Modelado de las mucosas Candidiasis en larvas de pez cebra por inyección de Swimbladder

El objetivo general de este procedimiento es modelar la candidiasis de la mucosa utilizando el pez cebra juvenil. Esto se logra cargando primero una solución que contiene los albicans vivos en una microaguja. En el segundo paso, se inyecta un volumen definido de células de levadura en la vejiga natatoria de un pez cebra juvenil.

A continuación, los peces se criban para obtener un inóculo homogéneo y se incuban durante el tiempo deseado. En el paso final, se utiliza la microscopía confocal para seguir la interacción dinámica del patógeno con el sistema inmunitario del pez cebra. Además, la vejiga natatoria se puede microdiseccionar para obtener imágenes confocales de mayor resolución.

El método que presentamos aquí responde a preguntas clave de inmunología fúngica y microbiología, como cuál es la secuencia precisa de eventos que conducen a una respuesta inmunitaria fallida al patógeno fúngico y a las balizas de candidiasis en las superficies mucosas. Antes de comenzar el procedimiento, caliente una placa de inyección que contenga 2%aros en una incubadora a 33 grados centígrados. Después de 30 minutos, use una pipeta de 25 mililitros para eliminar 100 mililitros del medio E tres más PTU de un plato del cuarto día, después de la fertilización del pez cebra, teniendo cuidado de no aspirar ninguno de los peces, y agregue dos mililitros de cuatro miligramos por mililitro.

Trica sulfonato de metano almacenado a los medios de comunicación para anestesiar a los animales. Después de 15 minutos, use un microscopio de disección para identificar los peces con vejigas natatorias infladas y use una pipeta de transferencia de plástico para transferir 30 peces cebra a la placa de inyección precalentada. Retire el exceso de medios, luego sostenga el plato en ángulo y use una línea de pescar de 0.012 pulgadas de diámetro súper pegada en un capilar de silicato de boro para hacer tres líneas de 10 peces alineadas verticalmente cada una a continuación en un tubo de albicans marinos recién preparados a una concentración de 1.5 veces 10 a la séptima UFC por mililitro.

Y luego cargue tres microlitros de la solución de levadura en la microaguja recortada EC. Ajuste la duración del pulso a la configuración adecuada. A continuación, gire la placa de inyección para alcanzar un ángulo de 20 grados entre la microaguja y la cabeza del pez, apuntando hacia la parte posterior de la vejiga natatoria.

Ahora empuje la microaguja en la vejiga natatoria, asegurándose de que el orificio de la aguja esté en el lumen y presione el charco. Una vez que la verificación de qué peces se han inyectado es relativamente fácil, ya que el bolo desplaza la burbuja de aire y la parte posterior de la vejiga natatoria se llena posteriormente con medios, la inyección de rojo de fenol con el bolo puede facilitar aún más la visualización de una inyección exitosa. Después de inyectar los 30 peces, inunde el plato con E tres medios y luego vacíe el pescado en el plato de recuperación.

Transfiera 10 animales a un tubo de centrífuga de 1,7 mililitros que contenga un mililitro de E tres medios y eutanasie a los peces con 200 microlitros de trica. A continuación, para cada animal, coloque cuatro gotas de grasa al vacío en un cuadrado, a un centímetro de distancia en un micro portaobjetos, y agregue dos gotas de agua fundida recién preparada al 2% en el centro del cuadrado. A continuación, coloque un pez en un portaobjetos de vidrio separado bajo un microscopio de disección y para verificar que el corazón del animal ha dejado de latir y elimine el exceso de agua.

Ahora use un par de pinzas finas para sostener la cabeza en una posición fija y otra para tirar hacia abajo del intestino anterior. Levante la vejiga natatoria por el conducto neumático, separándola del tracto digestivo, y colóquela en el centro de uno de los microportaobjetos preparados antes de que el agro se solidifique. Finalmente, coloque un cubreobjetos sobre el pañuelo empujando suavemente hacia abajo hasta que toque la grasa de vacío y la agarosa e imagine la vejiga natatoria dentro de los 10 minutos posteriores a la recolección.

Inyectando cuatro nanolitros de albicans marinos a uno a 1,5 veces 10 del séptimo. Las UFC por mililitro proporcionan los datos más consistentes, lo que da como resultado un rango de 10 a 50 células de levadura por pez. El estrechamiento del inóculo a 15 a 25 células de levadura proporciona un fenotipo y una respuesta aún más ajustados.

Los neutrófilos desempeñan un papel clave en la resistencia a la candidiasis en ratones y humanos, y la infección de la vejiga natatoria del pez cebra con albicans vivos conduce a un reclutamiento rápido y sostenido de neutrófilos. Eso no ocurre cuando se inyectan células de levadura que matan el calor. Los filamentos se desarrollan rápidamente después de la inyección de las células de levadura con un crecimiento filamentoso que continúa durante las primeras 24 horas después de la inyección, después de lo cual este número comienza a disminuir. La capacidad de seguir a los peces individuales de forma no invasiva permite estos estudios longitudinales y destaca las diferencias individuales en la progresión de la enfermedad y las respuestas del huésped.

Un protocolo experimental que sigue siendo poco práctico en las imágenes de ratón, las interacciones de las células inmunitarias o epiteliales con c albicans es relativamente fácil en el modelo que se presenta aquí. Sin embargo, la disección de la vejiga natatoria, como se acaba de demostrar, mejora significativamente la calidad de las imágenes. Esto es particularmente útil cuando se visualizan líneas de peces transgénicos donde la fluorescencia se expresa de manera ubicua, y hay fluorescencia extraña en el tejido circundante, como se observa en estas imágenes de una vejiga natatoria disecada de la línea de peces citrino alfa Catine.

Siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la tecnología de morfología o el tratamiento de inhibición química, se pueden utilizar para responder a preguntas como, ¿cuál es el papel de una célula inmunitaria en particular o una vía de señalización en la candidiasis de la mucosa?