Name: Medición inducida glutatión-Alimentación Respuesta en Hydra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende a medir la respuesta alimentaria inducida por glutatión en Hydra mediante el análisis de la distancia entre tentáculos y boca. Este método cuantitativo permite estudiar la quimiosensación en organismos marinos simples.

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Los autores están agradecidos a K. P. Madhu, Nita Beliappa y al personal del Centro de Medios del Instituto Indio de Educación e Investigación Científica, Pune, por su ayuda en la producción del video. El trabajo contó con el apoyo financiero del programa del Centro de Excelencia del Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India para SG y una beca postdoctoral del Departamento de Ciencia y Tecnología del Gobierno de la India para RK.

1. Hydra Cultura y medición de la respuesta de alimentación <ol><li> Mantener pólipos Hydra en cultivo mediante la alimentación diariamente con artemia y mantenerlos en un medio (mM de tampón Tris-HCl 1, pH 7,6, NaCl 1 mM, 1 mM CaCl 2, 0,1 mM KCl, y 0,1 mM MgSO 4) contenida en una tazón de vidrio a 18 ° C por debajo de 12 hr hr luz-12 ciclos oscuros como se describe anteriormente 12. </li><li> Para la medición de la respuesta de alimentación, transferir uno maduro pólipo hidra que tiene de 5 a 6 tentáculos a un solo pocillo de una placa de 24 pocillos. Retire el medio residual del bien por la inclinación, y luego añadir inmediatamente 500 l de medio fresco. </li><li> Prepare la solución de glutatión 9 M en medio hidra. Dado que la solución de glutatión es propenso a la oxidación, siempre utilizar la solución de glutatión recién preparado para cada experimento. </li><li> Transferencia de la placa a la plataforma de imágenes de un microscopio que tiene disposiciones para la grabación de imágenes. Utilice un fondo oscuro de manera que el comportamiento of pólipo hidra puede ser claramente fotografiado contra el fondo de contraste. </li><li> La sala utilizada para observar y obtener imágenes del comportamiento de hidra libre de las luces de intensidades fluctuantes, las corrientes de aire y el ruido. Tales perturbaciones también podrían causar el pólipo hidra para mostrar la contracción de los tentáculos - incluso en ausencia de glutatión. </li><li> Deje que el pólipo se relaje durante 5 min. </li><li> Asegúrese de que el pólipo se encuentra a lo largo de la región central del pozo de manera que el comportamiento se pueden obtener imágenes con claridad. Si el pólipo está en el borde del pozo, llevarlo al centro de lavado del medio utilizando una pipeta y otra vez permitir que se relaje. </li><li> Captura de una imagen de la hidra en el estado relajado. Este será el punto de observación en tiempo cero. </li><li> Añadir rápidamente 9 M solución de glutatión para llegar a una concentración final de 3 mM en el pozo. Dependiendo de la finalidad del experimento y la respuesta mostrada por hydra, ensayar una serie de diferentes concentraciones de glutatión y ChooSE La concentración apropiada requerida. </li><li> Inicie el temporizador inmediatamente después de añadir la solución de glutatión y capturar imágenes después de cada 15-30 segundos durante 4-5 min. No cambie la configuración de ampliación durante el time-lapse. </li><li> Añadir la solución de glutatión suavemente y con flujo uniforme de tal manera que la posición del animal en el pozo se vería perturbado mínimamente en el campo de visión del microscopio. Sin embargo, si el pólipo se mueve ampliamente después de la adición de solución de glutatión, mover muy suavemente la placa para llevar el pólipo en el campo de visión para la captura de imagen. </li><li> En el experimento de control, utilice medio que carece de glutatión, manteniendo todos los demás parámetros idénticos. </li><li> Asegúrese de realizar todos los pasos experimentales anteriores durante la primera mitad del día - antes de 13:00 para evitar el posible efecto del ritmo circadiano de la magnitud de respuesta de alimentación. </li><li> Abra cada una de las imágenes capturadas utilizando el GNU Image Manipulation Program (GIMP). Utilice la herramienta de "Medida" disponible en Menú&gt; Herramientas&gt; Medir para determinar la distancia entre el extremo apical de cada uno de los tentáculos y hipostoma. Si se observa la abertura de boca en cualquiera de las imágenes, determinar la distancia entre el centro de la boca abierta y el extremo apical de la tentáculo. Consulte esta distancia como la propagación tentáculo. </li><li> Calcular el diferencial medio tentáculo para cada pólipo antes y después de la exposición glutatión. Calcular la relación de promedio propagación tentáculo en el punto de tiempo cero para que en cada uno de los puntos de tiempo posteriores. Esta relación se denomina propagación tentáculo relativa. </li><li> Repetir las mediciones para al menos 20 pólipos. </li></ol><img alt="Ecuación 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq1.jpg" width="400"> <img alt="Ecuación 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq2.jpg" width="450"> 2. Método de validación mediante elEl hambre Modelo <ol><li> Para el hambre, transferir unos pólipos hidra a un recipiente de vidrio separada y no darles de comer durante 5 días. Pase el grupo de control de unos pólipos diario con artemia en un recipiente de tamaño similar. Cambie el medio de copas de ambos experimental diaria para evitar el crecimiento de hongos en el medio. </li><li> En el día del experimento, alimentar al grupo de control de hidra con artemia durante 1 hora y utilizar estos hidra para los experimentos posteriores después de la eliminación de todos artemia sin comer y muertos desde el medio. </li><li> Medir la respuesta de alimentación de la hidra de hambre en comparación con la hidra de grupo de control por el método descrito anteriormente en el paso 1. Para evitar cualquier sesgo debido a momento de la observación, alternar las mediciones de cada uno de los hambrientos y controlar pólipos hidra. </li></ol>

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<li>Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+activity+in+hydra+is+modulated+by+glycine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).</li>
<li>Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+automated+movement+detection+for+the+analysis+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Computer automated movement detection for the analysis of behavior.</a> J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La alimentación en el comportamiento hidra representa uno de los sistemas quimiosensoriales más ancestrales en los metazoos. Aunque la presencia de GSH en el fluido crustáceo en libertad después de la captura de presas nematocisto asistida se detectó hace mucho tiempo 1, ni la proteína GSHR ni los genes de codificación putativo / s se han caracterizado desde hidra hasta la fecha. Pocos intentos se han realizado para caracterizar las proteínas de unión GSH en Hydra 8, 14, 15. Sin embargo, la identid...

Hydra es el organismo más primitivo que posee un sistema nervioso y quimiosensación para detectar glutatión reducido (GSH) para capturar a la presa1. Se alimenta de una variedad de animales como nematodos, crustáceos, larvas de insectos, renacuajosy peces recién nacidos. El movimiento de estos organismos presa provoca la descarga mecanosensorial de las cápsulas urticantes llamadas nematocistos de la hidra, que se insertan en la presa2. El GSH presente en el líquido liberado por la presa herida activa posteriormente la respuesta de alimentación en la hidra, que incluye el enroscamiento de los tentáculos para acercar a la presa a la boca, la apertura de la boca y el consiguiente engullimiento de la presa. Se ha demostrado que múltiples moléculas, como la dopamina3, el glutamato4, el GABA, la glicina5, los receptores NMDA6 y la alatotropina7, están involucradas en la respuesta alimentaria de la hidra. También se ha demostrado que la respuesta quimiosensorial inducida por el GSH está modulada por el estado de alimentación del animal, de modo que la hidra hambrienta exhibió una respuesta alimentaria mejorada1. Este aumento en la sensibilidad al GSH es biológicamente relevante, ya que bajo inanición, la hidra necesita encontrar a su presa con una sensibilidad más alta. 
Aunque la respuesta alimentaria inducida por GSH se puede observar claramente bajo el microscopio, los métodos típicamente utilizados para medir las observaciones de la respuesta alimentaria no son cuantitativos. En la mayoría de los casos, el tiempo durante el cual la boca de la hidra permanece abierta se tomó como medida de la respuesta alimenticia8,9; mientras que en otro caso, la cuantificación se basó en el número de hidras de una población que mostraban la respuesta alimentaria10. Sin embargo, observar el tiempo de apertura de la boca de los pólipos de hidra es engorroso y está sujeto a variaciones inducidas por parámetros incontrolables como la dirección de la orientación de la boca durante las observaciones. Del mismo modo, dado que la respuesta alimentaria es un parámetro cuantitativo, los enfoques basados en la población están sujetos a variaciones/errores causados por la opinión o el sesgo observacional del observador individual. Para evitar estos problemas, hemos desarrollado un método para la cuantificación relativa de la respuesta alimentaria en hidra (Hydra vulgaris Ind-Pune11) basado en la distancia del extremo apical del tentáculo desde la boca del pólipo de hidra.

<table><tbody><tr><td>Incubadora refrigerada</td><td>Panasonic&nbsp;</td><td>Microscopio MIR-254-PE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>S8AP0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cámara para el microscopio</td><td>Leica&nbsp;</td><td>EC3</td><td></td></tr><tr><td>Glutatión reducido</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td>Almacenado a 4 °C. Lleve la botella a temperatura ambiente antes de abrirla para evitar la oxidación</td></tr><tr><td>Programa de edición de imágenes</td><td>GIMP</td><td>Versión 2.8</td><td></td></tr></tbody></table>

medición inducida glutatión-alimentación respuesta en hydra

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra es uno de los organismos más primitivos que posee un sistema nervioso y quimiosensación para detectar glutatión reducido (GSH) para capturar a la presa. El movimiento de los organismos presa provoca la descarga mecanosensorial de las células urticantes llamadas nematocistos de la hidra, que se insertan en la presa. La respuesta alimentaria en la hidra, que incluye el enroscamiento de los tentáculos para llevar a la presa hacia la boca, la apertura de la boca y el consiguiente engullimiento de la presa, se desencadena por el GSH presente en el líquido liberado por la presa herida. Para poder identificar el mecanismo molecular de la respuesta alimentaria en hidra, que se desconoce hasta la fecha, es necesario establecer un ensayo para medir la respuesta alimentaria. Aquí, describimos un método simple para la cuantificación de la respuesta de alimentación en el que se mide la distancia entre el extremo apical del tentáculo y la boca de la hidra y se determina la relación de dicha distancia antes y después de la adición de GSH. Se encontró que la proporción, llamada dispersión relativa de los tentáculos, proporciona una medida de la respuesta a la alimentación. Este ensayo se validó utilizando un modelo de inanición en el que la hidra hambrienta muestra una mejor respuesta alimentaria en comparación con la hidra alimentada diariamente.

El glutatión provoca hydra exponer rizado de los tentáculos hacia la boca con el propósito de que envuelve la presa. Tal rizado de tentáculos trae extremos apicales de los tentáculos más cerca de la hipostoma. Esto resulta en la reducción de la propagación tentáculo, o la distancia lineal entre el extremo apical del tentáculo y hipostoma (Figura 1). La propagación tentáculo relativa, o la relación de tentáculo promedio propagan antes y después de la adición de glutatión, promediados a través de múltiple...

Aquí describimos un ensayo simple para la cuantificación de la respuesta alimentaria en hidra inducida por la forma reducida de glutatión. Este ensayo se basa en medir la distancia entre el extremo apical del tentáculo y la boca de la hidra.

Medición inducida glutatión-Alimentación Respuesta en Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

En este video, describimos un método para medir el comportamiento de alimentación en Hydra. En respuesta a la forma reducida de glutatión, Hydra se alimenta de una variedad de animales, nematodos, crustas y peces recién eclosionados. En la capa exterior de este animal de dos capas de células, hay células especializadas llamadas nematocistos.Los nematocistos tienen desencadenantes, que cuando se activan por el movimiento de la presa en el fluido circundante provocan la descarga de los hilos de encordado. Los hilos urticantes se insertan en la presa. La presa herida libera glucosa en exceso.Ion hydro tiene una sensación de quimioterapia para detectar el glutatión en el líquido circundante. Esto desencadena un comportamiento de alimentación que involucra a su sistema nervioso. El comportamiento de alimentación en Hydra incluye el enroscamiento de los tentáculos para llevar a la presa hacia un hiperscopio, la apertura de la boca y la engullimiento.De hecho, la adición de iones excesivos a los alrededores provoca la reacción de alimentación en la hidra, incluso en ausencia de presas. Para comprender la interacción de la sensación de quimioterapia y el sistema nervioso, necesitamos cuantificar el comportamiento y crear medidas precisas y confiables. En algunos informes anteriores, el tiempo durante el cual la boca permanece abierta se toma como una medida de la respuesta alimentaria, pero observar la duración de la apertura de la boca en los pólipos hidro es tedioso y está sujeto a variaciones inducidas por parámetros incontrolables como la orientación de la boca debido a las observaciones.Otro método de cuantificación del comportamiento se basa en el número de hidras en una población que muestran la respuesta alimentaria. Sin embargo, dado que la respuesta a la alimentación es un parámetro cuantitativo individual, los enfoques basados en la población son variaciones subjetivas causadas por la opinión del observador individual. Las principales ventajas del método alternativo que describimos aquí es que es muy fácil de ejecutar y altamente reproducible.Mantenga la hidra a 18 grados centígrados bajo 12 horas de luz. Ciclos de oscuridad de 12 horas en un medio contenga en un recipiente de vidrio y aliméntelos diariamente con emia para medir la respuesta de alimentación. Transfiera un pólipo hidropónico maduro a un pozo de una placa de 24 pocillos, elimine el medio residual del pozo usando un pivote.Esto se facilita inclinando el plato, desechando el exceso de medio y luego agregando inmediatamente 500 microlitros de medio fresco Preparación de solución de glutatión. Se prepara una solución de nueve micromolares de glutatión utilizando medio hidro. Recuerde, la solución de glutatión es propensa a la oxidación, así que siempre use una solución de glutatión recién preparada.Para cada experimento, transfiera la placa a la plataforma de imágenes de un microscopio. Al tener provisión para la grabación de imágenes, use un fondo oscuro de modo que el comportamiento del hidropólipo se pueda visualizar claramente contra el fondo contrastante. Asegúrese de que el pólipo esté ubicado a lo largo de la parte central del pozo, capturó una imagen de hidra en estado relajado.Esta será una observación de punto de tiempo cero. Agregue rápidamente una solución de glutatión de nueve micromolares para alcanzar una concentración final de tres micromolares en el pozo. Inicie el temporizador inmediatamente después de agregar la solución de glutatión y capture imágenes cada 15 o 30 segundos durante cuatro o cinco minutos sin cambiar la configuración de aumento.Para las mediciones, usamos la versión dos de gim, gim. Un programa de manipulación de imágenes GNU es un software que se puede descargar gratuitamente de Internet. Abra cada una de las imágenes capturadas en gim.Este programa tiene una herramienta de medición disponible en el menú de herramientas. Medir la distancia entre hipers, estoma, extremo apical de cada uno de los tentáculos se puede medir con esta herramienta. Esta distancia se denomina dispersión de tentáculos.Calcule la dispersión promedio de los tentáculos para cada pólipo antes y después del glutatión. Calcule la relación entre la dispersión media de los tentáculos en el tiempo cero. Señale eso en cada uno de los puntos de tiempo subsiguientes.Llamemos a esto dispersión relativa de tentáculos. Realice tales mediciones para al menos 20 pólipos para la inanición. Transfiera algunos hidropólipos a un recipiente de vidrio separado y no los alimente durante cinco días.Alimente los pólipos de control diariamente con artia el día del experimento. Alimente el grupo de control de Hydra con artia durante una R y use estas hidras para los experimentos posteriores. Mida la respuesta alimentaria de la hidra hambrienta en comparación con la hidra del grupo de control mediante el método descrito anteriormente en este video para evitar cualquier sesgo debido al tiempo de alternancia, las mediciones de cada uno de los hidropólipos hambrientos y controlados.El glutatión hace que la hidra exhiba un enroscamiento de los tentáculos hacia la boca. Este enroscamiento hace que los extremos apicales de los tentáculos se acerquen a la hipotormenta. Esto da como resultado la reducción de la distancia lineal entre los extremos apicales del tentáculo y la hipertormenta o propagación del tentáculo.El tentáculo relativo se extendió después de agregar medio. La falta de glutatión reduce solo transitoriamente. Se recupera a uno en aproximadamente un minuto.Se sabe que la inanición causa una mejora del comportamiento alimentario inducido por el glutatión. La extensión de los tentáculos un minuto después de agregar glutatión fue significativamente menor para el grupo de personal en comparación con el grupo saciado. Todos los animales utilizan la sensación de quimioterapia para detectar alimentos.Hydra utiliza una señal química en forma de glutatión liberado por la presa herida, tiene un sistema nervioso simple sin ninguna estructura similar al cerebro, por lo que es probable que el mecanismo molecular de la sensación de quimioterapia y su modulación dependiente del estado de alimentación también sea simple. La comprensión de este mecanismo puede arrojar luz sobre la evolución de una regulación de la alimentación en los animales superiores. Sin embargo, hasta la fecha, ni el receptor que puede unirse al glutatión ni ningún otro componente de la cascada de señalización aguas abajo se han reportado en Haida.Los inhibidores farmacológicos de las vías de señalización sensorial comunes de chemos y el uso de técnicas biológicas moleculares avanzadas para alterar la expresión de dichas proteínas de señalización y el receptor de glutatión pueden resultar ser herramientas poderosas para comprender el mecanismo molecular de la alimentación. En Hydra, sin embargo, se necesita una medida confiable del comportamiento alimentario alterado para comprender el alcance de cualquier modificación causada por tales investigaciones experimentales. Aquí hemos presentado un método que no solo es confiable, sino también fácil de realizar y es altamente reproducible.

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Biología

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La cuantificación de las formas oxidadas y reducidas de glutatión (GSSG y GSH, respectivamente) se ha logrado mediante el uso de ortoftalaldehído (OPA). El OPA se vuelve altamente fluorescente una vez que se conjuga con GSH, pero no puede conjugar el GSSG hasta que se reduce. Aquí, describimos un ensayo multiparamétrico para cuantificar ambos utilizando la cuantificación de proteínas para la normalización.

Cuantificación rápida de formas oxidadas y reducidas de glutatión utilizando orto-ftalaldehído en células de mamífero cultivadas in vitro

Este protocolo describe un ensayo para cuantificar la tasa de alimentación de Caenorhabditis elegans basado en la medición del aclaramiento de bacterias en cultivo líquido.

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Mediante imágenes en lapso de tiempo, se puede seguir el proceso completo de regeneración de los esferoides de Hydra . Este protocolo describe la generación de esferoides Hydra , analiza una variedad de estrategias de montaje y detalla cómo realizar imágenes en vivo a largo plazo utilizando microscopía confocal de disco giratorio así como microscopía de fluorescencia de lámina de luz.

Preparación e imagen en vivo de esferoides hidra en regeneración

Aprende a medir la respuesta alimentaria inducida por glutatión en Hydra mediante el análisis de la distancia entre tentáculos y boca. Este método cuantitativo permite estudiar la quimiosensación en organismos marinos simples.

Medición inducida glutatión-Alimentación Respuesta en Hydra

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