Name: La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Aprende a cuantificar simultáneamente TRECs y KRECs mediante PCR en tiempo real para evaluar la producción timica y de médula ósea. Este método optimiza el análisis inmunológico en muestras pequeñas.

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Los autores no tienen agradecimientos.

<ol><li>Douek, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thymic+function+with+age+and+during+the+treatment+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection.</a> Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).</li>
<li>Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+history+of+B+lymphocytes+reveals+homeostatic+proliferation+and+extensive+antigen-induced+B+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).</li>
<li>Fronkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+reconstitution+after+allogeneic+SCT+impairs+minimal+residual+disease+monitoring+in+children+with+ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL.</a> Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+recent+thymic+T-cell+and+bone+marrow+B-cell+emigrants+in+patients+with+primary+immunodeficiency+undergone+to+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation.</a> Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+and+bone+marrow+output+in+patients+with+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency.</a> J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effects+of+interferon-%CE%B2+on+new+B+and+T+cell+release+from+production+sites+in+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis.</a> J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+accumulation+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+in+natalizumab-treated+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients.</a> Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+T-+and+B-cell+defects+in+one+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient.</a> PLoS One. 7, e34493(2012).</li>
<li>Quiros-Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+combined+antiretroviral+therapy+on+B-+and+T-cell+release+from+production+sites+in+long-term+treated+HIV-1%2B+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients.</a> J. Transl. Med. 10, 94(2012).</li>
<li>Mensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+TREC+and+KREC+quantification+for+the+monitoring+of+early+T-+and+B-cell+neogenesis+in+adult+patients+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> J. Transl. Med. 11, 188(2013).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+different+extent+of+B+and+T+cell+immune+reconstitution+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation+and+enzyme+replacement+therapies+in+SCID+patients+with+adenosine+deaminase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency.</a> J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).</li>
<li>Borte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+screening+for+severe+primary+immunodeficiency+diseases+using+high-throughput+triplex+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR.</a> Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).</li>
<li>Baker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+routine+testing+for+severe+combined+immunodeficiency+within+Wisconsin%27s+newborn+screening+program%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program.</a> Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).</li>
<li>Lorenzi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+thymic+function+directly+from+peripheral+blood%3A+a+validated+modification+to+an+established+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method.</a> J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).</li>
<li>De Boer, R. J., Perelson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+T+lymphocyte+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying T lymphocyte turnover.</a> J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La cuantificación de TREC y KREC puede considerarse una buena estimación de la producción tímica y de médula ósea reciente, siempre que se tengan en cuenta algunas advertencias. Aunque un método de cuantificación absoluta que emplea una curva estándar requiere más reactivos y más espacio en la placa de reacción de PCR en tiempo real, garantiza resultados cuantitativos altamente precisos porque las cantidades de muestra desconocidas se interpolan a partir de curvas estándar construidas sobre cantidades conocidas de materi...

Círculos de escisión del receptor de células T (TRECs) y círculos de escisión recombinación K-borrar (KRECs) son pequeños elementos de ADN circularized que son extirpados en una proporción de las células B, respectivamente, T y durante un proceso de recombinación de ADN genómico, lo que lleva a la formación de un repertorio altamente diversificada de T y receptores de células B. No tienen ninguna función, sino porque son estables y no se pueden replicar, se diluyen después de cada división celular, que persiste por tanto, sólo en una de las dos células hijas. Por lo tanto, sus niveles en la sangre periférica se puede asumir como una estimación de la salida de la médula tímica y el hueso. Si bien el ensayo TREC se ha utilizado ampliamente en los últimos 15 años para evaluar la magnitud de la producción del timo, 1 ensayo FREC, que fue desarrollado inicialmente para medir la proliferación de células B y su contribución a la homeostasis de las células B en la salud y la enfermedad, 2 sólo recientemente ha sido propuesto como un marcador de hueso mflecha de salida. 3,4 A continuación, describimos el método que hemos desarrollado para la cuantificación simultánea de ambos TRECs y KRECs. 4 Con este método combinado, la variabilidad asociada a la cuantificación de ADN por PCR en tiempo real se elimina mediante el uso de una curva estándar único obtenido por dilución de un plásmido de triple inserto que contiene fragmentos de TRECs, KRECs y de las células T del receptor alfa constante (TCRAC) gen en una proporción de 1: 1: 1. Esto permite una evaluación más precisa del número de copias TREC y FREC. Además, la cuantificación simultánea de los dos objetivos en la misma reacción permite la reducción de costes de reactivos. El ensayo TREC / FREC propuesto puede ser útil para medir el grado de células T y B neo-producción en niños o adultos con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), 4 Inmunodeficiencia Común Variable, 5 enfermedades autoinmunes, 6-8 y la infección por VIH . 9 Además, se puede utilizar paracontrolar la recuperación inmune después del trasplante de células madre hematopoyéticas, 10 de reemplazo enzimático, 11 y 9 antiviral o inmunomoduladores terapias. 6-8 Finalmente, porque los pacientes SCID se reconocen usando el ensayo de TREC a pesar de los defectos genéticos subyacentes, y agammaglobulinemia pacientes pueden identificarse utilizando la cuantificación FREC , el ensayo TREC / FREC puede también ser utilizado para detectar inmunodeficiencias en programas de cribado neonatal. 12 En este caso, la prueba debe ser realizada en ADN extraído de pequeñas manchas de sangre borrado y se seca sobre papel de filtro, debe ser altamente sensible y específica para las enfermedades objeto, así como altamente reproducible y rentable. La introducción de FREC cuantificación en la prueba debería mejorar el rendimiento de cribado neonatal para inmunodeficiencias, que habitualmente se ha realizado en las algunas partes de los EE.UU. (WI, MA, CA) desde 2008, cuando se convirtió en Wisconsin el primero en Introde el análisis de TRECs en su programa de detección postnatal. 13

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>10771-500 ML método de</td><td>separación en gradiente de densidad</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>51106</td><td>Extracción de ADN</td></tr><tr><td>Oligonucleótidos de ADN no modificado HPSF 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>Resuspender el producto liofilizado a 100 pmol/&micro; l</td></tr><tr><td>ADN polimerasa AmpliTaq: incluye 10x Buffer II y 25 mM MgCl2</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080156</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp dNTP Blend (100 mM)</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080261</td><td></td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit para la subclonación de</td> células competentes de grado de subclonación <td>Invitrogen/Life-Technologies</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue</td><td>Stratagene</td><td>200130</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de minipreparación de plásmido PureYield</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>SpeI 500U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF 10,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2492</td><td></td></tr><tr><td>XhoI 5,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Utrapure</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Tampón TE (1 mM TRIS y 0,1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master</td><td>Mix Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4364338</td><td></td></tr><tr><td>Sondas de doble marcado HPLC 0,01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>Resuspender el producto liofilizado a 100 pmol/&micro; l</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop 2000c</td><td>Termociclador ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720</td><td>Biosystems aplicados/Life-Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>sistema de PCR en tiempo real Fast 7500</td> Software de detección de secuencias SDS de <td>Biosystems Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.4</td><td>Biosistemas Aplicados/Tecnologías de la Vida</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la cuantificación simultánea de t-cell círculos receptor excision (trecs) y círculos k-eliminación recombinación excision (krecs) por pcr en tiempo real

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

círculos de escisión del receptor de células T (TREC) y círculos de escisión de recombinación con eliminación de K (KREC) son elementos de ADN circularizados formados durante el proceso de recombinación que crea receptores de células T y B. Debido a que los TREC y KREC no pueden replicarse, se diluyen después de cada división celular y, por lo tanto, persisten en la célula. Su cantidad en sangre periférica puede considerarse como una estimación de la producción tímica y de médula ósea. Mediante la combinación de un ensayo TREC bien establecido y de uso común con una versión modificada del ensayo KREC, hemos desarrollado una PCR cuantitativa dúplex en tiempo real que permite la cuantificación de linfocitos T y B recién producidos en un solo ensayo. El número de TRECs y KRECs se obtiene utilizando una curva estándar preparada diluyendo en serie las uniones de señal TREC y KREC clonadas en un plásmido bacteriano, junto con un fragmento del gen de la constante alfa del receptor de células T que sirve como gen de referencia. Los resultados se informan como número de TREC y KRECs/106 células o por ml de sangre. Se ha demostrado que la cuantificación de estos fragmentos de ADN es útil para monitorizar la reconstitución inmunitaria tras un trasplante de médula ósea tanto en niños como en adultos, para mejorar la caracterización de las deficiencias inmunitarias o para comprender mejor la actividad de ciertos fármacos inmunomoduladores.

El ensayo se realizó en una muestra representativa de 87 controles sanos: 42 niños de entre 0 a 17 (hombres / mujeres: 25/17) y 45 adultos de 24 años - 60 (machos / hembras: 29/16). Los resultados fueron obtenidos como TRECs y KRECs por 10 6 PBMC, y luego los TRECs y KRECs por ml de sangre fueron calculados. El número de TRECs disminuye con la edad debido a la involución tímica, 4, en particular, de una manera muy aguda de 0 a 3 - 4 años. En los adultos, el número TREC ...

Aquí, describimos un método para la cuantificación simultánea de círculos de escisión del receptor de células T (TRECs) y círculos de escisión de recombinación de eliminación de K (KRECs). El ensayo TREC/KREC se puede utilizar como marcador de la diuresis tímica y de la médula ósea.

La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

El objetivo general del siguiente experimento es estimar la producción tímica y de médula ósea mediante la cuantificación de los círculos de escisión del receptor de células T o los círculos de escisión de recombinación REX y K que eliminan o corrigen en un solo ensayo. Esto se logra construyendo primero un plásmido de triple inserto que contiene fragmentos de la secuencia de ADN de las correcciones TRX y de un gen de referencia de una sola copia para mantener una proporción de uno a uno a uno entre los tres objetivos después de la amplificación del ADN. A continuación, se construye una curva estándar mediante la realización de diluciones en serie del plásmido de triple inserto, que permite la cuantificación absoluta de las tres secuencias diana mediante PCR en tiempo real y en tiempo real.Finalmente, se ejecuta un ensayo de PCR en tiempo real que conduce a la cuantificación absoluta de tres y grietas. Los resultados reportados muestran los cambios en la producción tímica y de médula ósea con la edad y el sexo en niños y adultos sanos. Tuvimos la idea de este método cuando necesitábamos analizar tanto la médula ósea como el gasto tímico en recién nacidos o lactantes, teniendo en cu

simultaneous-quantification-t-cell-receptor-excision-circles-trecs-k

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Se describe un método para la determinación cuantitativa, medida en tiempo real de ADN glicosilasa y actividades AP endonucleasas en lisados ​​de células nucleares. El ensayo proporciona tasas de actividad ADN Reparación susceptibles de análisis cinético y es adaptable para la cuantificación de la actividad del ADN en el tejido de reparación y lisados ​​tumorales o con proteínas purificadas.

Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados ​​celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons

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Este manuscrito describe cómo realizar ensayos basados en la Transferencia de Energía por Resonancia de Förster (FRET) (molécula única) para medir la dinámica de unión entre el receptor de antígeno de células T (TCR) y las moléculas MHC cargadas de péptidos antigénicos a medida que ocurren dentro de la sinapsis inmunológica de una célula T en contacto con una bicapa lipídica plana funcionalizada con soporte.

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Este manuscrito describe el procedimiento experimental y el análisis de software para un ensayo de sitio de integración bidireccional que puede analizar simultáneamente el ADN de unión vector-huésped aguas arriba y aguas abajo. Los productos de PCR bidireccionales pueden utilizarse para cualquier plataforma de secuenciación aguas abajo. Los datos resultantes son útiles para una comparación cuantitativa de alto rendimiento de dianas de ADN integradas.

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Aquí describimos un método robusto para determinar la identidad y pureza de las células inmunitarias a través de firmas epigenéticas detectadas mediante PCR cuantitativo (qPCR). La desmetilación del ADN en un locus específico sirve como un identificador único para un tipo de célula en particular y permite la identificación de células CD8+, reguladoras o T Th17.

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Aprende a cuantificar simultáneamente TRECs y KRECs mediante PCR en tiempo real para evaluar la producción timica y de médula ósea. Este método optimiza el análisis inmunológico en muestras pequeñas.

La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real (Video) | JoVE Journal

La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real

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