este vídeo, debería ser capaz de configurar un experimento A FM para recopilar imágenes de alta resolución de proteínas en una superficie en un entorno biológicamente relevante. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente tres o cuatro horas.

Por lo tanto, la fuerza máxima q y m es una forma apropiada de microscopía de fuerza atómica para presentar a los estudiantes de pregrado inscritos en cursos de laboratorio como análisis instrumental, bioquímica y física moderna. Después de su desarrollo, este método allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microscopía de sonda de barrido exploraran moléculas biológicas como proteínas, ácidos nucleicos e incluso células vivas en medios biológicamente relevantes.