La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real

El objetivo general del siguiente experimento es estimar la producción tímica y de médula ósea mediante la cuantificación de los círculos de escisión del receptor de células T o los círculos de escisión de recombinación REX y K que eliminan o corrigen en un solo ensayo. Esto se logra construyendo primero un plásmido de triple inserto que contiene fragmentos de la secuencia de ADN de las correcciones TRX y de un gen de referencia de una sola copia para mantener una proporción de uno a uno a uno entre los tres objetivos después de la amplificación del ADN. A continuación, se construye una curva estándar mediante la realización de diluciones en serie del plásmido de triple inserto, que permite la cuantificación absoluta de las tres secuencias diana mediante PCR en tiempo real y en tiempo real.

Finalmente, se ejecuta un ensayo de PCR en tiempo real que conduce a la cuantificación absoluta de tres y grietas. Los resultados reportados muestran los cambios en la producción tímica y de médula ósea con la edad y el sexo en niños y adultos sanos. Tuvimos la idea de este método cuando necesitábamos analizar tanto la médula ósea como el gasto tímico en recién nacidos o lactantes, teniendo en cuenta que la cantidad de sangre que se suele extraer es escasa en comparación con los adultos.

Por lo tanto, decidimos combinar los dos métodos de cuantificación de pistas y correcciones en un solo ensayo para optimizar la preparación de la muestra y los costos de reactivos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de inmunodeficiencias primarias y adquiridas, pero el método también se puede utilizar en todas las enfermedades que implican pérdida de células TMB, así como para estudiar nuevas reconstituciones después de un trasplante de médula ósea. También se puede aplicar a la investigación básica, principalmente la que involucra la homeostasis de los linfocitos.

La principal ventaja es que al emplear un triple excedente de medios, solo se necesita un único curado estándar, lo que reduce la variabilidad experimental. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades debido al largo procedimiento requerido para la preparación del plásmido de triple inserto o debido a los problemas relacionados con la preparación de la curva estándar. Para empezar, obtenga una muestra que contenga células con muy probabilidad de tener TRX y grietas detectables por PCR, como la sangre periférica de un sujeto joven y sano recogida en tubos de EDTA utilizando un método de separación en gradiente de densidad estándar.

Separe las células mononucleares de sangre periférica después de extraer el ADN de las células de acuerdo con el protocolo de texto, use cebadores específicos Fort TRX REX y TCR alfa constante para amplificar la señal Rex, la unión de la señal Rex y los fragmentos de genes TCR alfa constante. Inserte el producto de PCR de la unión de señal Trax en el sitio aceptor de TA del vector topo PCR 2.1 y use el ADN del plásmido para transformar las células XL one azules químicamente competentes mediante choque térmico, aísle las colonias blancas resistentes a la ampicilina que han perdido la complementación de beta lactasa en una nueva placa maestra y use PCR para identificar las colonias que contienen el fragmento de caminata. Después de cultivar una de las colonias trek positivas y aislar el ADN, use SP uno para digerir el plásmido y el producto amplificado del gen de la constante alfa TCR y ligar el fragmento del gen de la constante alfa del TCR en el plásmido.

Repita la transformación, la selección y expansión de colonias y el aislamiento del ADN para insertar el fragmento correcto, use los tres traseros en lugar del SP uno para digerir el plásmido y el fragmento de PCR correcto y repita el proceso para ligar y aislar el ADN. Una vez que se hayan verificado las secuencias de los tres insertos, expanda la colonia y purifique el ADN plasmídico mediante la preparación MIDI de acuerdo con el protocolo de texto para preparar una curva estándar. Después de calcular la masa y la concentración del plásmido como se muestra aquí, descongele una alícuota del plásmido y mostrará uno para linealizar dos microgramos con la alícuota linealizada de ADN.

Usa la fórmula C, uno, V, uno igual a C, dos, V, dos. Para calcular el volumen de dilución necesario para preparar el primer punto de curva estándar de la serie, como se muestra aquí, prepare una serie de una a 10 diluciones para obtener los puntos de curva estándar restantes. Almacene la dilución del plásmido a menos 80 grados centígrados hasta su uso Para preparar muestras para PCR en tiempo real, organice una placa de PCR que incluya al menos dos réplicas para cada muestra que se analizará de la siguiente manera con dos tubos separados, uno para Rex y grietas, y otro para la constante alfa TCR.

Prepare las mezclas maestras para el número total de pocillos necesarios. Añade 20 microlitros a los pocillos del plato. A continuación, agregue cinco microlitros de ADN genómico extraído de células mononucleares de sangre periférica o P BMC.

Agregue cinco microlitros de agua a los pozos de control sin plantilla antes de usar una cubierta adhesiva óptica para sellar la placa de reacción. A continuación, descongele la dilución de la curva estándar de ADN plasmídico y prepare la dilución más alta. Descubra solo los pozos ubicados entre las filas de la A a la H y las columnas de la uno a la cuatro.

Y después de un breve vórtice, agregue cinco microlitros de cada punto de dilución a su designado. Bien asegúrese de que no haya burbujas en el fondo de los pozos y que los reactivos se depositen en el fondo. Utilice un sistema de PCR en tiempo real para ejecutar el ensayo con el siguiente protocolo.

50 grados centígrados durante dos minutos y calentamiento inicial a 95 grados centígrados durante 10 minutos, seguidos de 45 ciclos de desnaturalización a 95 grados centígrados durante 15 segundos. Y una sonda de cebador combinada e arrodillamiento y elongación a 60 grados centígrados durante un minuto. Para analizar los datos de PCR en tiempo real, abra el archivo de resultados guardado en el software y haga clic en la pestaña de resultados en la parte superior de la ventana.

Haga clic en el menú de análisis y seleccione la configuración del análisis. Deje que el software determine el umbral automáticamente seleccionando todos los detectores y el TC automático para el ciclo de umbral. Deje que el software establezca la línea de base automática para la eliminación en segundo plano de forma predeterminada.

Haga clic en la pestaña llamada gráfico de amplificación y, en la parte más a la derecha de la ventana, seleccione uno de los tres detectores en el menú desplegable correspondiente. Justo debajo de seleccionar TC manual para establecer manualmente un umbral en la parte inferior de la ventana, seleccione los pocillos correspondientes a los puntos de dilución de la curva estándar del detector elegido para mostrar los gráficos de amplificación haciendo clic y arrastrando el ratón sobre las celdas correspondientes de la tabla. Para ajustar el umbral manualmente, arrastre la línea roja del umbral hacia arriba y hacia abajo y, a continuación, haga clic en analizar para volver a analizar los resultados.

Para comprobar cómo afecta el ajuste del umbral a los resultados, seleccione la pestaña del informe y vea el CT resultante de los respectivos puntos de dilución de la curva estándar. Al mover el umbral para obtener la ubicación óptima en la pestaña de gráfico de amplificación, verifique que el umbral esté en una región de amplificación exponencial lo suficientemente por encima del ruido de fondo, pero por debajo de la fase de meseta. Si el gráfico de amplificación no se muestra en escala logarítmica, haga clic con el botón derecho en el gráfico para recuperar la configuración del gráfico y establecer la configuración Y ais posterior a la ejecución como registro.

Establezca el umbral a mitad de camino en la parte lineal del gráfico y observe las curvas de amplificación aproximadamente paralelas entre sí. Haga clic en la pestaña del informe para ver los resultados de la TC. Asegúrese de que la ubicación del umbral produzca resultados que maximicen la precisión de las dos réplicas de cada curva estándar.

Puntos de dilución. Compruebe que el umbral esté situado en el punto que mejor refleje los órdenes de magnitud extremos de los puntos de dilución de la curva estándar en la pestaña del informe. Arrastre el ratón de nuevo en la tabla en la parte inferior de la ventana para seleccionar las celdas correspondientes a los pocillos de la curva estándar Para todos los detectores, verifique que el CT resultante de los tres objetivos sea muy similar en los mismos puntos de dilución.

Por ejemplo, diferencia, no más de 0,5 CT, reajuste los umbrales si es necesario y vuelva a verificar en la pestaña del informe en la parte inferior de la ventana. Seleccione los pozos NTC y verifique que no haya amplificación en los pozos NTC, lo que corresponde a un TC de indeterminado. Seleccione la pestaña de curva estándar y, a la derecha de la ventana de trazado, seleccione detectores en el menú desplegable y vea si la pendiente de la curva estándar informada oscila entre menos 3.55 y menos 3.32, lo que corresponde a eficiencias de PCR de 91 a 100%Asegúrese de que el coeficiente de determinación o R cuadrado sea superior a 0.998 verificando su valor justo debajo de la pendiente y la intersección.

Haga clic en la pestaña del informe y en las celdas correspondientes de la tabla debajo del gráfico, verifique que el TC del control positivo sea consistente con los resultados de los ensayos anteriores en el mismo control positivo conocido. Haga clic en el menú archivo, guarde y luego exporte a un archivo CSV para exportar las cantidades de todos los pozos en un archivo de texto que contiene valores separados por comas. Finalmente, importe el archivo CSV en un software de hoja de cálculo y calcule el número de pistas o correcciones por cada 10 a los seis PBM configurando la siguiente fórmula de manera adecuada.

El ensayo descrito en este video se realizó en una muestra representativa de 87 controles sanos: 42 niños de cero a 17 años y 45 adultos de 24 a 60 años. Como se muestra aquí, el número de caminatas disminuyó drásticamente con la edad debido a la involución tímica de cero a tres o cuatro años en los adultos.

El número de caminatas también depende del género porque disminuye más rápidamente en los hombres que en las mujeres, lo que puede afectar la capacidad de establecer rangos de referencia apropiados. Estos gráficos muestran que el número de grietas, sin embargo, disminuyó con la edad, de manera similar al patrón observado con los T TREX solo en los niños. Mientras que en los adultos, la producción de médula ósea es bastante estable a lo largo de la vida y no depende del sexo.

La preparación de plásmidos triples en insertos requiere unas dos o tres semanas, pero a partir de entonces, las asignaciones de plásmidos almacenadas durarán tres años. La parte restante de la técnica se puede realizar en solo cuatro o cinco horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es muy importante realizar toda la manipulación relacionada con el plásmido en un área dedicada para evitar la contaminación cruzada del ADN.

También es esencial verificar la estabilidad del tubo estándar al analizar los resultados después de su desarrollo. Esta técnica proporcionó a los investigadores en el campo de la inmunología clínica o la hematología, una herramienta mejorada para la identificación de inmunodeficiencias primarias para monitorear el resultado de la reconstitución inmune, después de un trasplante de médula ósea, o simplemente para estudiar la homeostasis de los linfocitos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener el triple en plásmido, preparar la curva estándar, ejecutar el experimento de PCR en tiempo real y realizar los cálculos necesarios para obtener una cuantificación absoluta reproducible de trax y grietas.