La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila
October 31st, 2014
Los sustratos de cultivo celular funcionalizados con patrones a microescala de ligandos biológicos tienen una inmensa utilidad en el campo de la ingeniería de tejidos. Aquí, demostramos la fabricación versátil y automatizada de sustratos de cultivo de tejidos con múltiples cepillos de poli(etilenglicol) micromodelados que presentan químicas ortogonales que permiten la inmovilización espacialmente precisa y específica del sitio de ligandos biológicos.
El objetivo general del siguiente experimento es generar sustratos de cultivo de tejidos con múltiples cepillos PEG de micropatrones, que presenten químicas ortogonales que permitan la inmovilización de ligandos biológicos espacialmente precisa y específica del sitio. Esto se logra mediante matrices de deposición de acan tiol, un iniciador TRP mediante una impresión robótica de microcontacto sobre sustratos recubiertos de oro. Como segundo paso SI, se realiza un TRP en los sustratos de micro patrones, lo que genera cepillos PEG con grupos de bromo terminales.
A continuación, los grupos de bromo terminal se funcionalizan con uno o dos grupos reactivos químicos para permitir la movilización IM de ligandos biológicos adecuadamente preparados. A continuación, se repite todo el proceso para funcionalizarlo con un segundo grupo químico. Los resultados muestran microarrays de dos pinceles PEG funcionalizados ortogonalmente superpuestos con una precisión de 10 micras.
Esto se verifica utilizando un software de análisis de imágenes personalizado después de la conjugación de los grupos reactivos con moléculas fluorescentes. La principal ventaja de esta técnica sobre métodos como la impresión manual por microcontacto es que la impresión robótica por microcontacto es capaz de superponer múltiples pasos de impresión con una precisión de micras, al tiempo que permite la máxima flexibilidad y diseño del sustrato. La precisión que ofrece este método, junto con las reacciones secuenciales de sustitución nucleofílica, nos permite generar sustratos de cultivo de tejidos que se funcionalizan con múltiples ligandos biológicos que luego son capaces de ejercer un control temporal y espacial del sulfato a escala micrométrica.
Antes de S-I-A-T-R-P, una diapositiva de cubierta recubierta de oro debería haber sido modelada con el sello A-P-D-M-S. Este procedimiento relativamente común se explica en un protocolo de texto. Comience quitando la corredera de la cubierta de patente del robot soltando la aspiradora.
Luego transfiéralo a un matraz de 50 mililitros de longitud, selle el matraz y aplique una aspiradora negativa de 30 PSI. A continuación, añada 5,5 mililitros de la mezcla de reacción A TRP en el matraz con una jeringa y, a continuación, añada 0,5 mililitros de L de ascorbato sódico en agua también con una jeringa. Observe cómo la reacción cambia de color de verde claro a marrón oscuro.
Deje que la reacción continúe durante 16 horas bajo gas inerte. Cuando se complete la reacción, retire la corredera de la cubierta y enjuáguela con etanol, luego con agua y luego con etanol nuevamente. A continuación, sécalo suavemente con nitrógeno.
El microarray de pinceles P-E-G-M-E-M-A injertados debe ser visible a simple vista. Utilice la microscopía para revelar estos cambios en detalle para funcionalizar las cadenas P-E-G-M-E-M-A. Transfiera el portaobjetos de la cubierta del patrón a un vial de reacción de vidrio de 20 mililitros y agregue seis mililitros de DMF que contenga 100 milimolares de azida de sodio.
Deje que la reacción dure 24 horas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, enjuague el portaobjetos de la cubierta de patente con etanol y séquelo bajo un suave chorro de nitrógeno para pacificar las cadenas P-E-G-M-E-M-A funcionalizadas con bromo restantes. Transfiera el portaobjetos de la cubierta del micropatrón a un vial de reacción de vidrio de 20 mililitros y agregue seis mililitros de DMSO que contenga 100 milimolares de etanol amina y 300 milimolares de trietilamina.
Permita que esta reacción continúe durante 24 horas a 40 grados centígrados al día siguiente. Enjuague el portaobjetos de la cubierta del patrón con etanol y séquelo suavemente bajo un chorro de nitrógeno. El siguiente paso es repetir la impresión por microcontacto del robot utilizando un segundo sello PDMS y luego estampar.
Utilice SI A TRP de nuevo para graficar el segundo pincel PEG de micro array. Entonces es el momento de funcionalizar el acetileno de la segunda micro matriz P-E-G-M-E-A cadenas Francois. La cubierta del micro patrón.
Deslice en un vial de reacción de vidrio de 20 mililitros con seis mililitros de propag amina molar de 100 mililitros en DMF. Deje que la reacción continúe durante 24 horas. Al día siguiente, a temperatura ambiente, enjuague el portaobjetos de la cubierta de patente con etanol y séquelo con un suave chorro de nitrógeno.
A continuación, la diapositiva de la cubierta de la patente está lista para la fermentación con biotina. Comience colocando el portaobjetos de la cubierta de micro patente en un vial de reacción de vidrio de 20 mililitros. Primero, la biotina se comió las cadenas terminadas en acetileno.
Agregue seis mililitros de sulfato de cobre con el conjugado de biotina PEG four azida al vial de reacción, seguido de 1,2 mililitros de 0,15. Ácido rbico milimolar en agua para iniciar la reacción, burbujee la reacción con nitrógeno durante 10 segundos. A continuación, selle el vial con paraform y deje actuar durante 24 horas.
Al día siguiente, a temperatura ambiente, enjuague el portaobjetos de la cubierta con agua y transfiéralo a un plato de poliestireno de 12 pocillos. Luego, a temperatura ambiente en DPBS con suero de burro durante una hora, una hora más tarde, tinción en los grupos elurados con biotina con estreptococo DEIN 5 46 conjugado a dos microgramos por mililitro en tinción de DPBS durante dos horas a temperatura ambiente dos horas después. Enjuague el portaobjetos de cubierta en DPBS cinco veces con vegetación suave.
Tobi ITIN aate las cadenas terminadas azi. Coloque el cubreobjetos en un pocillo de una placa de poliestireno de seis pocillos y aplique dos mililitros de DPBS que contengan 20 micromolares D-B-C-O-P-G cuatro biotina. A continuación, incube el portaobjetos de cubierta durante 24 horas a temperatura ambiente y 24 horas después.
Enjuague el portaobjetos de la cubierta como antes del cuatro y tíñelo con estreptavidina 4 88. Conjugado a dos microgramos por mililitro en DPBS. Dos horas después.
Enjuague el portaobjetos de la cubierta nuevamente y luego obtenga imágenes con microscopía. Utilizando este protocolo de impresión de micro contacto robotizado. Un patrón preciso de la interfaz de usuario de ANN del cepillo PEG con grupos de alkin terminales se modeló dentro de un arreglo separado de la interfaz de usuario de ANN del cepillo PEG más grande con grupos azi terminales.
La distribución espacial de los grupos azida y alkin se observó utilizando la química de clic y la unión a estreptavidina de sondas fluorescentes. Una superposición de ambos canales fluorescentes muestra cómo los sellos no se superponen. Se calculó que la precisión de la alineación era inferior a 10 micras, que está en los límites del SCAR.
Un sistema utilizado para hacer la impresión. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo generar sustratos de cultivo de tejidos personalizados mediante la impresión robótica de microcontacto para superponer varias matrices de cepillos de clavijas. Funcionalizado con químicas ortogonales.
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Visión general
Este estudio demuestra la fabricación automatizada de sustratos de cultivo de tejidos con cepillos de poli(etilenglicol) (PEG) micropatroneados. Estos cepillos presentan químicas ortogonales que facilitan la inmovilización espacialmente precisa y específica del sitio de ligandos biológicos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Ingeniería de tejidos
- Biomateriales
- Microfabricación
Antecedentes
- Los sustratos para cultivo celular son esenciales para aplicaciones de ingeniería de tejidos.
- El micropatronado permite un control preciso sobre la presentación del ligando.
- Los cepillos de PEG son materiales versátiles para la funcionalización.
- Las químicas ortogonales permiten modificaciones complejas de la superficie.
Propósito del estudio
- Crear sustratos de cultivo de tejidos con múltiples cepillos de PEG micropatroneados.
- Permitir la inmovilización específica del sitio de ligandos biológicos.
- Demostrar la automatización del proceso de fabricación.
Métodos utilizados
- Impresión de microcontacto robótica de acan tiol en sustratos recubiertos de oro.
- Polimerización radical por transferencia de átomos iniciada en superficie (SI-ATRP) secuencial para generar cepillos de PEG.
- Funcionalización de grupos bromo terminales con grupos químicos reactivos.
- Repetición del proceso para lograr una doble funcionalización.
Principales resultados
- Creación exitosa de micromatrices con dos cepillos de PEG funcionalizados ortogonalmente.
- Se logró una precisión de superposición de 10 micrones.
- Se demostró versatilidad en la funcionalización del sustrato.
- Se permitió la inmovilización espacialmente precisa del ligando.
Conclusiones
- El método permite modificaciones complejas de la superficie en la ingeniería de tejidos.
- Los procesos automatizados mejoran la reproducibilidad y la eficiencia.
- Posibles aplicaciones en varios campos de investigación biológica.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Robotic microcontact printing (R-µCP) with sequential nucleophilic substitution enables the fabrication of culture substrates with highly ordered, micron-scale patterns of orthogonally functionalized PEG brushes. This precision supports spatially controlled ligand immobilization, directly impacting early discovery and target validation workflows in tissue engineering and advanced cell models. The method's reproducibility and alignment accuracy address critical needs for predictive confidence and translational continuity in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-matrix interactions with spatially defined ligand presentation.
- Supports mechanistic de-risking by allowing precise control of microenvironmental cues.
- Facilitates functional target validation through site-specific immobilization of biological ligands.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible substrates for downstream cell-based assays.
- Delivers quantitative, spatially resolved outputs for compound or ligand screening.
- Enables scalable and reusable platform design for high-content screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro substrate architecture with in vivo tissue microenvironments for disease-relevant modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling complex tissue engineering.
- Provides predictive de-risking for biomaterial and cell therapy development pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery, assay development, and translational research, enabling seamless progression from hypothesis testing to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of cell behavior in engineered microenvironments.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing ligand or compound effects.
- Analytics: Supports high-resolution imaging and quantitative analysis of spatial patterning and ligand immobilization.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo relevance by mimicking tissue-specific architectures.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse R&D programs requiring spatially controlled substrates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Delivers high reproducibility, micron-scale alignment, and flexible substrate design.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tissue engineering and cell therapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, robotics, and microfabrication techniques.
- Demands access to robotic microcontact printing instrumentation and imaging analytics.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different cell types or ligand chemistries.
- Micron-scale alignment is limited by the precision of robotic and imaging systems.
