Name: Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para In Vitro Ensayos de mielinización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprende a producir lentivirus para transducir selectivamente células precursoras de oligodendrocitos y estudiar la mielinización in vitro mediante sobreexpresión de proteínas. Este método permite analizar la función de proteínas específicas en la mielinización del sistema nervioso central.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia (beca NHMRC #454330 para JX, subvención de proyecto #628761 para SM y APP1058647 para JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 para JX), el Programa de Apoyo a Becas de Investigación de la Universidad de Melbourne y la Beca de Investigación CI de Melbourne para JX, así como Becas de Posgrado de Australia para HP y AF. Nos gustaría reconocer el Plan de Infraestructura Operativa de la Departamento de Innovación, Industria y Desarrollo Regional, Victoria, Australia.

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Los autores declaran que no existe conflicto de intereses con respecto a esta investigación.

La mielinización de los axones es un proceso crucial para la función óptima de los sistemas nerviosos central y periférico de vertebrados. La generación y el mantenimiento de los axones mielinizados es un proceso complejo y coordinado de las interacciones moleculares entre neuronal, glial (a partir de células de Schwann o oligodendrocitos) y proteínas de la matriz extracelular. La importancia y la aplicabilidad de este protocolo es que permite la manipulación de las proteínas en un tipo celular específico dentro de la c...

La mielinización de los axones es crucial para la transmisión rápida y eficaz de los potenciales de acción en los sistemas nerviosos central y periférico. Las células especializadas, las células de Schwann en el sistema nervioso periférico y los oligodendrocitos en el sistema nervioso central, y se envuelven alrededor de los axones en ensheathe mielina, aislantes efectivamente el nervio y que facilitan la conducción saltatoria 1. El proceso de mielinización puede ser estudiada in vitro usando las neuronas ganglionares de la retina 2, nanofibras de ingeniería 3, o neuronas ganglionares de la raíz dorsal co-cultivadas con células de Schwann o 4 oligodendrocitos 5-7. El ensayo de mielinización in vitro es un modelo establecido para el estudio de la mielinización del sistema nervioso y se replica muchos de los procesos fundamentales que ocurren durante la mielinización in vivo 5-8. El ensayo consiste en la co-cultivo de las poblaciones purificadas de Ganglio de raíz dorsal (GRD) neuronas, con los OPC (para CNS mielinización) o células de Schwann (por PNS mielinización). En condiciones específicas de estas células mielinizantes ensheathe axones DRG en la ordenada y ultra verificado estructuralmente, hoja multi-lamelar de aislante membrana plasmática que expresan el mismo complemento de proteínas específicas de mielina presentes in vivo. El modelo de célula más comúnmente utilizado de estudiar la mielinización del SNC in vitro es el co-cultivos de neuronas DRG y OPC, que han sido utilizados con éxito para estudiar el efecto que los factores exógenos tales como las neurotrofinas ejercen sobre la mielinización del SNC in vitro 5,6. Los factores exógenos tales como factores de crecimiento o inhibidores farmacológicos de moléculas pequeñas se han utilizado ampliamente para estudiar el papel de vías de señalización en la mielinización utilizando el DRG-OPC modelo de cocultivo 7,9. Sin embargo, en la configuración de co-cultivo mixto que contienen tanto las neuronas y oligodendrocitos, se mantuvo formalmente posible que cualquiera de los factores de crecimiento o la pharinhibidores macológico podrían haber ejercido efectos en tanto las neuronas y oligodendrocitos (OL) DRG. Este sí ofrece la capacidad de diseccionar específicamente las funciones que las proteínas expresadas únicamente por GRD o oligodendroglia ejerce sobre la mielinización utilizando este sistema celular dual. Para confirmar inequívocamente que la vía de señalización en oligodendroglial regula directamente la mielinización, la transducción lentiviral de OPC, antes de sembrar en las neuronas DRG para el ensayo de mielinización in vitro, ha demostrado ser una manera elegante de sobreexpresan tanto de tipo salvaje y las proteínas mutantes, así como expresión desmontables de proteínas constitutivamente expresadas por los oligodendrocitos. Así, este enfoque ofrece una vía para interrogar y manipular las vías de señalización dentro de los oligodendrocitos para el estudio de la mielinización 9,10 específicamente. En este artículo analizamos los métodos que hemos desarrollado para sobreexpresan una proteína de interés de forma selectiva en los oligodendrocitos a través de un lentiviralenfoque para el estudio de la mielinización in vitro. La técnica comienza con la generación de vectores de expresión que contienen el gen de interés, ya sea en un tipo salvaje, forma negativa constitutivamente activa o dominante que luego se clonó posteriormente en el vector pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Este vector (que contiene el gen de interés), el donante promotor CMV (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) y el lentivector 2K7 se combinan en una reacción enzimática para producir un vector que contiene el promotor CMV 2K7, el gen de interés, una sitio interno de entrada ribosomal y las buenas prácticas agrarias (Figura 1). Este constructo clonado 2K7 puerta de enlace combinada con la envoltura del virus PMD2.G y el paquete de virus pBR8.91 se puede co-transfectadas en células HEK293T para generar lentivirus que posteriormente se puede usar para transducir OPC. Una vez infectado con el lentivirus los OPCs expresan un alto nivel de la proteína de interés. Estos OPC pueden ser sembradas en cultivos de neuronas DRG y el efecto que la expresiónde altos niveles de la proteína deseada ejerce sobre la mielinización puede ser interrogado. Los co-cultivos se evaluaron para la expresión de proteínas de mielina por análisis de transferencia Western y se visualizaron para la formación de segmentos axonales mielinizadas por inmunocitoquímica.

<table><tbody><tr><td>2K7 lentivector&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Amable regalo del Dr. Suter9</td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 IgG anti-ratón de cabra Jackson</td><td>Immunoresearch</td><td>115545205</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón IgG (H+L)</td><td>Life Tecnologías</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 - NeuroCul SM1 Suplemento Neuronal</td><td>Tecnologías de Células Madre&nbsp;</td><td>5711</td><td></td></tr><tr><td>BDNF (Humano)</td><td>Peprotech</td><td>PT450021000</td><td></td></tr><tr><td>Biotina (d-Biotina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Bradford</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916-500ML&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-100G</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-13020</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje de fluoresencia DAKO</td><td>DAKO</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato, sin glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DNasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-375KU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, calcio, magnesio</td><td>Life Technologies</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>Vectores de entrada para el promotor y el gen de interés</td><td></td><td></td><td>Generar según los protocolos 1-2</td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa (D-glucosa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Chem Supply</td><td>GL010-500M</td><td>Ver soluciones en stock</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Ratón IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005003</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Ratón IgM&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005020</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-rata de</td><td>cabra Jackson ImmunoResearch</td><td>112005167</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Laminina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td></td><td></td><td>Ver soluciones en stock</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td></td><td></td><td>Ver soluciones en stock</td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7477</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium Life Technologies de Leibovitz</td><td></td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina- 200 mM (100x) líquida</td><td>Life Technologies 25030081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LR Clonasa II Plus enzima</td><td>Life Technologies</td><td>12538-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM, NEAA, sin Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>10370088</td><td></td></tr><tr><td>Ratón y alfa; y beta; III Tubulina&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>Ratón y alfa; MBP (monoclonal)</td><td>Millipore</td><td>MAB381</td><td></td></tr><tr><td>Na piruvato&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF (ratón)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td></td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>; 450-03</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo O1 - Ratón anti-O1</td><td>Millipore</td><td>MAB344</td><td>Alternativa si las células de hibridoma O1 no están disponibles</td></tr><tr>Células <td></td><td></td> de<td>hibridoma O1</td><td>Medio condicionado que contiene anticuerpo anti-O1 que se utilizará para la inmunopanificación</td></tr><tr><td>Anticuerpo O4 - Ratón anti-O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>Alternativa si las células de hibridoma O4 no están disponibles</td></tr><tr><td>Células</td><td></td> <td>de hibridoma O4</td><td>Medio condicionado que contiene anticuerpos anti-O4 que se utilizará para la inmunopanificación</td></tr><tr><td>Células competentes</td><td>Life Technologies</td><td>A10460</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl células competentes</td><td>Life Technologies</td><td>C7373-03</td><td></td></tr><tr><td>Suspensión de papaína</td><td>Worthington/Cooper</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>pBR8.91</td><td></td><td></td><td>Amable regalo del Dr. Denham10</td></tr><tr><td>PDGF-AA (Humano)</td><td>Peprotech</td><td>PT10013A500&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pENTRY4IRES2GFP</td><td>Invitrogen</td><td>11818-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornitina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido inhibidor de la proteasa (Completo mini)</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td></td><td></td><td>Suministrado con enzima clonasa</td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>Conejo y alfa; neurofilamento</td><td>Millipore</td><td>AB1987&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Conejo y alfa; MBP (policlonal)</td><td>Millipore</td><td>AB980</td><td></td></tr><tr><td>Células de hibridoma Ran2</td><td>ATCC</td><td>TIB-119</td><td>Medio acondicionado que contiene el anticuerpo anti-Ran2 que se utilizará para el inmunopanning</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti CD140A/PDGFRa de rata</td><td>BD Pharmingen</td><td>558774</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>NEB</td><td>R0157</td><td></td></tr><tr><td>Medio SOC</td><td></td><td></td><td>Suministrado con bacterias competentes</td></tr><tr><td>Selenito de sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN Ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Tampón de ADN Ligasa</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tampón TE pH8</td><td></td><td></td><td>Ver soluciones en stock</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td><td></td>de lisis TNE</tr><tr><td>Oligoelementos B</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>99-175-CI</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina (apo-Transferrina humana)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina de clara de huevo</td><td>de gallina Roche</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (1x), rojo de fenol (0.05%)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Griffonia simplicifolia no conjugada Lectina BSL-1</td><td>Laboratorios de vectores&nbsp;</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

producción y uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria oligodendrocyte precursor para in vitro ensayos de mielinización

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

La mielinización es un proceso complejo que implica tanto a las neuronas y las células gliales que forman la mielina, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (CNS) y células de Schwann en el sistema nervioso periférico (SNP). Utilizamos un ensayo in vitro en la mielinización, un modelo establecido para el estudio de la mielinización del SNC in vitro. Para ello, se añaden las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) a las neuronas purificados dorsal roedor ganglio de la raíz primaria (GRD) para formar co-cultivos myelinating. Con el fin de interrogar específicamente el papel que determinadas proteínas expresadas por los oligodendrocitos ejercen sobre la mielinización hemos desarrollado protocolos que transducen selectivamente OPC utilizando el lentivirus sobreexpresan tipo salvaje, proteínas negativas constitutivamente activos o dominantes antes de ser sembradas en las neuronas DRG. Esto nos permite interrogar específicamente las funciones de estas proteínas oligodendrogliales en la regulación de la mielinización. Los protocolos también pueden aplicarse en el estudio de otsus tipos de células, proporcionando de este modo un enfoque que permite la manipulación selectiva de las proteínas expresadas por un tipo de célula deseada, tales como los oligodendrocitos para el estudio selectivo de señalización y mecanismos de compensación. En conclusión, la combinación de la mielinización ensayo in vitro con los OPC lentiviral infección proporciona una herramienta estratégica para el análisis de los mecanismos moleculares implicados en la mielinización.

La bandera de etiquetado de señales relacionadas quinasa 1 (Bandera-Erk1) construcción utilizada para la producción de lentivirus es verificado por enzimas de restricción digerir de las construcciones utilizadas, incluyendo tanto las construcciones 2K7 y las construcciones de embalaje y accesorios requeridos para la producción de virus extracelular (Figura 3) . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg"> <s...

Aquí presentamos protocolos que ofrecen una base flexible y estratégica para manipular viralmente células precursoras de oligodendrocitos para sobreexpresar proteínas de interés con el fin de interrogar específicamente su papel en oligodendrocitos a través del modelo in vitro de mielinización del sistema nervioso central.

Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para In Vitro Ensayos de mielinización

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

El objetivo general de este procedimiento es manipular viralmente las células precursoras de oligodendrocitos u OPC para sobreexpresar proteínas de interés. Para el estudio in vitro de la nación de mielinización del SNC, esto se logra clonando primero un vector lentiviral. Los siguientes pasos son producir el lentivirus y determinar la concentración viral óptima para el experimento.A continuación, las OPC disecadas y cultivadas se transducen con el lentivirus. El paso final es sembrar las OPC transducidas en neuronas cultivadas diseccionadas del DRG. En última instancia, los cocultivos mielinizantes se evalúan para la expresión de la proteína mielina mediante análisis de Western blot y se visualizan para la formación de segmentos axonales mielinizados mediante inmunotinción.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las herramientas farmacológicas, es que el enfoque lentiviral nos permite sobreexpresar selectivamente proteínas de tipo salvaje o mutantes en nuestro tipo de célula deseado, como en este caso, los oligodendrocitos En preparación clonar los 2K siete vectores prestados requeridos como se describe en el protocolo de texto en la mañana del día de la transfección, preparar 32 millones de pilas T HEK 2 93 en un matraz T 1 75 que contenga 25 mililitros de medio. Críticamente, estas células deben ser pegadas antes de la transfección, así que póngalas en una placa antes si es necesario. En un tubo Falcon de 50 mililitros, prepare una mezcla maestra para la transfección del matraz T 1 75 como se detalla en la tabla uno, agregue ADN al vórtice DMEM caliente, luego agregue PEI estéril al final para evitar precipitaciones prematuras.Mezcle bien invirtiendo el tubo tres o cuatro veces, luego incube la mezcla durante unos 15 minutos en el banco. Cambie el medio en las celdas y luego agregue la mezcla de transfección. DROPWISE mezcle suavemente el medio sobre las células y luego incube las células durante la noche.Al día siguiente. La expresión de GFP se puede comprobar mediante microscopía de fluorescencia. 48 horas después de la transfección, recoja el primer lote de sobrenadante viral y agregue 25 mililitros de medio fresco a las células.Centrifugar el sobrenadante viral a 1.140 Gs durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante viral sin la bolita de restos celulares a un nuevo tubo y guárdelo a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, a las 72 horas después de la transfección, recoja el último lote de centrífuga sobrenadante viral para eliminar los restos celulares y agruparse con el primer lote de sobrenadante viral aclarado.A continuación, concentrar el virus ultracentrifugando el sobrenadante viral a 170.000 Gs durante 90 minutos. A cuatro grados centígrados. Descargue la ultracentrífuga y vierta el sobrenadante, dejando un paladar de PEI precipitado y el virus, que no es visible en el fondo del tubo de 30 mililitros.Repite este proceso. Centrifugar todo el supernado viral en lotes en los mismos tubos de 30 mililitros para concentrar el virus y resuspender el virus en cada tubo de ultracentrífuga. Agregue 500 microlitros de medio Sato y cubra el tubo con una película.A continuación, agite el tubo durante 30 segundos y desaloje mecánicamente el pellet con una punta de pipeta. Repita este ciclo de desalojo de vórtice unas seis veces para asegurarse de que el pellet esté completamente suspendido en el medio Sato. Ahora agrupe todo el virus resuspendido en Sato en un micro tubo nuevo.Gire brevemente el sobrenadante acumulado a velocidad máxima durante un minuto. Para granular el PEI, luego recoja el sobrenadante que contiene el virus y filtre pasando la solución a través de un filtro de 0,45 micras usando una jeringa para envolver. Alícuota el virus purificado en Sedia en 2050 y volúmenes de 100 microlitros y almacenarlos todos a 80 grados centígrados negativos.Para este protocolo, disponen de células precursoras de oligodendrocitos primarios. OPCs cultivadas en placas de 10 centímetros con 10 mililitros de sedia que contengan los siguientes factores de crecimiento, C-N-T-F-P-D-G-F-N NT tres, y para las células deben haber sido cultivadas durante 24 horas bajo 8% de dióxido de carbono. Comience aspirando el medio y retírelo por completo.Luego reemplácelo con 10 mililitros del mismo medio con los factores de crecimiento. Infecte sus OPC con lentivirus, expresando la proteína de interés mediante la adición del volumen requerido de virus gota a gota en el medio. También en una placa OPC separada, mezcle el lentivirus de control que expresa solo GFP en el cultivo de medios, las células durante otras 48 horas.A continuación, recoja las OPC de las placas para sembrarlas en las neuronas GRG cultivadas. Primero enjuague cada plato con ocho mililitros de EBSS dos veces. Constituya un mililitro de tripsina EDTA 0.05% con nueve mililitros de EBSS tibio.Añade cinco mililitros de tripsina diluida a cada plato. Incuba a 37 grados centígrados durante un máximo de dos minutos. Neutraliza la tripsina añadiendo cinco mililitros de 30%FBS en EBSS.A continuación, utilizando una pipeta de 10 mililitros. Lave los OPC de la superficie de la placa. Gire el plato un cuarto de vuelta cada vez para recoger todas las celdas.Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar las células a temperatura ambiente durante 15 minutos a 180 Gs. Ahora aspirar el sobrenadante y resus. Suspenda el pellet de células en un mililitro de medio saddo tibio sin factores de crecimiento y cuente las células.A continuación, prepare las neuronas DRG que se cultivan en los cubreobjetos de 22 milímetros aspirando completamente el medio de su placa. A continuación, siembre suavemente 200.000 OPC gota a gota en cada cubreobjetos. El volumen de siembra debe ser inferior a 200 microlitros por cubreobjetos.Deje que las células se asienten sin mover el plato Después de 10 minutos, cubra cada pocillo con un mililitro de aceite tibio. Ahora vuelva a jugar los OPC hermanos restantes. En el caso de que contengan factores de crecimiento, se pueden utilizar posteriormente para verificar la expresión de la proteína de interés.Cinasa relacionada con la señal extracelular marcada con una marca. Se utilizó un constructo para la restricción de la producción de lentivirus: se utilizaron enzimas para verificar la construcción del empaque y la construcción accesoria para determinar la dilución óptima del virus para usar en las OPC. El lentivirus IR one se tituló en células T HEK 2 93 en un rango de dilución viral a células T HEK 2 93.Los niveles de expresión del gen de interés aumentaron con el tiempo. A continuación, las OPC purificadas se infectaron y cultivaron durante al menos dos días para garantizar la expresión del transgén. Se confirmaron los niveles de FLAG y GFP en las OPC hermanas.A continuación, las OPC se asentaron sobre las neuronas DRG. Luego, las OPC se diferenciaron en oligodendrocitos y, según lo evaluado por los occidentales, comenzaron a expresar proteínas de mielina. Algunos oligodendrocitos maduros mielinizados, que se visualizaron mediante tinción MBP, los axones se tiñeron con neurofilamento o beta tres tubulina para asegurar que se tuvieran en cuenta las densidades de los axones.Al analizar los niveles de mielinización Después de sembrar las OPC, es importante cultivar. Los APC hermanos. De esta manera, la proteína de interés o la etiqueta en la proteína de interés, esa expresión se puede verificar en las APC hermanas si no se puede verificar en el cocultivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se describe una molécula basada en pequeñas protocolo para la diferenciación de las células madre embrionarias de ratón en células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Este protocolo genera Olig2 + NG2 + OPC con alta eficiencia de 30 días de diferenciación. También describe un método para generar "picos" OPC que puede disparar potenciales de acción.

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En este protocolo se describe la producción, purificación y valoración de lentiviral vectores. Se presenta un ejemplo de entrega gen vector lentiviral mediada por neuronas cultivadas en la enseñanza primaria y astrocitos. Nuestros métodos pueden aplicarse también a otros tipos de...

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Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

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Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para In Vitro Ensayos de mielinización (Video) | JoVE Journal

Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para In Vitro Ensayos de mielinización

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