Name: La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprende a fabricar sustratos de cultivo complejos mediante impresión robótica de microcontacto y sustitución nucleófila secuencial. Este método automatizado permite la inmovilización espacialmente precisa de ligandos biológicos en matrices de PEG con químicas ortogonales.

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La financiación para este trabajo, GTK, TK y JDM fueron proporcionados por el Wisconsin Institute for Discovery y la Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Generación de Sellos elastoméricos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para generar maestros de silicio de la estampillas PDMS, diseñar patrones de características de la fotomáscara el uso de software de diseño asistido por ordenador. <ol><li> Diseñar el primer patrón como una matriz de 20 x 20 de los anillos con 300 m de diámetro interior (ID) y 600 OD m con 1.200 m separación de centro a centro. </li><li> Diseñar el segundo patrón como una matriz de 20 x 20 con anillos de 600 micras ID y OD 900 m con 1200 micras separación de centro a centro. </li><li> Además, colocar 1 x 1 mm 2 marcas de referencia cuadrados en las cuatro esquinas de cada gama de diseño espaciados 1.200 m de centro a centro del patrón de esquina en un ángulo de 45 °. </li><li> Fabricar los maestros de silicio para su uso en este experimento con 1: 1 relaciones de aspecto, correlacionando a una profundidad característica de 300 micras usando técnicas de litografía estándar detallados en otra parte 15 o en colaboración con una fundición de microfluidos. NOTA: Característica profundidades inferiores a 100 micras pueden conducir a la deformación anormal de sellos antes de ponerse en contacto con superficies de sustrato. NOTA: Este protocolo comienza con tener maestros de silicio ya obtenidos con los patrones descritos de resina fotosensible, lo que requiere equipo especializado y habitaciones limpias para crear. Lo mejor es consultar con una instalación de fabricante o núcleo para crear estos maestros estampados. </li></ol></li><li> Maestros de silicio silanizar O / N de incubación con (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) vapor de triclorosilano. NOTA: Silano vapor es altamente tóxico y sólo debe ser manejado en una campana de humos química. </li><li> Crear réplicas inversa de los maestros de silicio por la curación de una proporción de 10: 1 de PDMS pre-polímero y agente de PDMS en la parte superior de los maestros de silicio silanizadas curado en un plato de Petri S / N a 60 ° C. </li><li> Retire los sellos de PDMS de los maestros de silicio, y unir los sellos a acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) soportes o cualquier otro material rígidos mediante pegamento. NOTA: El material de elección no tiene que ser transparente o biocompatible. Sin embargo, debe proporcionar una superficie plana para la interfaz con el utillaje robótico y una mayor rigidez que PDMS. </li></ol> 2. Preparación de cubreobjetos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Cubreobjetos de microscopio de enjuague (24 mm x 50 mm # 1) en tolueno, metanol y se somete a ultrasonidos en acetona durante 1 min antes de enjuagar con etanol y secado bajo una corriente suave de nitrógeno. NOTA: Manejar tolueno y acetona sólo en una campana de humos química. </li><li> Cubreobjetos Coat con ~ 3.5 nm de titanio (Ti), seguido de 18,0 nm de oro (Au) usando un evaporador de haz de electrones focalizado. NOTA: Este procedimiento es compatible con una variedad de sustratos recubiertos de oro como el silicio y el poliestireno. Mientras que es posible para generar estos en el sitio, los sustratos recubiertos de oro también están disponibles a través de proveedores comerciales. NOTA: Las capas de Ti debe ser al menos de 3 nm de espesor, mientras que las capas de Au sobre sustratos deben ser unt menos 5 nm de espesor y puede oscilar hasta el final a 1 mm de espesor dependiendo de las propiedades ópticas ideales del sustrato final 16,17. Sustratos no están obligados a ser ópticamente claro para la fabricación; sin embargo, se facilita el análisis microscópico de sustratos fabricados. </li><li> Enjuague cubreobjetos recubiertos de oro con etanol y se seca bajo nitrógeno suave inmediatamente antes del uso. </li></ol> 3. R-μCP de externo del anillo <ol style="margin-left: 40px;"><li> Antes de la I-μCP con el sistema de forma selectiva conforme brazo robot articulado (SCARA), calibrar los efectores de herramientas robóticos y sistemas de doble cámara de acompañamiento utilizando el software del sistema. NOTA: Estos implementos se representan en la Figura 1. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg"> Figura 1. Sistema μCP R y Brazo robótico de herramientas. (A) vista a gran escala de sistema R-μCP con todas las herramientas y accesorios, (a) de la tirada de vacío, (b) Baño de reactivo, (c) hacia abajo de la cámara, (d) fijación de anidación sello, (e) robótica herramienta. (B) Herramientas robóticas Robótica que representa (f) herramienta de grabado con punta de diamante y (g) la herramienta de succión neumática celebración de una (h) ABS respaldados por el sello PDMS. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Colocar manualmente un sello PDMS con 600 ID micras y 900 micras OD sobresale anillos boca abajo en el accesorio de anidación sello. Colocar manualmente un coverslide recubierto de oro recién limpiada en la parte superior del mandril de vacío, que se muestra en la Figura 1A, e inmovilizarlo utilizando el vacío de laboratorio conectado. </li><li> Uso de los controles de robot, alinear la cámara que mira hacia abajo sobre el punto de centro de la coverslide recubierto de oro, como en la Figura 2A. NOTA: Este punto inicialmente se puede definir mediante una inspección visual y no requiere de una gran precisión, ya que el sello de PDMS es mucho larger que el portaobjetos recubierto de oro. </li><li> Instruya al brazo robótico para grabar cuatro de referencia "X" marcas en los vértices de un cuadrado con dimensiones de 3,8 mm por 3,8 mm se centraron en la coverslide recubierto de oro con la función de grabado con punta de diamante unido al brazo robótico. (Representado en la figura 2B; proceso automatizado) NOTA: Esto asegura las cuatro marcas de referencia están dentro de un marco visual de la cámara hacia abajo. </li><li> El uso de los robots de herramientas de succión neumática, pick-up y sostienen el PDMS sello 1 mm por encima del accesorio de anidación sello como en la figura 2C. (Proceso automatizado) </li><li> Uso de la cámara que mira hacia arriba y anillo de iluminación LED en la foto en la Figura 2D y E, visualizar marcas de referencia la plaza de la estampillas e identificarlas con el software de la cámara 10 veces con el fin de determinar X promedio del sello, Y y angular desplazamiento desde el centro de la eje de mecanizado del robot. (Proceso automatizado) </li><li> Como en <strong figura utilizar la c que mira hacia abajo para visualizar y detectar marcas de referencia grabadas al agua fuerte coverslide veces determinar x promedio ubicaciones centros angular desplazamiento desde el centro del eje las herramientas robot. autom> NOTA: Un cálculo interno se lleva a cabo por el software del sistema robótico para alinear con precisión el cubreobjetos de X, Y y ubicaciones de los centros compensaciones angulares en los futuros pasos R-μCP de sello y. </li><li> 3.8) Coloque el sello en un baño de alcanotiol iniciador de ATRP, bromoisobutirato ω-mercaptoundecyl (2 mM en etanol) como se muestra en la Figura 2F. (Proceso automatizado) </li><li> Retire el sello de la solución alcanotiol y colóquelo sobre una corriente de nitrógeno presurizado a 0,48 bar (5 psi) para evaporar el etanol como en la figura 2G. Después de 1 min aumentar la presión de la corriente de nitrógeno es de 1,03 bar (15 psi) para asegurar la sequedad uniforme. (Proceso automatizado) NOTA: secado incompleta dará lugar a la pérdida total o parcial del patrón de fidelidad. </li><li> Después del secado, mover el sello sobre la posición del centro calculado de la diapositiva recubierto de oro y lo baja a 100 micras incrementos mientras se controla la fuerza del motor del eje Z como se representa en la figura 2H. NOTA: Este es comunicada como par experimentado por el motor del eje Z y que se muestra en el software de guiado de robots. (Proceso automatizado) </li><li> Detener la reducción del sello una vez que se ha alcanzado la presión predeterminada de 79,2 kPa, y mantener contacto con el portaobjetos recubierto de oro durante 15 s. (Proceso automatizado) NOTA: Los valores de la presión aquí están optimizados para la altura de diseño de sellos y función actual. Si el diseño del sello se cambia, específicamente para sellos de alta relación de aspecto, sintonizar estos en consecuencia de un proceso de ensayo y error. </li><li> Retire lentamente el sello de la diapositiva recubierto de oro y colocar el sello de nuevo en el partido de anidación sello. (Proceso automatizado) </li></ol> 4. SI-ATRP de PEGMEMA en micropatterned cubreobjetos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Suelte la presión de vacío que sostiene la coverslide microestructurada, y transferirla a un matraz Schlenk de 50 ml. Seal y desgasificar el matraz Schlenk utilizando una bomba de vacío. </li><li> Añadir 5,5 ml de mezcla de reacción que contiene el macromonómero ATRP PEGMEMA (208,75 mmol), agua (34,4 ml), metanol (43,8 ml), cobre (II) bromuro de (1 mmol), y 2 ', 2-bipiridina (3 mmol) de el matraz de Schlenk. </li><li> Añadir 0,5 ml de ascorbato L-sodio (454,3 mM) en agua para iniciar la reacción, y permita que se continúe durante 16 horas a temperatura ambiente en atmósfera de gas inerte. NOTA: Después de la adición de ascorbato L-sodio, color de la reacción se desplazará desde el verde claro al marrón oscuro, como se muestra en la Figura 3A-B. NOTA: La reacción puede continuar más allá de 16 horas, pero no va a aumentar de manera significativa la duración de los cepillos de PEG. </li></ol><imgalt src='"/' files ftp_upload></imgalt> Figura 3. Inicio de SI-ATRP. (A) Iniciación de la reacción y (B) posterior cambio de color después de la adición de ascorbato de L-sodio. Imagen (C) Microscopio de superficie coverslide microestructurada siguiente procedimiento SI-ATRP. Barra de escala 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Retire la coverslide microestructurada del matraz Schenk y enjuagar con etanol, agua, y etanol y se seca bajo una corriente suave de nitrógeno. NOTA: Después de SI-ATRP, modificaciones de la superficie debe ser visible para el ojo y puede ser fotografiado y analizado bajo un microscopio como en la Figura 3C. NOTA: Este es el método más simple para probar la precisión del ensayo, ya que evita la necesidad de inmunotinción los sustratos. </li></ol> 5. La funcionalización azida de Cadenas micropatterned PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque el coverslide microestructurada en un vial de 20 ml de reacción de vidrio. </li><li> Añadir 6 ml de N, N-dimetilformamida (DMF) que contiene 100 mM de azida de sodio al vial de reacción. Mantener esta reacción a 37 ° C durante 24 hr. NOTA: Manejar DMF sólo en una campana de humos química. Tenga precaución al pesando azida de sodio. </li><li> Al terminar, quitar el coverslide microestructurada del vial de reacción y enjuagar con etanol y después agua y se seca bajo una corriente de nitrógeno. </li></ol> 6. La pasivación de Cadenas bromo funcionalizado PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque coverslide micropatterned en 20 ml viales de reacción de vidrio. </li><li> Añadir 6 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) que contiene etanolamina 100 mM y trietilamina 300 mM al vial de reacción. Mantenga esta reacción a 40 ° C durante 24 horas. NOTA: Manejar DMSO, etanolamina, trietilamina y sólo en una campana de humos química. </li><li> Al finalizar eliminar el coversl microestructuradaide desde el vial de reacción, lavar con etanol y después agua y se seca bajo una corriente de nitrógeno. </li></ol> 7. R-μCP del anillo interiores y SI-ATRP de PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Llevar a cabo los pasos R-μCP como se describió anteriormente en los pasos 3.2 y 3.6 a 3.12, la sustitución de un sello de PDMS con 300 micras y 600 micras ID anillos OD que sobresale, de manera que los anillos con las características más pequeños se colocan en el interior de los anillos previamente micropatterned. NOTA: El umbral de presión para este sello es 132,0 kPa. Como se mencionó anteriormente, estos ajustes de presión están optimizados para las características de cupones se utilizan en este experimento. </li><li> Llevar a cabo los pasos SI-ATRP como se ha descrito anteriormente en los pasos 4.1 a 4.4. </li></ol> 8. El acetileno funcionalización de Cadenas micropatterned PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque coverslide microestructurada en un vial de 20 ml de reacción de vidrio. </li><li> Añadir 6 ml de DMSO que contiene 100 mMpropargilamina al vial de reacción. Mantener esta reacción a TA durante 24 h. NOTA: Manejar DMSO y propargilamina sólo en una campana de humos química. </li><li> Al finalizar eliminar el coverslide microestructurada del vial de reacción y enjuagar con etanol y después agua y se seca bajo una corriente de nitrógeno. </li></ol> 9. Cobre catalizada "Haga clic en" Biotinilación de acetileno Terminado Cadenas PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque coverslide microestructurada en un vial de 20 ml de reacción de vidrio. </li><li> Añadir 6 ml de sulfato de cobre (15 mM) / Tris [(1-bencil-1 H -1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v de agua / DMF) que contiene 562 mM de azida-PEG 4-biotina conjugado al vial de reacción. Añadir 1,2 ml de ácido L-ascórbico (0,15 mM) en agua a la mezcla para inicializar la reacción. </li><li> Burbujear nitrógeno a través de la solución de reacción durante 10 seg, sellar el vial con Parafilm, y hacer reaccionar durante 24 horas a RT. </li><li> Al completion eliminar coverslide microestructurada del vial de reacción, enjuague con agua y colocarlo en una placa de poliestireno de 12 pocillos. </li></ol> 10. Detección de inmunofluorescencia de Biotinylated acetileno Grupos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bloquear coverslide microestructurada en DPBS (3% burro suero) durante 1 hora a RT. Mancha para grupos de acetileno biotinilados con estreptavidina-546 conjugado (2 mg / ml) en los subproductos de desinfección (3% burro suero en PBS) durante 2 horas a RT. </li><li> Enjuague coverslide microestructurada 5 veces con DPBS durante 10 min con agitación suave. NOTA: La Figura 4B representa una imagen de la corredera después de que se ha completado este paso. </li></ol> 11. Cobre-libre "Haga clic en" Biotinilación de azida Terminado Cadenas PEGMEMA NOTA: Si se desea, esta etapa de modificación del sustrato se puede realizar in situ durante el cultivo celular. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Deja coverslide microestructurada en 12 pocillos pplato olystyrene siguiente DBPs enjuaga. </li><li> Añadir 2 ml de DBP (o medios de cultivo celular) que contiene 20 mM DBCO-PEG 4-biotina, y permitir que esta reacción continúe durante 24 horas a temperatura ambiente (oa 37 ° C en una incubadora). </li><li> Al terminar, enjuague coverslide microestructurada 5 veces con DPBS (o, simplemente, realizar un cambio de los medios de comunicación). </li></ol> 12. Detección de inmunofluorescencia de Biotinylated azida Grupos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mancha para grupos azida biotinilados con estreptavidina-488 conjugado (2 mg / ml) en 2 ml de DPBS (3% burro suero) durante 2 horas a RT. </li><li> Enjuague coverslide microestructurada 5 veces en DPBS durante 10 min con agitación suave. </li><li> Imagen micropatterned coverslide utilizando microscopio de fluorescencia confocal. Figura 4A-C representa las imágenes de la diapositiva después de que se complete este paso. NOTA: Cuando se utiliza sustratos para ensayos de cultivo de tejidos, omita las secciones 10 y 12 del presente protocolo. Después de la deseada degree de funcionalización, esterilizar el coverslide ingeniería enjuagando ambos lados con etanol al 100% y secado bajo una corriente de nitrógeno. Transferir el portaobjetos a una cabina de seguridad biológica estéril y enjuague el portaobjetos con PBS cinco veces antes de proceder a la siembra y cultivo de células. </li></ol>

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<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero contrapuesto.

Sustratos ideales para la ingeniería de tejidos se recapitulan Bioinspirada y por lo tanto la distribución espacial de los ligandos bioactivos críticos que se encuentran dentro de los tejidos nativos. Ellos también poseer propiedades dinámicas que permiten ajustes temporales de los ligandos y los patrones espaciales en el que se presentan para permitir la morfogénesis de tejidos dirigida y espacialmente restringidas inducción de destino de la célula. La fabricación de este tipo de sustratos requiere la inmovilización de...

La capacidad de las superficies injertados con PEG para mostrar ligandos bioquímicos covalentemente unidos, manteniendo al mismo tiempo inherentes propiedades no-fouling ellos una opción ideal para entornos de ingeniería de microescala personalizados sobre sustratos de cultivo 1,2,3 hacer. Las interacciones bioespecíficas mediados por ligando conjugado de PEG cepillos permite el análisis reduccionista de los efectos de señales bioquímicas que se encuentran dentro del complejo en microambientes de tejido in vivo en fenotipos de células individuales. Además, las químicas &quot;clic&quot; bio-ortogonales se pueden utilizar para facilitar la inmovilización de ligandos direccional de modo que se presentan en conformaciones nativas 4-6. Por lo tanto, el patrón espacial microescala de PEG cepillos es una herramienta versátil para crear diseñador en nichos vitro para investigar la señalización celular inducida por señales bioquímicas inmovilizados 6,7. Un método común para la generación de patrones espaciales de cu bioquímicaES conlleva sustratos recubiertas de oro (μCP) de impresión por microcontacto con patrones de PEG alcanotioles conjugados. Entonces, las monocapas auto-ensambladas (SAMs) micropatterned de alcanotioles ylated-PEG restringe la adsorción física de las moléculas bioquímicas, por ejemplo, proteínas, sólo para regiones no modelada del sustrato 8,9. Sin embargo, las SAMs generados por esta técnica son sensibles a la oxidación en medios de cultivo celular a largo plazo. Por lo tanto, μCP&#39;d alcanotiol SAMs son a menudo más injerta con cepillos de polímero de PEG mediante transferencia atómica iniciada por superficie polimerización radical (SI-ATRP) para aumentar la estabilidad 10 no ensuciamiento de la región. Específicamente, μCP del iniciador de polimerización alcanotiol, bromoisobutirato ω-meraptoundecyl, sobre superficies recubiertas de oro seguido por SI-ATRP de poli (etilenglicol) metacrilato de metilo éter (PEGMEMA) monómeros genera superficies con microestructurada a largo plazo, estable, y no ensuciamiento PEG cepillos. Además, estos<html> son capaces de ser modificados aún más para presentar restos diversa químicos 11. Aprovechando esta propiedad, Sha et. al. desarrollado un método para diseñar sustratos de cultivo con cepillos PEGMEMA multicomponentes que presentan ortogonales químicas &quot;clic&quot;. En este método, que utilizan una serie de pasos μCP / SI-ATRP intercalados con azida de sodio secuencial, etanolamina, y propargilamina sustituciones nucleófilas para crear sustratos de cultivo a microescala que presentan patrones de múltiples ligandos inmovilizados 6. Mientras que el potencial del uso de tales químicos en conjunción con μCP manual para diseñar nuevos sustratos de cultivo es inmenso, que está limitado por la precisión y la exactitud con la que múltiples pasos μCP se pueden alinear en un único sustrato. Un alto nivel de precisión y exactitud estaría obligado a fabricar de forma reproducible complejo en nichos in vitro utilizando estas técnicas versátiles. e_content &quot;&gt; Para hacer frente a esta limitación, se han generado varios sistemas automatizados μCP y semi-automatizado. Chakra et. al. desarrollado un sistema en el que μCP sellos personalizados se colocan en un sistema ferroviario y ponen en contacto conforme con diapositivas recubiertas de oro que utilizan un accionador neumático controlado por ordenador. Sin embargo, este método requiere la fabricación precisa de sello diseños personalizados e informa de una precisión de 10 micras con ningún informe de la precisión alcanzada cuando se realizan múltiples pasos μCP 12. Más recientemente, un método que utiliza un sistema de acoplamiento cinemático integrada precisión reportada por debajo de 1 m utilizando un único patrón, pero no fueron capaces de alinear con precisión múltiples patrones debido a la falta de un control preciso de las características sello de molde para moldear 13. Además, ambos de los métodos anteriores requieren el sustrato para permanecer fijo entre los pasos de modelado , lo que limita significativamente la diversidad de químicas de modificación de la superficie que pueden serutilizado. A continuación, describimos un sistema R-μCP automatizado capaz de alineamiento exacto y preciso de múltiples pasos μCP al tiempo que permite la máxima flexibilidad en el diseño del sello y de la fabricación. Además, los sustratos estructurados pueden eliminarse repetidamente desde el sistema entre estampados, permitiendo así el uso de diversas composiciones químicas de modificación de sustrato, incluyendo las sustituciones nucleófilas secuenciales. Sustratos de ingeniería uso de tales químicos han sido utilizados para el cultivo celular previamente por tanto nos 6,14 7 y otros. Por lo tanto, hemos fusionado R-μCP y reacciones de sustitución nucleófila secuenciales para desarrollar un método para la fabricación escalable de sustratos de cultivo con señales bioquímicas complejas y micropatterned.

<table><tbody><tr><td>SCARA&nbsp;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>Los modelos de gama alta con mayor precisión están disponibles si lo desea.</td></tr><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)triclorosilano</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>PRECAUCIÓN, Solo debe manipularse en una campana de gases químicos. Al silanizar obleas, nadie debe ingresar a la campana hasta que se haya evaporado todo el silano.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>Ellsworth Adhesive Co</td><td>NC9020938</td><td>Desgasifica las soluciones mediante exposición al vacío antes de su uso. Los kits alternativos como el Kit 182 son aceptables.</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm #1 Portaobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>48393106</td><td>Estos se pueden comprar de varios proveedores con diferentes dimensiones para satisfacer sus necesidades.</td></tr><tr><td>CHA-600 Evaporador de haz de electrones Telemark</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>Requiere formación especializada.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-mertcaptoundecyl bromoisobutirato</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>Almacenar a -20 &deg;C. Se pueden utilizar otros iniciadores ATRP como este R-&mu; La plataforma CP es aplicable a todas las modalidades de micropatrones.</td></tr><tr><td>Frasco de tubo Schlenk 50 ml</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>Requiere tapones de goma con diafragma.</td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol) metil éter metacrilato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>Enviado que contiene inhibidores léicos libres de MEHQ y BHT.</td></tr><tr><td>Metanol (Certificado ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>PRECAUCIÓN, solo mango en campana de gases químicos.</td></tr><tr><td>Bromuro de cobre (II)</td><td>Sigma Aldrich 437867</td><td></td><td>PRECAUCIÓN, limite la exposición con mascarilla quirúrgica.</td></tr><tr><td>2,2'-Bipiridina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>PRECAUCIÓN, limite la exposición con mascarilla quirúrgica.</td></tr><tr><td>L-ascorbato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml de borosilicato Vidrio Viales de centelleo</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>ATENCIÓN, limite la exposición con mascarilla quirúrgica.</td></tr><tr><td>N,N-dimetiformamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>PRECAUCIÓN, solo manéjelo en la campana de gases químicos.</td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>PRECAUCIÓN, solo se maneja en campana de gases químicos.</td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>PRECAUCIÓN, solo maneje en campana de gases químicos.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td>Aldrich</td><td>276855</td><td>PRECAUCIÓN, solo manéjelo en la campana de gases químicos.</td></tr><tr><td>Propargiramina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>PRECAUCIÓN, solo mango en campana de gases químicos.</td></tr><tr><td>Etanol de 200 grados</td><td>Servicios de distribución de materiales de la Universidad de Wisconsin</td><td>2292</td><td>PRECAUCIÓN, solo manéjelo en la campana de gases químicos.</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotina</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>Solubilizado en DMF</td></tr><tr><td>Sulfato de Cobre (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>PRECAUCIÓN, limite la exposición con mascarilla quirúrgica.</td></tr><tr><td>Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr> ácido <tr><td>L-ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato Suero salino</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Burro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td> Los <td>artículos contaminados con suero de burro se consideran material biopeligroso y deben eliminarse en consecuencia. Varios otros compuestos ( por ejemplo, BSA) están disponibles y sirven para este propósito.</td></tr><tr><td>Placa de poliestireno de 12 pocillos</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>Las placas se pueden comprar a varios proveedores con diferentes dimensiones.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-Biotina</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>Solubilizado en DMF</td></tr><tr><td>Estreptavidina, Alexa Fluor 488 Conjugado</td><td>Life Technologies</td><td>S-11223</td><td>Solubilizado en PBS</td></tr><tr><td>Estreptavidina, Alexa Fluor 546 conjugado</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>Solubilizado en PBS</td></tr><tr><td>Nikon A1-R Microscopio Confocal</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti, A1R</td><td>Un microscopio epifluorescente es suficiente para obtener imágenes de sustratos micropatrones funcionalizados.</td></tr></tbody></table>

la fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (r-μcp) y secuencial sustitución nucleófila

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

En ingeniería de tejidos, es deseable exhibir un control espacial de la morfología del tejido y el destino celular en cultivo a escala de micras. Los sustratos de cultivo que presentan cepillos de poli(etilenglicol) (PEG) injertados se pueden utilizar para lograr esta tarea mediante la creación de regiones a microescala, sin incrustaciones y resistentes a la adhesión celular, así como regiones donde las células participan en interacciones bioespecíficas con ligandos anclados covalentemente. Para diseñar tejidos complejos utilizando tales sustratos, será necesario modelar secuencialmente múltiples cepillos de PEG funcionalizados para conferir bioactividades diferenciales y alineados en orientaciones a microescala que imitan nichos in vivo. La impresión por microcontacto (μCP) es una técnica versátil para modelar este tipo de pinceles de PEG injertados, pero la μCP manual no se puede realizar con precisión a microescala. Por lo tanto, combinamos la robótica avanzada con técnicas de litografía blanda y reacciones químicas de superficie emergentes para desarrollar un método asistido por impresión robótica por microcontacto (R-μCP) para fabricar sustratos de cultivo con patrones complejos, a microescala y altamente ordenados de cepillos PEG que presentan químicas ortogonales de "clic". Aquí, describimos en detalle el flujo de trabajo para fabricar dichos sustratos.

El uso de técnicas μCP alineación manuales para diseñar sustratos de cultivo con matrices de cepillos injertados con PEG funcionalizados con ortogonal "clic" químicas se ha demostrado en trabajos previos 6. Sin embargo, esto ofrece un control mínimo de la orientación de patrón y, a menudo resulta en superposición de áreas funcionalizados. Aquí, un novedoso sistema R-μCP se utiliza para superar esta limitación, y su capacidad de precisión patrón de una matriz de PEG cepillo de anillos con 300 micras y 600 micr...

Los sustratos de cultivo celular funcionalizados con patrones a microescala de ligandos biológicos tienen una inmensa utilidad en el campo de la ingeniería de tejidos. Aquí, demostramos la fabricación versátil y automatizada de sustratos de cultivo de tejidos con múltiples cepillos de poli(etilenglicol) micromodelados que presentan químicas ortogonales que permiten la inmovilización espacialmente precisa y específica del sitio de ligandos biológicos.

La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

El objetivo general del siguiente experimento es generar sustratos de cultivo de tejidos con múltiples cepillos PEG de micropatrones, que presenten químicas ortogonales que permitan la inmovilización de ligandos biológicos espacialmente precisa y específica del sitio. Esto se logra mediante matrices de deposición de acan tiol, un iniciador TRP mediante una impresión robótica de microcontacto sobre sustratos recubiertos de oro. Como segundo paso SI, se realiza un TRP en los sustratos de micro patrones, lo que genera cepillos PEG con grupos de bromo terminales.A continuación, los grupos de bromo terminal se funcionalizan con uno o dos grupos reactivos químicos para permitir la movilización IM de ligandos biológicos adecuadamente preparados. A continuación, se repite todo el proceso para funcionalizarlo con un segundo grupo químico. Los resultados muestran microarrays de dos pinceles PEG funcionalizados ortogonalmente superpuestos con una precisión de 10 micras.Esto se verifica utilizando un software de análisis de imágenes personalizado después de la conjugación de los grupos reactivos con moléculas fluorescentes. La principal ventaja de esta técnica sobre métodos como la impresión manual por microcontacto es que la impresión robótica por microcontacto es capaz de superponer múltiples pasos de impresión con una precisión de micras, al tiempo que permite la máxima flexibilidad y diseño del sustrato. La precisión que ofrece este método, junto con las reacciones secuenciales de sustitución nucleofílica, nos permite generar sustratos de cultivo de tejidos que se funcionalizan con múltiples ligandos biológicos que luego son capaces de ejercer un control temporal y espacial del sulfato a escala micrométrica.Antes de S-I-A-T-R-P, una diapositiva de cubierta recubierta de oro debería haber sido modelada con el sello A-P-D-M-S. Este procedimiento relativamente común se explica en un protocolo de texto. Comience quitando la corredera de la cubierta de patente del robot soltando la aspiradora.Luego transfiéralo a un matraz de 50 mililitros de longitud, selle el matraz y aplique una aspiradora negativa de 30 PSI. A continuación, añada 5,5 mililitros de la mezcla de reacción A TRP en el matraz con una jeringa y, a continuación, añada 0,5 mililitros de L de ascorbato sódico en agua también con una jeringa. Observe cómo la reacción cambia de color de verde claro a marrón oscuro.Deje que la reacción continúe durante 16 horas bajo gas inerte. Cuando se complete la reacción, retire la corredera de la cubierta y enjuáguela con etanol, luego con agua y luego con etanol nuevamente. A continuación, sécalo suavemente con nitrógeno.El microarray de pinceles P-E-G-M-E-M-A injertados debe ser visible a simple vista. Utilice la microscopía para revelar estos cambios en detalle para funcionalizar las cadenas P-E-G-M-E-M-A. Transfiera el portaobjetos de la cubierta del patrón a un vial de reacción de vidrio de 20 mililitros y agregue seis mililitros de DMF que contenga 100 milimolares de azida de sodio.Deje que la reacción dure 24 horas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, enjuague el portaobjetos de la cubierta de patente con etanol y séquelo bajo un suave chorro de nitrógeno para pacificar las cadenas P-E-G-M-E-M-A funcionalizadas con bromo restantes. Transfiera el portaobjetos de la cubierta del micropatrón a un vial de reacción de vidrio de 20 mililitros y agregue seis mililitros de DMSO que contenga 100 milimolares de etanol amina y 300 milimolares de trietilamina.Permita que esta reacción continúe durante 24 horas a 40 grados centígrados al día siguiente. Enjuague el portaobjetos de la cubierta del patrón con etanol y séquelo suavemente bajo un chorro de nitrógeno. El siguiente paso es repetir la impresión por microcontacto del robot utilizando un segundo sello PDMS y luego estampar.Utilice SI A TRP de nuevo para graficar el segundo pincel PEG de micro array. Entonces es el momento de funcionalizar el acetileno de la segunda micro matriz P-E-G-M-E-A cadenas Francois. La cubierta del micro patrón.Deslice en un vial de reacción de vidrio de 20 mililitros con seis mililitros de propag amina molar de 100 mililitros en DMF. Deje que la reacción continúe durante 24 horas. Al día siguiente, a temperatura ambiente, enjuague el portaobjetos de la cubierta de patente con etanol y séquelo con un suave chorro de nitrógeno.A continuación, la diapositiva de la cubierta de la patente está lista para la fermentación con biotina. Comience colocando el portaobjetos de la cubierta de micro patente en un vial de reacción de vidrio de 20 mililitros. Primero, la biotina se comió las cadenas terminadas en acetileno.Agregue seis mililitros de sulfato de cobre con el conjugado de biotina PEG four azida al vial de reacción, seguido de 1,2 mililitros de 0,15. Ácido rbico milimolar en agua para iniciar la reacción, burbujee la reacción con nitrógeno durante 10 segundos. A continuación, selle el vial con paraform y deje actuar durante 24 horas.Al día siguiente, a temperatura ambiente, enjuague el portaobjetos de la cubierta con agua y transfiéralo a un plato de poliestireno de 12 pocillos. Luego, a temperatura ambiente en DPBS con suero de burro durante una hora, una hora más tarde, tinción en los grupos elurados con biotina con estreptococo DEIN 5 46 conjugado a dos microgramos por mililitro en tinción de DPBS durante dos horas a temperatura ambiente dos horas después. Enjuague el portaobjetos de cubierta en DPBS cinco veces con vegetación suave.Tobi ITIN aate las cadenas terminadas azi. Coloque el cubreobjetos en un pocillo de una placa de poliestireno de seis pocillos y aplique dos mililitros de DPBS que contengan 20 micromolares D-B-C-O-P-G cuatro biotina. A continuación, incube el portaobjetos de cubierta durante 24 horas a temperatura ambiente y 24 horas después.Enjuague el portaobjetos de la cubierta como antes del cuatro y tíñelo con estreptavidina 4 88. Conjugado a dos microgramos por mililitro en DPBS. Dos horas después.Enjuague el portaobjetos de la cubierta nuevamente y luego obtenga imágenes con microscopía. Utilizando este protocolo de impresión de micro contacto robotizado. Un patrón preciso de la interfaz de usuario de ANN del cepillo PEG con grupos de alkin terminales se modeló dentro de un arreglo separado de la interfaz de usuario de ANN del cepillo PEG más grande con grupos azi terminales.La distribución espacial de los grupos azida y alkin se observó utilizando la química de clic y la unión a estreptavidina de sondas fluorescentes. Una superposición de ambos canales fluorescentes muestra cómo los sellos no se superponen. Se calculó que la precisión de la alineación era inferior a 10 micras, que está en los límites del SCAR.Un sistema utilizado para hacer la impresión. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo generar sustratos de cultivo de tejidos personalizados mediante la impresión robótica de microcontacto para superponer varias matrices de cepillos de clavijas. Funcionalizado con químicas ortogonales.

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La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila (Video) | JoVE Journal

La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila

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