La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila

El objetivo general del siguiente experimento es generar sustratos de cultivo de tejidos con múltiples cepillos PEG de micropatrones, que presenten químicas ortogonales que permitan la inmovilización de ligandos biológicos espacialmente precisa y específica del sitio. Esto se logra mediante matrices de deposición de acan tiol, un iniciador TRP mediante una impresión robótica de microcontacto sobre sustratos recubiertos de oro. Como segundo paso SI, se realiza un TRP en los sustratos de micro patrones, lo que genera cepillos PEG con grupos de bromo terminales.

A continuación, los grupos de bromo terminal se funcionalizan con uno o dos grupos reactivos químicos para permitir la movilización IM de ligandos biológicos adecuadamente preparados. A continuación, se repite todo el proceso para funcionalizarlo con un segundo grupo químico. Los resultados muestran microarrays de dos pinceles PEG funcionalizados ortogonalmente superpuestos con una precisión de 10 micras.

Esto se verifica utilizando un software de análisis de imágenes personalizado después de la conjugación de los grupos reactivos con moléculas fluorescentes. La principal ventaja de esta técnica sobre métodos como la impresión manual por microcontacto es que la impresión robótica por microcontacto es capaz de superponer múltiples pasos de impresión con una precisión de micras, al tiempo que permite la máxima flexibilidad y diseño del sustrato. La precisión que ofrece este método, junto con las reacciones secuenciales de sustitución nucleofílica, nos permite generar sustratos de cultivo de tejidos que se funcionalizan con múltiples ligandos biológicos que luego son capaces de ejercer un control temporal y espacial del sulfato a escala micrométrica.

Antes de S-I-A-T-R-P, una diapositiva de cubierta recubierta de oro debería haber sido modelada con el sello A-P-D-M-S. Este procedimiento relativamente común se explica en un protocolo de texto. Comience quitando la corredera de la cubierta de patente del robot soltando la aspiradora.

Luego transfiéralo a un matraz de 50 mililitros de longitud, selle el matraz y aplique una aspiradora negativa de 30 PSI. A continuación, añada 5,5 mililitros de la mezcla de reacción A TRP en el matraz con una jeringa y, a continuación, añada 0,5 mililitros de L de ascorbato sódico en agua también con una jeringa. Observe cómo la reacción cambia de color de verde claro a marrón oscuro.

Deje que la reacción continúe durante 16 horas bajo gas inerte. Cuando se complete la reacción, retire la corredera de la cubierta y enjuáguela con etanol, luego con agua y luego con etanol nuevamente. A continuación, sécalo suavemente con nitrógeno.

El microarray de pinceles P-E-G-M-E-M-A injertados debe ser visible a simple vista. Utilice la microscopía para revelar estos cambios en detalle para funcionalizar las cadenas P-E-G-M-E-M-A. Transfiera el portaobjetos de la cubierta del patrón a un vial de reacción de vidrio de 20 mililitros y agregue seis mililitros de DMF que contenga 100 milimolares de azida de sodio.

Deje que la reacción dure 24 horas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, enjuague el portaobjetos de la cubierta de patente con etanol y séquelo bajo un suave chorro de nitrógeno para pacificar las cadenas P-E-G-M-E-M-A funcionalizadas con bromo restantes. Transfiera el portaobjetos de la cubierta del micropatrón a un vial de reacción de vidrio de 20 mililitros y agregue seis mililitros de DMSO que contenga 100 milimolares de etanol amina y 300 milimolares de trietilamina.

Permita que esta reacción continúe durante 24 horas a 40 grados centígrados al día siguiente. Enjuague el portaobjetos de la cubierta del patrón con etanol y séquelo suavemente bajo un chorro de nitrógeno. El siguiente paso es repetir la impresión por microcontacto del robot utilizando un segundo sello PDMS y luego estampar.

Utilice SI A TRP de nuevo para graficar el segundo pincel PEG de micro array. Entonces es el momento de funcionalizar el acetileno de la segunda micro matriz P-E-G-M-E-A cadenas Francois. La cubierta del micro patrón.

Deslice en un vial de reacción de vidrio de 20 mililitros con seis mililitros de propag amina molar de 100 mililitros en DMF. Deje que la reacción continúe durante 24 horas. Al día siguiente, a temperatura ambiente, enjuague el portaobjetos de la cubierta de patente con etanol y séquelo con un suave chorro de nitrógeno.

A continuación, la diapositiva de la cubierta de la patente está lista para la fermentación con biotina. Comience colocando el portaobjetos de la cubierta de micro patente en un vial de reacción de vidrio de 20 mililitros. Primero, la biotina se comió las cadenas terminadas en acetileno.

Agregue seis mililitros de sulfato de cobre con el conjugado de biotina PEG four azida al vial de reacción, seguido de 1,2 mililitros de 0,15. Ácido rbico milimolar en agua para iniciar la reacción, burbujee la reacción con nitrógeno durante 10 segundos. A continuación, selle el vial con paraform y deje actuar durante 24 horas.

Al día siguiente, a temperatura ambiente, enjuague el portaobjetos de la cubierta con agua y transfiéralo a un plato de poliestireno de 12 pocillos. Luego, a temperatura ambiente en DPBS con suero de burro durante una hora, una hora más tarde, tinción en los grupos elurados con biotina con estreptococo DEIN 5 46 conjugado a dos microgramos por mililitro en tinción de DPBS durante dos horas a temperatura ambiente dos horas después. Enjuague el portaobjetos de cubierta en DPBS cinco veces con vegetación suave.

Tobi ITIN aate las cadenas terminadas azi. Coloque el cubreobjetos en un pocillo de una placa de poliestireno de seis pocillos y aplique dos mililitros de DPBS que contengan 20 micromolares D-B-C-O-P-G cuatro biotina. A continuación, incube el portaobjetos de cubierta durante 24 horas a temperatura ambiente y 24 horas después.

Enjuague el portaobjetos de la cubierta como antes del cuatro y tíñelo con estreptavidina 4 88. Conjugado a dos microgramos por mililitro en DPBS. Dos horas después.

Enjuague el portaobjetos de la cubierta nuevamente y luego obtenga imágenes con microscopía. Utilizando este protocolo de impresión de micro contacto robotizado. Un patrón preciso de la interfaz de usuario de ANN del cepillo PEG con grupos de alkin terminales se modeló dentro de un arreglo separado de la interfaz de usuario de ANN del cepillo PEG más grande con grupos azi terminales.

La distribución espacial de los grupos azida y alkin se observó utilizando la química de clic y la unión a estreptavidina de sondas fluorescentes. Una superposición de ambos canales fluorescentes muestra cómo los sellos no se superponen. Se calculó que la precisión de la alineación era inferior a 10 micras, que está en los límites del SCAR.

Un sistema utilizado para hacer la impresión. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo generar sustratos de cultivo de tejidos personalizados mediante la impresión robótica de microcontacto para superponer varias matrices de cepillos de clavijas. Funcionalizado con químicas ortogonales.