Name: Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Aprende a obtener imágenes de alta resolución de fotorreceptores proteicos mediante microscopía de fuerza atómica con mapeo nanomecánico cuantitativo PeakForce. Este método permite visualizar dímeros proteicos intactos en superficie de mica.

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El programa de la NSF-MRI (CHE: 1229103) es reconocido por la financiación de la compra de la nueva electrónica de control, software, líquido de las células, y otros equipos necesarios para montar un doble AFM / STM. Reconocemos las instalaciones compartidas en la Universidad de Chicago programa NSF-MRSEC (DMR-0820054) para obtener ayuda con la instrumentación de AFM, la capacitación y formación de imágenes, y de tiempo de instrumentos puestos a disposición por la Red de Investigación Instalaciones Materiales (DMR-0820054). Particularmente Agradecemos al Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, y el Prof. Ka Yee Lee para dar la bienvenida a nuestros estudiantes antes de la financiación de la propuesta de la NSF-MRI que trajo la instrumentación necesaria para nuestro campus. Reconocemos la financiación de una beca Título III STEM (ID: P031C110157) otorgó a la Universidad Northeastern Illinois que proporciona becas de investigación de verano para estudiantes y profesores, así como el apoyo a los consumibles. Por último, reconocemos Bruker-Nano, Inc. para la continuación del apoyo instrumental y permiso para reproduce un gráfico que muestra el mecanismo de PeakForce QNM y usar la palabra ScanAsyst para describir el software automatizado.

1. Informática y Microscopio Set Up <ol><li> Abra la válvula del cilindro N 2 y ajustar las perillas para asegurar la mesa de aire está flotando y el nivel. </li><li> Encienda el ordenador, el controlador y la luz de fibra óptica en este orden. </li><li> Ajuste el escáner al modo / LFM AFM y centrar la cámara en la cabeza AFM. </li><li> Software de código abierto. Seleccione categoría experimento &quot;Propiedades nanomecánicos&quot;, &quot;Quantitative nanomecánico Mapping&quot; en el grupo experimento, y &quot;PeakForce QNM en Fluid&quot; bajo experimento. Haga clic en Experimento de carga y luego Configuración. </li><li> Enfoque la cámara con el objetivo Z para ver la superficie del escenario. Uso de la gruesa arriba / abajo piezos mueven la etapa de aproximadamente 1 mm por debajo de la superficie de la abertura de la cabeza AFM. </li></ol> 2 Preparación de Superficie Mica <ol><li> Presione una etiqueta adhesiva sobre la cara de un disco limpio soporte de la muestra (15 mm de diámetro, 0,8 mm de espesor). Empuje una mica V-4disco de grado (25 x 25 x 26 mm) sobre el adhesivo hasta que quede firmemente unido. </li><li> Frota un trozo de cinta adhesiva transparente sobre la mica asegurar que esté completamente adherido sin burbujas de aire. Tire de la cinta de la mica de un lado para escindir de manera uniforme ella. Repita si es necesario para asegurar la mica es plana. </li><li> Agarre el disco de soporte, lado limpio mica para arriba, con un par de pinzas circulares (pinzas de disco), y coloque en el escáner. La mica debe ser por debajo del nivel de la abertura de la cabeza AFM. </li></ol> Asamblea Cell 3. fluido e Imagen de Mica Surface <ol><li> Enjuague la celda de fluido, junta tórica, adaptador de la jeringa, el adaptador de la manguera y la manguera de expulsión en etanol al 100%. Enjuague la celda de fluido en agua DI. Deje que todo el aire partes seque por completo. </li><li> Empuje el adaptador de la manguera en el puerto de la célula de fluido limpio. Presione suavemente la junta tórica en la muesca centro de la celda de fluido usando pinzas plana encabezados. </li><li> Presione el resorte ligeramente en el clip de retención de la sonda y convertirlo lejos de la del groove por la punta. </li><li> Sujete la sonda en el extremo largo de la punta con unas pinzas de punta plana. Coloque la sonda en la ranura con la punta hacia el centro de la célula. Empuje el resorte en y ajustar el clip de retención sobre la sonda para asegurarlo (Figura 1B). </li><li> Compruebe la pinza en el AFM para asegurarse de que está completamente retraída (Figura 1C). </li><li> Coloque la celda de fluido, la junta tórica y la sonda hacia abajo, en la parte superior de la muestra de mica. Deje que la cámara de fluido para descansar en los pernos de la AFM. Baje la abrazadera para estabilizar la cámara de fluido en el escenario. Pulse el interruptor hacia abajo en el microscopio hasta que una inspección visual muestra la junta tórica firmemente comprimido entre el disco de soporte y la celda de fluido. </li><li> Mientras observa el monitor, enfocar el mando de ajuste grueso para visualizar la parte superior de la celda de fluido en la pantalla. </li><li> Mueva el microscopio hasta que haya una imagen clara de la punta utilizando los botones de ajuste de X / Y y Z el objetivo. La punta se Appoído como una metálica, triángulo de oro. Mueva la punta más cerca de la superficie de la muestra usando la palanca piezo abajo en el microscopio. Se centran en la reflexión de la punta. No pierda de vista el voladizo real en relación a su reflejo. En esta etapa, deben ser estrechamente alineados, pero no completamente superpuesta. </li><li> Conecte el adaptador de la jeringa a una jeringa estéril de 1 ml. Una un extremo de la manguera de inyección para el adaptador de jeringa y coloque el otro extremo de la manguera en el recipiente de solución tampón. Extienda completamente el émbolo de la jeringa. </li><li> Conecte la manguera al adaptador de manguera en la celda de fluido. Presione suavemente el émbolo hasta que el líquido se llena completamente la cámara central. Compruebe la célula para asegurar que no haya burbujas de aire. Compruebe que hay derraman hacia fuera de la célula de fluido en el microscopio no fluido. Coloque la jeringa sobre un soporte sólido levantada. </li><li> Utilice la alimentación de la cámara y las perillas de traducción / Y X para localizar el láser en la pantalla (un punto rojo difuso). Usando el láser movembotones de control de ENT, se mueven el láser en la punta. </li><li> Ajuste con precisión los controles de láser y espejos hasta que la señal suma que aparece en el microscopio se maximiza (valor = 4-6). </li><li> Ajuste el ángulo del diodo cuadrante usando los botones en la parte trasera izquierda y el lado superior izquierdo de la cabeza de exploración para reducir las deflexiones verticales y horizontales que se muestran en el microscopio lo más cerca posible a cero (± 0,1). </li><li> En el software, seleccione opciones de adquisición. Como mínimo, seleccione la altura (traza y retraza), error de fuerza máxima y la deformación. Las otras opciones son dependientes del usuario y se pueden adaptar en base a la información específica deseada por el experimentador. </li><li> Seleccione &quot;línea&quot; para RT Plane Fit en cada ventana de adquisición. Seleccione &quot;ninguno&quot; para el OT Plano Fit en las ventanas de altura. Ajuste el X e Y offset y ángulo de lectura a cero, si no lo ha hecho. </li><li> Ajuste la velocidad de barrido de 1 Hz, la muestra por la línea 256, el control automático ScanAsystal individuo, y el auto Z límite ScanAsyst en off. Cambiar el límite de Z a 500 nm. Ajuste el tamaño de escaneo a 1 micra. </li><li> Haga clic en participar. En este punto, la punta se aproxima a la superficie. Mientras que la punta se acerca, observar el cambio de voltaje piezo Z en la esquina inferior izquierda de la pantalla. Si la punta se sale del rango, retire la punta y re-enfoque. Si esto no funciona, puede necesitar ser cambiado con el fin de tener un enfoque exitoso de la punta. Una vez que la punta está activado, las líneas comenzarán a aparecer en cada una de las ventanas de adquisición que compondrán una imagen. </li><li> Tomar imágenes de mica en 1 x 1 my un zoom lentamente para asegurarse de que la superficie de la mica es limpia y plana. Haga clic en la captura continua para guardar las imágenes tal y como aparecen. Acercar y moverse alrededor de la superficie si lo deseas. </li></ol> 4. Proteína Deposición y Preparación de la muestra de la Imagen <ol><li> Obtener muestra de proteína purificada 38 y mantener en hielo. Si se almacena en un congelador, descongelar la muestra enhielo durante 5 min. </li><li> Diluir la proteína a 0,0010 mg / ml solución buffer de imágenes utilizando refrigerado. El buffer de imágenes se utiliza aquí es 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), NaCl 150 mM, y 15 mM de MgCl 2. </li><li> Llenar una cámara 4 (100 x 15 mm) placa de Petri con solución buffer de imágenes refrigerado. Llenar cada cámara con al menos 5 ml de solución. Mezclar suavemente la solución de proteína se diluye con la punta unida a micropipeta. </li><li> Aplicar 200 l de la solución de proteína diluida a la superficie de la mica ya preparado. Después de 30 segundos, recoger la proteína de superficie / mica con las pinzas circulares (pinzas de disco). Mantenga la muestra paralela a la mesa de laboratorio. </li><li> Mientras sostiene la muestra, sumergir inmediatamente la muestra en la solución tampón contenida en el primer cuadrante de la placa de Petri (paso 4.2) asegurando al mismo tiempo que la muestra es paralela a la cuenca de la placa de Petri. Después de 1 segundo, retirar la muestra. </li><li> Seguir apretando la muestra paralela a la cuencade la placa de Petri, repita el paso 4.5 para los tres cuadrantes restantes. </li><li> Coloque el disco sobre un paño libre de polvo seco, para quitar el exceso de humedad y transferir el disco en la platina del microscopio. No toque la superficie real con el paño. No permita que la muestra se seque. </li><li> Repita los pasos 3.6 a 3.16. </li></ol> 5. Imaging proteínas en Mica <ol><li> Haga clic en la caja de parámetros de la comprobación en el lado izquierdo de la pantalla. Tamaño de Primavera y radio de la punta deben establecerse basa en que se utiliza la punta. </li><li> Haga clic en participar. Al igual que en el proceso de formación de imágenes mica (paso 3.17), observar la ventana de z-piezo cuando se acerca la punta. </li><li> Permitir el escáner a la imagen de la misma zona durante al menos dos pases consecutivos. Haga clic en la captura continua de guardar cada imagen recogida. </li><li> Mueva el escáner a una nueva región y / o cambiar el tamaño de la imagen si lo deseas. </li><li> Después de que el software automatizado ha terminado de ajustar elparámetros de análisis para un tamaño de imagen en particular, a su vez el software de apagado. </li><li> Ajustar manualmente velocidad de barrido, límite de z, el número de líneas, y la tensión con el fin de afinar el enfoque de la imagen. Si la imagen se vuelve demasiado fuera de foco, gire el software de nuevo para devolver la posición de partida original. Para aumentar la resolución de una imagen, mientras que el zoom sobre una proteína, disminuir la velocidad de exploración y aumentar el número de líneas proporcionalmente. </li><li> Después del experimento, limpiar la célula líquida con etanol al 100% y enjuague con DI H 2 O. Deje que el líquido celular que se seque completamente. </li><li> Abra el software de datos para procesar las imágenes de datos en bruto. En primer lugar, aplanar la imagen haciendo clic en el icono de aplanar. Seleccione Zero º orden y haga clic en ejecutar. Dependiendo de la imagen, un plano de ajuste puede ser necesario para obtener una imagen debidamente plana. En este caso, seleccione el icono en forma de avión y dibujar un plano de una superficie plana de la imagen con el cursor. Haga clic en ejecutar. Repita si es necesario </li><li> Select en la ficha de sección transversal para medir las dimensiones de la proteína. Dibujar una línea con el cursor se mueve por encima de la molécula o el área a analizar. Repetir para múltiples áreas y el software va a generar una superposición. Exportar la imagen o los datos utilizados para generar la imagen en un formato compatible con otros programas de software y de dibujo. </li></ol>

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<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , Schrodinger, LLC. Forthcoming.</li>
<li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome%2C+RpBphP3%2C+reveals+residues+that+modulate+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li>
<li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome%3A+photoconversion+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li>
<li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928(2011).</li>
<li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li>
<li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li>
</ol>

No hay intereses financieros contrapuestos ni conflictos de intereses.

AFM es un método de microscopía de sonda de barrido completamente capaz de visualizar las proteínas y otras macromoléculas biológicas en condiciones fisiológicamente pertinentes. En comparación con la cristalografía de rayos X y RMN, una limitación de AFM es su incapacidad para lograr la misma resolución, en particular la resolución lateral. Cuando se utiliza AFM para analizar una molécula en cualquier superficie, el impacto de la superficie y la sonda en la imagen de la molécula también deben ser considerados cuando se...

Microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha convertido en una herramienta muy importante para la investigación de las propiedades estructurales y mecánicas de superficies, películas delgadas, y las moléculas individuales desde su invención en 1986 (Figura 1). 1-3 Uso de una célula líquido, el método tiene llegado a ser particularmente útil en los estudios de macromoléculas biológicas y células incluso que viven en un ambiente fisiológicamente relevante. 4-10 Tapping-mode AFM se ha utilizado tradicionalmente para obtener imágenes de materiales blandos o moléculas unidas débilmente a la superficie, ya que el modo de contacto-AFM es típicamente inadecuado debido a los daños causados ​​por las fuerzas laterales ejercidas sobre la muestra por el voladizo. 11 AFM en modo Tapping reduce sustancialmente estas fuerzas por tener la punta toque la superficie de forma intermitente en lugar de estar en contacto constante. En este modo, el voladizo se hace oscilar en o cerca de su frecuencia de resonancia normal a la superficie. Al igual que en contacto con el modo de AFM, la topografía es analyzed trazando el movimiento de la piezo-z como una función de xy (distancia). La dinámica en voladizo pueden ser bastante inestables a o cerca de resonancia; por lo tanto, son muy difíciles de automatizar fuera de una situación de &quot;estado estacionario&quot;. En concreto, estas dinámicas dependen tanto de las propiedades de la muestra y entorno de digitalización. Para una molécula suave adsorbido a un (a) superficie dura, un bucle de retroalimentación bien afinado para la molécula puede dar lugar a la oscilación de realimentación para la superficie. Operación en el líquido complica aún más la sintonización del voladizo. Los cambios en los niveles de temperatura o de fluidos requieren reajuste constante de punto de ajuste, las ganancias, y otros parámetros de imagen. Estos ajustes suelen llevar mucho tiempo muy difícil y para los usuarios. Pico Quantitative Fuerza nanomecánico Asignación de propiedades (PF-QNM), como tocar el modo de AFM, evita interacciones laterales poniéndose en contacto con la muestra de forma intermitente (Figura 2). 12-15 &lt;/ Sup&gt; Sin embargo, PF-QNM opera en modo no-resonante y frecuencias mucho más bajas que en modo tapping AFM. Esto elimina los problemas de ajuste de modo de contacto intermitente-AFM, en particular los exacerbado por la presencia de fluido. Con PF-QNM, las imágenes se recogieron mediante la adopción de una curva de respuesta de la fuerza en cada punto de contacto. Con la adición de software ScanAsyst, 15 de ajuste de los parámetros de análisis puede ser automatizado y una imagen de alta resolución obtuvo en cuestión de minutos, incluso por usuarios inexpertos. Una vez que el usuario se familiarice con el AFM, cualquiera o todos los parámetros automatizados pueden estar desactivadas en cualquier momento que permite la experimentalista para ajustar la calidad de imagen de forma manual. Desde su creación, PF-QNM se ha aplicado para asignar bacteriorodopsina, una proteína de membrana, y otras proteínas nativas a nivel submolecular. 16-18 Para bacteriorodopsina, hay una correlación directa entre la flexibilidad de proteínas y de rayos X las estructuras cristalográficas. 12 PF -qnM se ha utilizado para investigar las células vivas con alta resolución. 19,20 conexiones importantes Además, los datos PF-QNM ha dilucidado entre la estructura y la mecánica dentro de la membrana de los eritrocitos que son críticas para la integridad y función celular. 21 Hemos empleado de microscopía de sonda de barrido (SPM) métodos, incluyendo AFM 22, 23 para estudiar la estructura de los fotorreceptores de luz roja llamada bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 Se componen de un módulo de detección de luz unido covalentemente a un módulo de señalización efector tales como histidina quinasa (HK). 26 El módulo de detección de luz normalmente contiene un cromóforo bilin que experimenta la transformación estructural tras la absorción de un fotón, con una serie de cambios estructurales que llegan al módulo de señalización efector y que conducen a una transformación global de la proteína entera . 24,27-29 Sobre la base de esta transformación, hay dos absorción de luz distinta sstados de BphPs, una luz que absorbe estado rojo y rojo lejano, denotan como Pr y Pfr. Pr es térmicamente estable estado, adaptada a la oscuridad para la mayoría de BphPs. 28 La base molecular de Pr / Pfr fotoconversión no se entiende por completo debido al conocimiento estructural limitada de estas proteínas. Con la excepción de una estructura de D. radiodurans, 30 todas las estructuras cristalográficas de rayos X publicada de estas proteínas están en el estado adaptado a la oscuridad y carecen de dominio efector. Los BphPs intactos son demasiado grandes para ser estudiado de manera efectiva por resonancia magnética nuclear (RMN) y son notoriamente difíciles de cristalizar en su forma intacta (particularmente en el estado de luz adaptado) para la cristalografía de rayos X. BphPs Recientemente se han diseñado como marcadores de proteínas fluorescentes infrarrojos (de IFP). 31 Caracterización estructural de estas proteínas puede ayudar aún más en el diseño IFP efectiva. 32-36 El foco de este artículo para presentar un procedimiento paraobtención de imágenes de BphPs utilizando AFM de células de líquido a través de PF-QNM. El método se demuestra por los estudios del estado de luz adaptada de la RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) a partir de la bacteria fotosintética R. palustris. El procedimiento que aquí se presenta es AFM enfoque conveniente y sencillo para obtención de imágenes de proteínas, así como otras macromoléculas biológicas. Con este método, los detalles estructurales de moléculas individuales se pueden recoger en un corto período de tiempo, similar a una sesión de laboratorio curso de ciencias de nivel superior. A través de la medición de secciones transversales y completando nuevos análisis dimensionales, los datos experimentales se pueden comparar con los modelos computacionales útiles. 37-42

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4997-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Acros Organics</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Multimodo 8 AFM</td><td>Bruker-Nano</td><td>492-008-011</td><td>equipado con controlador Nanoscope V y escáner J</td></tr><tr><td>Sonda</td><td>Bruker-Nano</td><td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td><td></td></tr><tr><td>Modo de roscado Célula fluida</td><td>Bruker-Nano</td><td>MTFML</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-4 Grado</td><td>SPI suministros</td><td>1150503</td><td>25 x 25 x .26 mm</td></tr><tr><td>Disco de soporte de muestra</td><td>nanoSurf</td><td>BT02236</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Plasta-Medic, Inc.</td><td></td><td>100 mm x 15 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>micropipetas</td><td>Denville Scientific</td><td>XL 3000i</td><td></td></tr><tr><td>RpBphP3</td><td></td><td></td><td>Preparados según las referencias citadas</td></tr><tr><td>Software de nanoscopio</td><td>Bruker-Nano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light</td><td>Digital Instruments Inc.</td><td>F0-50</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de disco Pelco AFM</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1668</td><td>Jeringa de 12 mm</td></tr><tr><td>1 ml</td><td>McKesson</td><td>102-ST1C</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf Denville</td><td>Scientific</td><td>C2171</td><td></td></tr><tr><td>El sistema gráfico molecular Pymol v.1.5.0.1</td><td>Schrödinger, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microscopía de fuerza atómica de red-light fotorreceptores a través de cartografía peakforce cuantitativa nanomecánico propiedad

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Microscopía de fuerza atómica (AFM) utiliza una punta piramidal unida a un voladizo para investigar la respuesta de la fuerza de una superficie. Las deflexiones de la punta se pueden medir a ~ 10 pN por un láser y un detector sectorizado, que puede ser convertido a la imagen topografía. La modulación de amplitud o AFM &quot;modo de tocar&quot; implica la sonda de toma de contacto intermitente con la superficie mientras oscilante a su frecuencia resonante para producir una imagen. Utilizado conjuntamente con una célula de fluido, de modo tapping AFM permite la obtención de imágenes de macromoléculas biológicas tales como proteínas en condiciones fisiológicamente pertinentes. -Modo de tocar AFM necesita un ajuste manual de la sonda y ajustes frecuentes de una multitud de parámetros de análisis que puede ser un reto para los usuarios sin experiencia. Para obtener imágenes de alta calidad, estos ajustes son los que más tiempo consume. PeakForce cuantitativa nanomecánico Asignación de propiedades (PF-QNM) produce una imagen mediante la medición de una respon vigorSE curva para cada punto de contacto con la muestra. Con el software ScanAsyst, PF-QNM se puede automatizar. Este software ajusta el punto de ajuste, frecuencia de accionamiento, velocidad de barrido, las ganancias, y otros parámetros importantes de escaneado automáticamente para una muestra dada. No sólo este proceso de proteger ambas sondas frágiles y muestras, se reduce significativamente el tiempo requerido para obtener imágenes de alta resolución. PF-QNM es compatible para el AFM de imágenes en el líquido; por lo tanto, tiene una amplia aplicación para obtener imágenes de materiales biológicamente relevantes. El método presentado en este trabajo se describe la aplicación de PF-QNM para obtener imágenes de una bacteriana fotorreceptor de luz roja, RpBphP3 (P3), a partir de la fotosíntesis R. palustris en su estado de luz adaptado. Usando este método, los dímeros de proteínas individuales de P3 y agregados de dímeros se han observado en una superficie de mica en presencia de un tampón de formación de imágenes. Con los ajustes apropiados a la superficie y / o concentración de la solución, este métodopuede aplicarse en general a otras macromoléculas biológicamente relevantes y materiales blandos.

Imágenes de AFM representativos de una proteína de fotorreceptores, P3, en su estado de luz adaptado se presentan en las Figuras 3 y 4. Un sustrato de mica recién escindido (Figura 3A) es una superficie adecuada, plana para la adsorción de proteínas. El cobro de una imagen de mica limpio como un control negativo es importante por varias razones. En primer lugar, asegura la célula líquido se limpia y sin materiales residuales de los experimentos anteriores se contamine l...

En este artículo se describe un método para investigar la estructura de un fotorreceptor de proteína utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). El mapeo de propiedades nanomecánicas cuantitativas de PeakForce (PF-QNM) revela dímeros de proteínas intactos en una superficie de mica.

Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

El objetivo general de este procedimiento es recopilar imágenes de alta resolución de proteínas fotorreceptoras mediante microscopía de fuerza atómica. Esto se logra obteniendo primero una muestra del fotorreceptor y diluyéndola. El segundo paso es aplicar la muestra de proteína sobre una superficie de mica limpia y recién cortada durante unos 30 segundos.Luego, la MICA se enjuaga con tampón para eliminar las moléculas sueltas y sueltas. A continuación, la muestra se conecta a una celda líquida que está equipada con una sonda adecuada. Este ensamblaje se carga en el escáner.Después de llenar la celda líquida con solución tampón, enganche la punta con la muestra y comience a escanear. En última instancia, la microscopía de fuerza atómica que incorpora la fuerza máxima. El mapeo cuantitativo de propiedades nanomecánicas se utiliza para recopilar imágenes de una sola proteína fotorreceptora en la superficie de la muestra.La microscopía de fuerza atómica que incorpora las fuerzas máximas q y m puede responder a preguntas clave en el campo de la biología molecular, como cuáles son las características estructurales y químicas importantes que determinan la función de las macromoléculas biológicamente activas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos actuales, como la RMN y la cristalografía de rayos X, es que se pueden obtener imágenes de alta resolución de proteínas intactas y otras macromoléculas biológicas en un entorno biológicamente relevante. Generalmente, las personas que son nuevas en este método luchan porque el ajuste de la sonda y la solución requiere múltiples pasos, algunos de los cuales son bastante complejos.Con Peak Force Q y M y el software automatizado, varios de estos pasos se simplifican, lo que hace que el proceso sea mucho más fácil para los nuevos usuarios y los estudiantes de pregrado. Para demostrar este procedimiento estarán tres estudiantes de pregrado de mi laboratorio de investigación, Marie Kroger, Blair Sorenson y Jessica Thomas. Estos estudiantes cursarán estudios de posgrado en los campos de la microbiología, la ingeniería química y la química el próximo año.Estos elementos deben activarse en un orden específico. Primero, la computadora, luego el controlador y, por último, la luz de fibra óptica. El microscopio debe leer una FM y una FM LF.La cámara debe estar centrada sobre el cabezal óptico FM del software. Se debe seleccionar lo siguiente. La categoría del experimento es propiedades mecánicas.El grupo del experimento es el mapeo nanomecánico cuantitativo, y el experimento es la fuerza máxima q y m en el fluido. Con la configuración correctamente seleccionada, el experimento se puede cargar y configurar. El enfoque de la cámara debe establecerse usando el objetivo Z primero, seguido de usar los controles del curso para posicionar el escenario, el objetivo es colocar la apertura de la cabeza A FM un milímetro antes de la superficie del escenario para manipular los discos de muestra con mica recién cortada tienen pinzas de agarre de disco circulares.Comience ensamblando la celda de fluido a partir de piezas impecablemente limpias. Primero, conecte el adaptador de manguera al puerto de las celdas de fluido limpio. Luego, usando pinzas de cabeza plana muy suavemente, presione la junta tórica en su hendidura en la celda de fluido.A continuación, en el clip de retención de la sonda, presione ligeramente el resorte y gírelo en dirección opuesta a la ranura. Con las mismas pinzas, sujete la sonda y deslícela en la ranura, de modo que la punta mire hacia el centro de la celda. A continuación, fije la sonda con el clip.El siguiente paso es comprobar que la abrazadera del FM.It A debe estar completamente retraída. Coloque el conjunto mirando hacia abajo sobre la muestra. Coloque el conjunto en los pernos del A FM para estabilizarlo.Baje la abrazadera. Para inspeccionar la junta tórica, presione el interruptor hacia abajo en el microscopio hasta que vea la junta tórica. Debe estar firmemente comprimido entre el disco de soporte y la celda de fluido.La celda de fluido se puede enfocar usando la perilla de ajuste grueso. A continuación, utilizando el ajuste XY, concéntrese en la punta de la sonda. Parece un triángulo dorado metálico.Ahora, usando la palanca de pizo hacia abajo, acerque la punta a la superficie de la muestra, ajuste el enfoque en las puntas, la reflexión y controle la posición de los voladizos en relación con esta reflexión. En la actualidad, deben estar estrechamente alineados, pero no superponerse completamente. Ahora, prepara la jeringa.Llénalo con un mililitro de solución tampón y conecta el adaptador. A continuación, conecte la jeringa a la manguera de expulsión y extienda completamente el émbolo. A continuación, conecte la manguera a la celda de fluido usando un adaptador para llenar la cámara, presione suavemente el émbolo hasta que el centro de la cámara esté lleno.No debe haber burbujas de aire ni derrames de la celda de fluido sobre el microscopio. A continuación, coloque la jeringa en una posición bien apoyada por encima de la cámara. A continuación, utilice los mandos de alimentación de la cámara y de traducción XY.Para ubicar el láser en la pantalla, debe aparecer como un punto rojo difuso. Una vez localizado, utilice los controles láser para moverlo a la sonda. Ahora, finalmente, ajuste los controles del láser y del espejo hasta que la señal de suma en el microscopio se maximice entre cuatro y seis, ajuste el diodo cuadrante.A continuación, utilice las perillas del cabezal de escaneo para ajustar las deflexiones verticales y horizontales hasta que los valores del microscopio vuelvan a ser lo más cercanos posible a cero. Asegúrese de seleccionar las opciones de adquisición adecuadas antes de continuar. Establezca la velocidad de escaneo en aproximadamente un hercio en la ventana de muestras por línea.Escriba 256. Para el control automático de asistencia de escaneo. Seleccione individual para la asistencia de escaneo automático, seleccione el límite Z desactivado.El límite Z debe ser de 500 nanómetros y el tamaño del escaneo debe ser de una micra. Con los ajustes correctos, mida la sonda. Observe el cambio de voltaje Z pazo a medida que la punta de la sonda se acerca a la superficie.Si la punta se sale del rango, retírela y vuelva a acercarla, es posible que deba reemplazarse la punta de la sonda. Si esto no funciona, cuando la punta está activada, deberían aparecer líneas en cada una de las ventanas de adquisición, y estas líneas construirán una imagen. Comienza la captura continua de imágenes de la mica.Acérquese lentamente para asegurarse de que la superficie de MICA esté plana y limpia. Prepare una placa de Petri de cuatro cámaras con solución tampón de imágenes refrigerada. Cada cámara necesita al menos cinco mililitros.Antes de tomar una alícuota de proteína diluida, remuévala suavemente con la micropipeta. A continuación, se toma una alícuota de 200 microlitros y se aplica la proteína diluida sobre la superficie de la MICA. Espere unos 30 segundos para que la solución resida en la superficie.A continuación, con las pinzas de disco, levante el disco sin inclinarlo y sumérjalo inmediatamente en la primera piscina de solución tampón. Durante un segundo, asegúrese de que el disco permanezca paralelo al banco. Es muy importante mantener la muestra paralela a la placa de Petri durante el paso de enjuague.Estas moléculas blandas y flexibles pueden distorsionarse en la superficie por fuertes corrientes de solución acuosa. A continuación, sumerja brevemente el disco en cada una de las otras tres piscinas durante un segundo por piscina. A continuación, transfiera el disco a un paño seco y sin polvo.Deja que el exceso de humedad se transfiera al paño, pero no dejes que el disco se seque por completo. No permita que el paño toque la muestra Retire con cuidado la muestra del paño con las pinzas de disco y coloque la muestra en el escáner A FM. Coloque la celda de fluido encima de la muestra y proceda con la configuración y la obtención de imágenes.Después de todos los parámetros de la sonda, el tamaño del resorte y el radio de la punta están configurados correctamente. Mida la sonda como cuando se toman imágenes. Micah, observa el ZP azo a medida que la punta se acerca a la superficie.Al tomar imágenes, permita que el escáner tome imágenes de la misma área durante al menos dos pasadas consecutivas. Utilice la captura continua para guardar cada imagen. Ajuste el tamaño y la ubicación de la imagen como desee.Una vez que el software automatizado ha terminado, ajuste los parámetros de escaneo para un tamaño de imagen en particular. Apague el software a bien. Ajuste el enfoque de la imagen, ajuste manualmente la velocidad de escaneo, el límite Z, el número de líneas y el punto de ajuste.Si la imagen se desenfoca demasiado, vuelva a encender el software para volver a la posición inicial original. Mientras se acerca a una proteína, disminuya la velocidad de escaneo y aumente el número de líneas proporcionalmente para aumentar la resolución de la imagen. Más tarde. Al analizar las imágenes, primero, aplana la imagen haciendo clic en el icono de aplanar.Seleccione la orden cero y ejecute la operación. A veces es necesario utilizar un ajuste liso para obtener imágenes adecuadamente planas. Seleccione el icono de ajuste simple y utilice el cursor para dibujar un plano sobre un área plana de la imagen.Ejecute el ajuste liso y repita la operación según sea necesario. A continuación, seleccione la pestaña de la sección transversal para medir las dimensiones de la proteína. Dibuje una línea con el cursor sobre la molécula o área a analizar.Repita este proceso en varias áreas. Si se desea una superposición, se puede estudiar cualquier número de moléculas biológicas utilizando un FM para una proteína fotorreceptora en su estado adaptado a la luz, un sustrato de micas recién escindido es una superficie plana adecuada para la absorción de proteínas. Los dímeros de proteínas fotorreceptoras individuales se observaron utilizando el modo QNM de fuerza máxima.Las flechas señalan dímeros individuales y el asterisco denota un agregado de proteínas mediante software de análisis de imágenes. Las secciones transversales de las proteínas se pueden medir después de aplanar la imagen. Los datos XY se correlacionan con las mediciones de altura.Estos se pueden utilizar para una variedad de cálculos. Después de ver este vídeo, debería ser capaz de configurar un experimento A FM para recopilar imágenes de alta resolución de proteínas en una superficie en un entorno biológicamente relevante. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente tres o cuatro horas.Por lo tanto, la fuerza máxima q y m es una forma apropiada de microscopía de fuerza atómica para presentar a los estudiantes de pregrado inscritos en cursos de laboratorio como análisis instrumental, bioquímica y física moderna. Después de su desarrollo, este método allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microscopía de sonda de barrido exploraran moléculas biológicas como proteínas, ácidos nucleicos e incluso células vivas en medios biológicamente relevantes.

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Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

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Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Medición directa de las fuerzas dentro de haces de microtúbulos activos reconstituidos

La cuantificación del área de contacto y la fuerza aplicada por la punta de una sonda de microscopio de fuerza atómica (AFM) a una superficie de muestra permite la determinación de propiedades mecánicas a nanoescala. Se discuten las mejores prácticas para implementar la nanoindentación basada en voladizo AFM en aire o fluido en muestras blandas y duras para medir el módulo elástico u otras propiedades nanomecánicas.

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

Aquí, describimos una configuración de pinza magnética de alta velocidad que realiza mediciones nanomecánicas en biomoléculas sensibles a la fuerza a la velocidad máxima de 1.2 kHz. Introducimos su aplicación a horquillas de ADN y complejos SNARE como sistemas modelo, pero también será aplicable a otras moléculas involucradas en eventos mecanobiológicos.

Pinzas magnéticas de alta velocidad para mediciones nanomecánicas en elementos sensibles a la fuerza

Aprende a obtener imágenes de alta resolución de fotorreceptores proteicos mediante microscopía de fuerza atómica con mapeo nanomecánico cuantitativo PeakForce. Este método permite visualizar dímeros proteicos intactos en superficie de mica.

Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad (Video) | JoVE Journal

Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad

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